專利名稱：新型血吸蟲疫苗肽(二)的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于有機化合物。
目前對血吸蟲疫苗的研究主要集中在照射減毒活疫苗和可溶性抗原疫苗兩方面。照射減毒活疫苗的研究歷史較長，在制備和應用方面已積累了較成熟的經(jīng)驗，在實驗室和動物實驗上已取得了較好結果。但該種疫苗還存在以下有待解決的問題，(1)大量注射引起的局部炎癥，(2)疫苗的安全性，如過敏反應，(3)疫苗的致病性，如滅活不完全造成的感染，(4)大規(guī)模制備疫苗時蟲子的來源不足。為了避免上述缺點，人們正在積極從事合成的可溶性抗原疫苗的研究，此種疫苗的重要意義在于，可以采用人工大量合成，經(jīng)人工合成的疫苗接種量小，可以減少異種蛋白的過敏反應，并可大量制備，且無滅活不完全造成的致病危險，有實際應用前景。已有技術，如中國專利，申請?zhí)?4105038.6，給出了一種可用于制備血吸蟲疫苗的肽。
本發(fā)明的目的在于提供了另一種可用于制備血吸蟲多價疫苗的多肽，其優(yōu)點在于用其制成的多價疫苗接種量小，且對多種血吸蟲有免疫作用，可以減少異種蛋白的過敏反應，無滅活不完全造成的致病危險，并可以采用人工大量合成。
本發(fā)明所涉及的有機化合物-多肽，即是血吸蟲可溶性抗原疫苗多肽，其特征在于化學結構如下所示 在上式中A為氫，C1-12烷基，C2-12烯基和炔基，苯基或C7-10苯烷基或RCO-形式的基團。在這里(ⅰ)R是氫，C1-11烷基，C2-11烯基和炔基，苯基或C7-10苯烷基。
(ⅱ)RCO還可以是(a)天然的氨基酸殘基，也可以是相應的D-構型氨基酸殘基。
(b)一個二，三，四肽殘基，其氨基酸殘基可以是相同的也可以是不同的，其所用氨基酸殘基如(a)中定義。
(ⅲ)RCO還可以是(a)天然的四，五，六碳糖酸殘基。
(b)一個二，三，四寡糖殘基，其單糖可以是相同的，也可以是不同的，其所用單糖殘基為天然單糖殘基，但與肽連接的單糖殘基為糖酸殘基。
A′為氫，或當A為C1-12烷基，C2-12烯基和炔基，苯基或C7-10苯烷基時，也為C1-12烷基，C2-12烯基和炔基，苯基或C7-10苯烷基。
B為-Lys-，-Arg-，-Thr-，-Ser-，-Glu-，-Asp-.
C為-Arg-，-His-，-Glu-，-Asp-.
D為-Leu-，-Ala-，-Arg-.
E為-Asn-，-Glu-，-Asp-，-Gln-，-Thr-，-Ser-.
F為-Asp-，-Asn-，-Glu，-Gln-.
G為-Asp-，-Glu-，-Asn，-Gln-.
H為-Gly-，-Ile-，-Pro-，-Trp-.
X可以為下列形式 在這里R1是氫，C1-3的烴基，天然的四，五，六碳單糖或二，三，四寡糖，其單糖可以是相同的，也可以是不同的，其所用單糖殘基為天然的四，五，六碳單糖殘基。
R2是氫，或是生理可接受的，并在生理條件下可水解的酯基。
R3和R4是氫，C1-3烴基，苯基，芐基，C9-10苯烴基?；騌3是氫，R4為天然的氨基酸殘基，也可以是相應的D-構型氨基酸殘基。R4也可以是一個二至七肽殘基，其氨基酸殘基可以是相同的，也可以是不同的，其所用氨基酸殘基為天然的氨基酸殘基或相應的D-構型氨基酸殘基。R4還可以是天然的四，五，六碳糖殘基，也還可以是一個二，三，四寡糖殘基，其單糖可以是相同的，也可以是不同的，其所用單糖殘基為天然的四，五，六碳單糖殘基。
本發(fā)明涉及的多肽可以以其自由形式存在，也可以以鹽的形式或復合物的形式存在。例如可以和有機酸，高聚物酸和無機酸形成鹽，這種形式的鹽如鹽酸鹽，乙酸鹽。再如，可以和無機物，如無機鹽或氫氧化物，形成象Ca2+或Zn2+鹽。也可以和高聚有機物形成復合物，以及和藥物可以接受的稀釋劑和載體(如藥物可以接受的蛋白載體)形成的復合物。
本發(fā)明涉及的多肽可以用已知的多肽化學方法來合成及生產(chǎn)，如下述實施例，并且也可用與本實施例明顯等價的化學合成方法，溶液法或固相合成法(包括叔丁氧羰基保護法和芴甲氧羰基保護法)來合成及生產(chǎn)。
本發(fā)明涉及的多肽及其藥物可以接受的鹽和復合物在生物活性檢測和動物實驗中表明均有有價值的藥物活性。特別是在抗血吸蟲病方面，通過免疫小鼠實驗表明有很高的減蟲率。本發(fā)明涉及的多肽在動物實驗中的用量范圍為0.001到1000μg/kg體重。
實施例11.Boc-Asp(OBzl)-OCH2-Resin的制備1.1.Boc-Asp(OBzl)-OCs的制備2.016g(6.24mmole)Boc-Asp(OBzl)-OH溶于40mL乙醇和8mL水中，攪拌溶解，加入1.017g(3.12mmole)Cs2CO3，攪拌至反應完，減壓抽干，加入4×20mL干燥苯，減壓抽干以除去水。放入含五氧化二磷的真空干燥器中干燥過夜，得白色銫鹽。
1.2.Boc-Asp(OBzl)-OCH2-Resin的制備將上述制得的銫鹽溶于10mL精制過的DMF中，加入3.0g(含氯量為3.12mmole)氯甲基樹脂，在保持干燥狀態(tài)下，于80℃適度攪拌反應24小時，過濾抽干，依次用3×10mL DMF，3×10mL DMF/H2O(9∶1)，3×10mL DMF，3×10mL無水EtOH洗滌，抽干，放入含五氧化二磷的真空干燥器中干燥過夜，得白色Boc-Asp(OBzl)-OCH2-Resin。
1.3.Boc-Asp(OBzl)-OCH2-Resin的封氯向上述Boc-Asp(OBzl)-OCH2-Resin中加入2.558g(31.2mmole)無水乙酸鈉，30mL精制過的DMF，在70℃適度攪拌反應24小時，過濾抽干，依次用2×10mL DMF，2×10mL DMF/H2O(9∶1)，2×10mL DMF，2×10mL無水EtOH洗滌，抽干，放入含五氧化二磷的真空干燥器中干燥過夜，得白色封好氯的Boc-Asp(OBzl)-OCH2-Resin。
1.4.Boc-Asp(OBzl)-OCH2-Resin的封羥基向上述封好氯的Boc-Asp(OBzl)-OCH2-Resin中加入10mL(0.105mole)重蒸過的乙酸酐，20mL(0.25mole)處理過的無水無氨吡啶，20mL干燥苯，室溫適度攪拌反應24小時，過濾抽干，依次用4×50mL DCM，3×10mL無水MeOH洗滌，抽干，放入含五氧化二磷的真空干燥器中干燥過夜，得白色封好氯和羥基的Boc-Asp(OBzl)-OCH2-Resin。
經(jīng)茚三酮檢測氨基含量為0.94mmole/g樹脂。
2.Boc-Gly-Asp(OBzl)-OCH2-Resin的制備1.5g(氨基含量為1.41mmole)封好氯和羥基的Boc-Asp(OBzl)-OCH2-Resin加入15mL DCM溶漲5分鐘，抽干。
2.1.脫保護向上述樹脂中加入15mL TFA/DCM(3∶7)，搖攪30分鐘，抽干，依次用10mLDCM，10mL MeOH各洗三次，抽干。
2.2.中和加入10mL TEA/DCM(1∶9)，搖攪5分鐘，抽干，再加入10mLTEA/DCM(1∶9)，搖攪10分鐘，抽干，用10mLDCM洗三次，抽干。
2.3.偶聯(lián)加入0.525g(3mmlole)Boc-Gly，0.608g(4.5mmole)HOBt，0.727g(4.5mmole)DCC，15mL，DMF，搖攪反應6小時，抽干，10mL DMF洗三次，10mL MeOH洗三次，10mLDCM洗三次，抽干。
2.4.檢測取少許樹脂加入試管中，加入茚三酮試劑1，2和3各3滴，105℃加熱5分鐘。若為淡黃色，說明偶聯(lián)反應完全，可以進行下一步反應;若為藍色或棕紅色，說明偶聯(lián)反應不完全，按2.2中和后，重新進行2.3偶聯(lián)反應，但可根據(jù)反應具體情況減少投料。
按上述方法依次接下列氨基酸Boc-Asp(OBzl)，Boc-Asn，Boc-Arg(Tos)，Boc-Asp(OBzl)，Boc-Tyr(OBzl)，Boc-Leu，Boc-Arg(Tos)，Boc-Glu(OBzl)，Boc-Glu(OBzl)，Boc-Tyr(OBzl)，Boc-Arg(Tos)，Boc-Glu(OBzl)。
當前一個氨基酸為Pro，Gln和Asn時，由于在茚三酮試劑檢測時其本身為黃色，所以可不檢測，但為了保證偶聯(lián)反應完全，應重新偶聯(lián)1-2次。當所用氨基酸有Tos為側連保護基時，把HOBt改為HOSu，以免HOBt的堿性把Tos保護基脫掉。在接上Trp后，脫出Boc保護時應在TFA/DCM中加入幾滴苯甲硫醚和乙二硫醇。
最后得到聯(lián)在樹脂上的側連保護肽Glu(OBzl)-Arg(Tos)-Tyr(OBzl)-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Arg(Tos)-Leu-Tyr(OBzl)-Asp(OBzl)-Arg(Tos)-Asn-Asp(OBzl)-Gly-Asp(OBzl)-Resin。
附茚三酮檢測試劑(1).茚三酮試劑1，1mL 0.001N KCN+40mL吡啶;
(2).茚三酮試劑2，40gB苯酚+10mL無水乙醇;
(3).茚三酮試劑3，2g水合茚三酮+40mL無水乙醇。
3.H-Glu-Arg-Tyr-Glu-Glu-Arg-Leu-Tyr-Asp-Arg-Asn-Asp(OBzl)-Gly-Asp-OH在聚四氟乙烯肽脫保護裝置中進行脫保護，向反應器中加入Glu(OBzl)-Arg(Tos)-Tyr(OBzl)-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Arg(Tos)-Leu-Tyr(OBzl)-Asp(OBzl)-Arg(Tos)-Asn-Asp(OBzl)-Gly-Asp(OBzl)-Resin，0.5mL苯甲醚，0.5mL苯甲硫醚和0.5mL乙二硫醇，在冰水浴冷卻下放入10-15mL經(jīng)無水三氟化鈷干燥過的氟化氫，攪拌反應45分鐘，減壓抽干，用冷無水乙醚洗滌，得樹脂及黏稠物，10%乙酸溶液溶解，過濾去掉殘渣，冷凍干燥得干粉，以5%乙酸為洗脫劑在SephadexG-15柱上純化，純化兩次，冷凍干燥得固體1.80g，收率72%，[α]18D＝-46.5°(C＝0.2，20%乙酸溶液)。產(chǎn)品肽純度由HPLC和氨基酸組成分析確定。
下列多肽也可以用實施例1中給出的相似方法來合成和生產(chǎn)，H-A-Glu-B-Tyr-Glu-Glu-C-D-Tyr-E-Arg-F-G-H-Asp-X-OH實施例編號縮寫詞語表Ala丙氨酸Arg精氨酸Asn天冬酰胺Asp天冬氨酸Boc叔丁氧羰基
Bzl芐基Cbz芐氧羰基DCCN，N′-二環(huán)己基碳二亞胺DCM二氯甲烷DMFN，N-二甲基甲酰胺EtOH乙醇Gln谷氨酰胺Glu谷氨酸Gly甘氨酸His組氨酸HOAc醋酸HOBt1-羥基苯并三氮唑HOSuN-羥基琥珀酰亞胺HPLC高壓液相色譜Ile異亮氨酸Leu亮氨酸Lys賴氨酸MeOH甲醇Phe苯丙氨酸Pro脯氨酸Ser絲氨酸Thr蘇氨酸Tos對甲苯磺?；鵗rp色氨酸Tyr酪氨酸
權利要求
1.本發(fā)明涉及一種有機化合物--多肽，其特征在于化學結構如下式所示 在上式中A為氫，C1-12烷基，C2-12烯基和炔基，苯基或C7-10苯烷基或RCO-形式的基團。在這里(i)R是氫，C1-11烷基，C2-11烯基和炔基，苯基或C7-10苯烷基。(ii)RCO還可以是(a)天然的氨基酸殘基，也可以是相應的D-構型氨基酸殘基。(b)一個二，三肽殘基，其兩個氨基酸殘基可以是相同的，也可以是不同的，其所用氨基酸殘基如(a)中定義。(iii)RCO還可以是(a)天然的四，五，六碳糖酸殘基。(b)一個二，三，四寡糖殘基，其單糖可以是相同的，也可以是不同的，其所用單糖殘基為天然單糖殘基，但與肽連接的單糖殘基為糖酸殘基。A′為氫，或當A為C1-12烷基，C2-12烯基和炔基，苯基或C7-10苯烷基時，也為C1-12烷基，C2-12烯基和炔基，苯基或C7-10苯烷基。B為-Lys-，-Arg-，-Thr-，-Ser-，C為-Arg-，-His-，D為-Leu-，-Ala-，-Ile-，E為-Asn-，-Glu-，-Asp-，-Gln-，F(xiàn)為-Asp-，-Asn-，-Glu-，-Gln-，G為-Asp-，-Glu-，-Asn-，-Gln-，H為-Gly-，-Ile-，-Pro-，X可以為下列形式 在這里R1是氫，C1-3的烴基，天然的四，五，六碳單糖或二，三，四寡糖，其單糖可以是相同的，也可以是不同的，其所用單糖殘基為天然的四，五，六碳單糖殘基。R2是氫，或是生理可接受的，并在生理條件下可水解的酯基。R3和R4是氫，C1-3烴基，苯基，芐基，C9-10苯烴基?；騌3是氫，R4為天然的氨基酸殘基，也可以是相應的D-構型氨基酸殘基。R4也可以是一個二至七肽殘基，其氨基酸殘基可以是相同的，也可以是不同的，其所用氨基酸殘基為天然的氨基酸殘基或相應的D-構型氨基酸殘基。R4還可以是天然的四，五，六碳糖殘基，也還可以是一個二，三，四寡糖殘基，其單糖可以是相同的，也可以是不同的，其所用單糖殘基為天然的四，五，六碳單糖殘基。
2.如權力要求1中所述的化合物，其特征在于R3是氫，C1-3烷基和苯基。
3.如權力要求1中所述的化合物，其特征在于A是一個RCO形式的基團。(ⅰ)R是C1-11烷基，苯基或C7-10苯烷基或。(ⅱ)RCO是(a)天然的氨基酸殘基。(b)一個二，三，四肽殘基，其氨基酸殘基可以是相同的，也可以是不同的，但均為天然氨基酸殘基。A′為氫。X是下列形式的基團 R3和R4是氫，C1-3烴基，苯基，芐基，C9-10苯烴基?；騌3是氫，R4為天然的氨基酸殘基，也可以是相應的D-構型氨基酸殘基。R4也可以是一個二至七肽殘基，其氨基酸殘基可以是相同的，也可以是不同的，其所用氨基酸殘基為天然的氨基酸殘基或相應的D-構型氨基酸殘基。R4還可以是天然的四，五，六碳糖殘基，也還可以是一個二，三，四寡糖殘基，其單糖可以是相同的，也可以是不同的，其所用單糖殘基為天然四，五，六碳單糖殘基。
4.如權力要求1中所述的化合物，其特征在于，B為-Arg-.C為-Arg-.D為-Leu-.E為-Asp-.F為-Asn-.G為-Asp-.H為-Gly-.
5.如權力要求1中所述的化合物，其特征在于，B為-Lys-.C為-His-.D為-Leu-.E為-Glu-.F為-Asp-.G為-Glu-.H為-Gly-.
6.如權力要求1中所述的化合物，其特征在于，B為-Thr-.C為-Arg-.D為-Ala-.E為-Asp-.F為-Asn-.G為-Glu-.H為-Ile-.
7.如權力要求1中所述的化合物，其特征在于，B為-Arg-.C為-Arg-.D為-Leu-.E為-Asp-.F為-Asn-.G為-Asp-.H為-Gly-.
8.如權力要求1中所述的化合物，其特征在于見下式H-Glu-Arg-Tyr-Glu-Glu-Arg-Leu-Tyr-Asp-Arg-Asn-Asp-Gly-Asp-OH或其鹽的形式，或其復和物的形式。
9.如權力要求1中所述的化合物，其特征在于由基團組成中選出，見下式H-His-Leu-Glu-Glu-Thr-Tyr-Glu-Glu-Arg-Ala-Tyr-Asp-Arg-Asn-Asp-Ile-Asp-OHH-Tyr-Leu-Glu-Glu-Lys-Tyr-Glu-Glu-His-Leu-Tyr-Glu-Arg-Asp-Asp-Gly-Asp-OHH-Tyr-Leu-Glu-Glu-Lys-Tyr-Glu-Glu-His-Leu-Tyr-Glu-Arg-Asp-Asp-Gly-Asp-Lys-Trp-Arg-Asn-Lys-Lys-Phe-OHH-His-Leu-Glu-Glu-Glu-Tyr-Glu-Glu-Glu-Arg-Tyr-Glu-Arg-Gln-Asp-Trp-Asp-OHH-Tyr-Leu-Glu-Glu-Asp-Tyr-Glu-Glu-Glu-Arg-Tyr-Ser-Arg-Gln-Asp-Trp-Asp-OH或其鹽的形式，或其復和物的形式。
10.權力要求1中要求保護的多肽，或其藥物可以接受的鹽的形式或復合物的形式，及其與藥物可以接受的稀釋劑和載體一起使用所形成的復合物。特別是對治療和預防血吸蟲病有作用的藥物，尤其是用其制成的抗血吸蟲病的疫苗類藥物。
全文摘要
本發(fā)明屬于有機化合物。具有下列基本序列的多肽X-Glu-Y-Tyr-Glu-Glu-Z-Tyr-U-Arg-V-Asp-W此式中X，Y，Z，U，V，W均為氨基酸殘基，該肽對血吸蟲病有保護性免疫作用，可用于制備抗血吸蟲病的疫苗類藥物。
文檔編號A61K38/10GK1112930SQ9410597
公開日1995年12月6日 申請日期1994年6月8日 優(yōu)先權日1994年6月8日
發(fā)明者許家喜, 蔡孟深 申請人:北京醫(yī)科大學