專利名稱：冬凌草甲素在制備fbw7抑癌蛋白激活劑中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥和生化與細胞生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及冬凌草甲素在制藥和臨床治療中用于制備激活抑癌蛋白FBW7和靶向泛素化降解癌蛋白c-Myc、cyclin E和mTOR 等的抗腫瘤藥物；以及在基礎(chǔ)研究中作為激活FBW7和干預(yù)其底物蛋白表達(包括c-Myc、 cyclin E和mTOR等)的細胞誘導(dǎo)劑，為研究以上蛋白的生物學(xué)功能提供方法和手段。
背景技術(shù)：
腫瘤尤其是惡性腫瘤是威脅人類健康的一大疾病，腫瘤治療是當今人類面臨的一大醫(yī)學(xué)難題。隨著科學(xué)的不斷發(fā)展，專業(yè)人士對腫瘤的發(fā)病原因進行了深入的研討，基因致癌的機理慢慢清晰起來。腫瘤治療的技術(shù)不再停留在部位和器官形態(tài)學(xué)水平，靶向癌基因和抑癌基因的分子靶向治療技術(shù)技術(shù)逐漸興起，并在醫(yī)學(xué)臨床應(yīng)用中取得很好的療效。利用真核細胞內(nèi)泛素一蛋白酶體途徑特異性降解蛋白質(zhì)原理發(fā)展而來的靶向泛素化降解蛋白質(zhì)技術(shù)，可通過激活人體內(nèi)源泛素連接酶(E3)或人工合成E3酶，特異性敲除某種或某幾種選定的癌蛋白底物，成為腫瘤分子靶向治療中的新技術(shù)并在基礎(chǔ)研究和臨床醫(yī)學(xué)中發(fā)揮重要作用。FBW7 (F-box and WD repeat domain-containing 7)是一種重要的抑癌蛋白，它是SCFfbw7泛素連接酶復(fù)合物中識別與結(jié)合底物的關(guān)鍵組分。它的底物蛋白包含了 cyclin E、c-Myc、Notch、c-Jun、c-myb、SREBP、presenilin、mTOR、Aurora A 以及 Mcl-I 等，其中多數(shù)底物蛋白具有癌基因的功能。由FBW7所介導(dǎo)的底物癌蛋白的泛素化降解對于細胞的周期進行和正常生理狀態(tài)的維持等方面起了巨大的作用。例如(1)當細胞通過S期時，cyclin E蛋白會被FBW7介導(dǎo)的泛素化途徑降解，以避免在細胞有絲分裂前出現(xiàn)重復(fù)的DNA復(fù)制和額外的中心體擴增。這種調(diào)節(jié)是至關(guān)重要的，調(diào)節(jié)失衡會導(dǎo)致cyclin E相關(guān)的染色體不穩(wěn)定和腫瘤的發(fā)生；(2)FBW7的另一個底物蛋白一c-Myc是一種轉(zhuǎn)錄因子，它在細胞的有絲分裂和生長過程中具有重要作用。在細胞中，一旦c-Myc的泛素化降解途徑受阻，會使c-Myc 蛋白異常累積，活化轉(zhuǎn)錄，從而使細胞脫離正常生長調(diào)節(jié)的限制而處于高度增生狀態(tài)，并開始向惡性表型轉(zhuǎn)化。同時，高水平的c-Myc還會抑制細胞的分化，其誘導(dǎo)細胞凋亡的作用也遭到破壞，而促進腫瘤的形成。在多數(shù)腫瘤中，F(xiàn)BW7由于各種原因而低表達或突變，其作為腫瘤抑制基因的功能被大大削弱，導(dǎo)致cyclin E、c-Myc等癌蛋白的累積以及細胞內(nèi)平衡的紊亂和腫瘤的進一步發(fā)展。在膽管癌、T細胞急性淋巴白血病、結(jié)腸癌、子宮內(nèi)膜癌以及胃癌中，F(xiàn)BW7突變的頻率分別為35%、31%、9%、9%、6%，而且這些突變中約43%為無義突變。因此，對于正常細胞而言，通過FBW7介導(dǎo)的泛素-蛋白酶體途徑維持各種周期蛋白及原癌蛋白的動態(tài)平衡是至關(guān)重要的；而在癌細胞中，通過激活FBW7介導(dǎo)的泛素-蛋白酶體途徑促進各種癌蛋白的降解對于逆轉(zhuǎn)細胞惡性程度、改善腫瘤治療療效也具有重要的意義。以往腫瘤分子靶向治療中對癌基因的調(diào)控，常采用沉默表達的方法。沉默表達多在DNA或RNA水平上進行，如反義脫氧寡核苷酸技術(shù)和RNA干擾技術(shù)等。通過激活FBW7而靶向泛素化降解癌蛋白的技術(shù)可在翻譯后水平靶向降解目的蛋白，具有反應(yīng)迅速、靈活性好、操作簡便、經(jīng)濟實用等優(yōu)點。但是迄今為止，還沒有發(fā)現(xiàn)任何能夠激活FBW7的藥物和技術(shù)手段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)中的上述不足，提供冬凌草甲素在制備FBW7抑癌蛋白激活劑中的應(yīng)用，以及具有環(huán)外亞甲基環(huán)戊酮結(jié)構(gòu)的四環(huán)二萜類化合物在制備FBW7 抑癌蛋白激活劑中的應(yīng)用。冬凌草甲素是一種四環(huán)二萜類化合物，其抗癌活性中心為環(huán)外亞甲基環(huán)戊酮結(jié)構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn)，如果環(huán)外雙鍵變成飽和鍵或裂環(huán)，則抗癌活性消失。以上應(yīng)用所述FBW7抑癌蛋白為FBW7 α、FBW7 β和/或FBW7 γ。申請人:經(jīng)過大量研究發(fā)現(xiàn)，冬凌草甲素能夠激活FBW7抑癌蛋白的表達，并且增強 FBW7蛋白與底物蛋白的親和性，使FBW7蛋白介導(dǎo)的泛素化降解途徑被迅速和高效地激活。 冬凌草甲素通過激活FBW7介導(dǎo)的途徑靶向泛素化降解癌蛋白C-MyC、CyClin E和mTOR，抑制腫瘤細胞的生長并誘導(dǎo)凋亡。本發(fā)明的技術(shù)特征是(1)冬凌草甲素對于FBW7蛋白的三個亞基FBW7a、FBW7 3 和/或FBW7Y都具有激活作用。(2)當冬凌草甲素的濃度為2(T40ymol/L時，激活效率較高，其中20 μ mol/L的作用效果最佳。(3)冬凌草甲素對FBW7蛋白表達的激活作用，在用藥物處理2小時內(nèi)即可顯現(xiàn)出來，隨著作用時間的延長，激活作用會持續(xù)進行，在作用2 12小時的時間范圍內(nèi)效果較明顯。(4)以冬凌草甲素制備的FBW7蛋白激活劑，對于靶向泛素化降解癌蛋白如c-Myc、cyclinE和/或mTOR等都具有很好的效果。(5)冬凌草甲素可以通過降解癌蛋白殺傷腫瘤細胞，如人乳腺癌細胞、人結(jié)腸癌細胞、人肝癌細胞、人宮頸癌細胞、 小鼠黑色素瘤細胞、人慢性粒細胞白血病細胞、人慢性髓性白血病細胞、人急性髓性白血病細胞和/或人Burkitt’ s淋巴瘤細胞等。冬凌草甲素做為FBW7激活劑的作用并不局限于某種腫瘤，而是對于多種腫瘤都同樣具有應(yīng)用價值。(6)在移植人慢性髓性白血病細胞的小鼠模型中，通過腹腔注射冬凌草甲素針劑，同樣能夠降解癌蛋白并極大地抑制腫瘤的生長。 以冬凌草甲素制備的FBW7激活劑在動物個體水平也能夠發(fā)揮顯著的抗腫瘤藥效。冬凌草甲素在基礎(chǔ)研究中可作為激活FBW7的細胞誘導(dǎo)劑，為研究FBW7及其底物蛋白的生物學(xué)功能提供了新的技術(shù)方法和手段。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果
本發(fā)明用冬凌草甲素制備激活抑癌蛋白FBW7的試劑，冬凌草甲素主要來源于中國傳統(tǒng)草藥冬凌草，易于制備，且對人體毒性較低，可應(yīng)用性強。本發(fā)明用冬凌草甲素制備的激活劑靶向泛素化降解C-MyC，cyclin E和mTOR等 FBW7底物癌蛋白，該制劑專一性強、見效快且易于操作，為靶向治療腫瘤提供了思路，并為實驗研究FBW7及其底物蛋白的生物學(xué)功能提供了新的技術(shù)方法和手段。在多種腫瘤中，冬凌草甲素制備的激活劑可激活FBW7及其介導(dǎo)的泛素化途徑，靶向泛素化降解c-Myc，cyclin E和mTOR等底物癌蛋白，最終使腫瘤細胞生長抑制和發(fā)生凋亡。其抗癌活性對多種腫瘤細胞和動物個體均有顯著效果。


圖1.實施例1中冬凌草甲素對K562細胞中FBW7的激活作用和對底物癌蛋白的降解。圖2.實施例1中冬凌草甲素對FBW7底物蛋白c_Myc的泛素化蛋白酶體降解作用。圖3.實施例2中冬凌草甲素促進FBW7與底物蛋白的結(jié)合作用。圖4.實施例3冬凌草甲素對K562細胞生長和凋亡的影響，其中A為不同濃度冬凌草甲素處理下K562細胞的存活率；B為DAPI染色對凋亡細胞的檢測(箭頭指向凋亡小體)。圖5.實施例4移植人慢性髓性白血病細胞的小鼠模型中，冬凌草甲素對C-Myc的降解和對腫瘤生長的抑制作用，其中A為冬凌草甲素處理對腫瘤體積的影響；B為腫瘤組織內(nèi)c-Myc蛋白表達的免疫組化結(jié)果。圖6.實施例5冬凌草甲素在KU812、HL60和Daudi細胞中激活FBW7蛋白、靶向泛素化降解其底物蛋白c-Myc以及降低腫瘤細胞成活率的示意圖。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例進一步解釋本發(fā)明。實施例中用到的主要材料如下
冬凌草甲素購自杭州華東醫(yī)藥集團康潤制藥有限公司，純度經(jīng)高效液相色譜(HPLC) 測定大于95%。使用二甲基亞楓(DMSO)配置成40mmol/L的儲液，凍于-20度，每次使用時用培養(yǎng)基稀釋至工作濃度。細胞系實施例中所用細胞系均購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心。N0D/SCID小鼠購自中山大學(xué)實驗動物中心?？贵wFBW7抗體購自美國Abcam公司，c-Myc、cyIin E和mTOR抗體購自美國Cell Signaling Technology 公司。實施例1冬凌草甲素激活K562細胞中的FBW7蛋白并促進其底物蛋白的泛素蛋白酶體降解
將K562細胞按3 X 105/mL的密度接種于M孔板，次日加入冬凌草甲素使其終濃度為 20ymol/Lo隨后，分別于0、2、4、6、8、10、12小時收集細胞，裂解蛋白并通過免疫印記檢測 FBW7及其底物蛋白c-Myc、CyclinE (細胞周期蛋白Ε)、mTOR (哺乳動物雷帕霉素靶蛋白) 的表達。實驗結(jié)果見圖1，在冬凌草甲素誘導(dǎo)下FBW7三個亞型的蛋白水平都隨時間逐漸增力口，而作為內(nèi)對照的看家基因GAPDH (甘油醛-3-磷酸脫氫酶)沒有變化。冬凌草甲素不但能夠在較短時間內(nèi)激活FBW7，而且隨著誘導(dǎo)時間延長該作用會更加顯著。同時，F(xiàn)BW7的底物蛋白C-MyC、CyClin E和mTOR都先后降低，并且半衰期越短的蛋白降低得越快(c-Myc最快，eyeIin E 次之)。我們采用1(^11101/1蛋白酶體抑制劑1^132預(yù)處理1(562細胞2小時，然后加入 2(^!1101/1冬凌草甲素，分別在0和2小時收取樣品檢測c-Myc的蛋白水平。結(jié)果在加了 MG132的細胞中，c-Myc并沒有明顯的變化；而不加MG132的細胞，c_Myc在2小時完全降解 (圖2)。MG132能夠阻止冬凌草甲素介導(dǎo)的c-Myc降解，說明冬凌草甲素降解c-Myc的過程需要蛋白酶體的參與。實施例2冬凌草甲素促進FBW7與其底物蛋白的結(jié)合我們采用20 μ mol/L冬凌草甲素誘導(dǎo)K562細胞，2小時后收集細胞并裂解蛋白。使用 c-Myc特異的抗體對細胞裂解物進行免疫共沉淀，將沉淀下來的蛋白復(fù)合物進行免疫印跡， 檢測蛋白復(fù)合物中的FBW7。從圖3的結(jié)果中可以看到，冬凌草甲素誘導(dǎo)使c-Myc免疫共沉淀的蛋白復(fù)合物中FBW7顯著增多，即冬凌草甲素誘導(dǎo)使FBW7與底物蛋白c-Myc的結(jié)合能力顯著增強。實施例3冬凌草甲素對K562細胞的生長抑制和誘導(dǎo)凋亡作用
我們將K562細胞按3 X 105/mL的密度接種于96孔板，次日分別加入5 80 μ mol/L冬凌草甲素處理M小時(以DMSO作為對照)然后采用MTT檢測細胞活性。實驗結(jié)果見圖4A， 在低濃度的冬凌草甲素處理下細胞活性沒有受到顯著影響，20 μ mol/L以上濃度能夠顯著降低K562細胞的存活率。冬凌草甲素對K562細胞的抑制作用與藥物劑量呈現(xiàn)正相關(guān)性。用20 μ mol/L冬凌草甲素誘導(dǎo)K562細胞Mh(以DMSO作為對照)，收集細胞用PBS 洗一次后，DAPI染色5分鐘。在熒光顯微鏡下檢查，大部分細胞發(fā)生凋亡，表現(xiàn)為能被DAPI 深染，并出現(xiàn)核凝聚、皺縮，甚至凋亡小體(見圖4B)。而對照組的正常細胞不能被DAPI深
^fe ο實施例4冬凌草甲素對K562移植瘤的生長抑制及對c-Myc蛋白的抑制
將K562細胞注射入N0D/SCID小鼠(6周齡，購自中山大學(xué)實驗動物中心)構(gòu)建K562移植瘤小鼠模型，在平均瘤大小達到20(T300 mm3時，將小鼠分成兩組(對照組和藥物組)，每組6只。每天通過腹腔注射給藥(每天一次)，藥物組注射15mg/kg的冬凌草甲素，對照組注射安慰劑(2% DMS0, 98% PBS)。每隔一天用游標卡尺測量瘤的長徑和短徑，按公式體積= 長徑X短徑2XO. 5236計算瘤體積。連續(xù)給藥12天后處死小鼠，取瘤組織進行冰凍切片及免疫組化以檢測c-Myc蛋白的表達。結(jié)果表明冬凌草甲素明顯抑制腫瘤的生長(圖5A)， 并可在體內(nèi)降低c-Myc蛋白的水平(圖5B)。實施例5 冬凌草甲素在多種腫瘤細胞中都能激活FBW7并靶向泛素化降解其底物蛋白我們將KU812，HL-60和Daudi細胞按3X 105/mL的密度接種于M孔板，次日加入冬凌草甲素誘導(dǎo)使其終濃度為20 μ mol/L。隨后，分別于0、4、8小時收集細胞，裂解蛋白并通過免疫印記檢測FBW7及其底物蛋白的表達。在三種細胞中，冬凌草甲素誘導(dǎo)都能明顯激活 FBW7并降解其底物蛋白c-Myc (圖6A，B)。我們將KU812，HL-60和Daudi細胞按3 X 105/mL的密度接種于96孔板，次日分別加入(Γ20 μ mol/L冬凌草甲素處理M小時(以DMSO作為對照)，然后采用MTT檢測細胞活性。冬凌草甲素能夠顯著殺傷這些腫瘤細胞(圖6B)。
權(quán)利要求
1.具有環(huán)外亞甲基環(huán)戊酮結(jié)構(gòu)的四環(huán)二萜類化合物在制備FBW7抑癌蛋白激活劑中的應(yīng)用。
2.冬凌草甲素在制備FBW7抑癌蛋白激活劑中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述FBW7抑癌蛋白為FBW7ci、FBW7i3 禾口 / 或 FBW7 γ ο
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于冬凌草甲素的最佳劑量為2(T40ymol/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于激活FBW7抑癌蛋白的時間為2 12小時。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于FBW7抑癌蛋白激活劑用于靶向泛素化降解癌蛋白，所述癌蛋白為c-Myc、eye 1 inE和/或mTOR。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于冬凌草甲素作為FBW7抑癌蛋白激活劑殺傷腫瘤細胞并用于制備抗腫瘤藥物，所述腫瘤細胞為人乳腺癌細胞、人結(jié)腸癌細胞、人肝癌細胞、人宮頸癌細胞、小鼠黑色素瘤細胞、人慢性粒細胞白血病細胞、人慢性髓性白血病細胞、 人急性髓性白血病細胞和/或人Burkitt’ s淋巴瘤細胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于冬凌草甲素在基礎(chǔ)研究中作為激活FBW7的細胞誘導(dǎo)劑，為研究FBW7及其底物蛋白的生物學(xué)功能提供新的技術(shù)方法和手段。
全文摘要
本發(fā)明公開了冬凌草甲素在制備FBW7抑癌蛋白激活劑中的應(yīng)用。經(jīng)過大量研究發(fā)現(xiàn)，冬凌草甲素能夠激活FBW7蛋白的表達，并且增強FBW7蛋白與底物蛋白的親和性，使FBW7介導(dǎo)的泛素化降解途徑被迅速和高效地激活。冬凌草甲素通過激活FBW7介導(dǎo)的泛素化降解途徑靶向降解癌蛋白如c-Myc、cyclinE和mTOR等，抑制多種腫瘤細胞的生長并誘導(dǎo)細胞凋亡。冬凌草甲素主要來源于傳統(tǒng)中藥冬凌草，易于制備，且對人體毒性較低，可應(yīng)用性強。
文檔編號A61K31/352GK102526020SQ20111041355
公開日2012年7月4日 申請日期2011年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月13日
發(fā)明者周惠, 屈良鵠, 翁桁游, 黃慧琳 申請人:中山大學(xué)