專利名稱：一種無(wú)機(jī)/有機(jī)雙相納米復(fù)合骨組織工程支架及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于骨組織工程支架材料制造領(lǐng)域，具體涉及一種無(wú)機(jī)/有機(jī)雙相納米復(fù)合骨組織工程支架及其制備方法。
背景技術(shù)：
由創(chuàng)傷、腫瘤、感染、病理等因素造成的骨組織缺損是臨床面臨的重大難題之一。其修復(fù)的方法有自體骨移植修復(fù)，異體、異種骨移植修復(fù)和金屬合金、高分子聚合物等各種人工骨替代材料移植修復(fù)。然而，自體骨供應(yīng)來(lái)源有限，異體、異種骨存在免疫排斥反應(yīng)和疾病感染的風(fēng)險(xiǎn)；而醫(yī)學(xué)領(lǐng)域長(zhǎng)期以來(lái)廣泛使用的金屬、有機(jī)高分子等生物醫(yī)學(xué)材料，
其成分和自然骨完全不一樣，用來(lái)作為骨的替代材料或填補(bǔ)骨缺損材料，其生物相容性和人體適應(yīng)性尚不能令人滿意。天然骨是由低結(jié)晶度納米羥基磷灰石和膠原蛋白、蛋白多糖等有機(jī)基質(zhì)巧妙結(jié)合在一起形成的無(wú)機(jī)-有機(jī)復(fù)合材料。近年來(lái)，骨缺損修復(fù)研究最早嘗試的是骨材料的成分仿生，由于羥基磷灰石(HA)與骨的無(wú)機(jī)相化學(xué)成分相近而被廣泛應(yīng)用于骨替代材料。但是在骨修復(fù)中，單純由羥基磷灰石(HA)構(gòu)建的材料，存在脆性大、較難成型等問題，限制了它在負(fù)重骨修復(fù)和替代領(lǐng)域的應(yīng)用。隨著復(fù)合材料的研究發(fā)展，國(guó)內(nèi)外研究者將焦點(diǎn)轉(zhuǎn)移到羥基磷灰石(HA)與其它生物材料的結(jié)合上如(I)HA與天然生物材料的復(fù)合(2)HA與非天然生物材料的復(fù)合(3)HA與多種材料的復(fù)合合成材料。通常HA復(fù)合生物材料的制備大多是將HA粉體與其它生物材料通過簡(jiǎn)單、機(jī)械或化學(xué)方式混合均勻后，再注入模具，冷凍干燥成型。在簡(jiǎn)單復(fù)合制備的HA復(fù)合材料中羥基磷灰石顆粒分散不均勻，易發(fā)生團(tuán)聚，界面結(jié)合力弱，使得材料的力學(xué)性能下降，微觀結(jié)構(gòu)無(wú)序。然而，隨著復(fù)合材料研究的不斷深入，人們認(rèn)識(shí)到單純模擬骨基質(zhì)的成分是不夠的，對(duì)于任何一種生物材料，成分和結(jié)構(gòu)是它的相互獨(dú)立又緊密關(guān)聯(lián)的兩個(gè)方面，共同決定材料的性能。受生物體生物礦化的啟發(fā)，仿生制備法應(yīng)運(yùn)而生。仿生法是指模仿或利用生物體結(jié)構(gòu)，生物礦化功能和生化過程的技術(shù)，把這種技術(shù)用到材料設(shè)計(jì)制造中以便獲得接近或超過生物材料優(yōu)異性能的新材料或用天然生物合成的方法獲得所需材料。仿生合成技術(shù)模仿了無(wú)機(jī)物在有機(jī)物調(diào)制下形成的機(jī)理，合成過程中先形成有機(jī)物的自組裝體，使無(wú)機(jī)先驅(qū)物于自組裝聚集體和溶液的相界面發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，在自組裝體的模板作用下，形成具有特殊結(jié)構(gòu)和功能的無(wú)機(jī)-有機(jī)復(fù)合體。雖然骨組織工程支架的仿生學(xué)研究已經(jīng)取得了相當(dāng)大的進(jìn)展，但迄今為止仍存在以下幾個(gè)方面的問題
(1)組成與微細(xì)結(jié)構(gòu)與天然骨組織存在較大差異，從而導(dǎo)致材料與骨組織在理化、生物學(xué)及力學(xué)性能上存在較大差異，材料的組織及細(xì)胞親和性不夠理想；
(2)與骨組織形成化學(xué)鍵合的速度及可控降解性還不夠理想，有些材料降解太快有些則難以降解，材料在體內(nèi)的降解速度與新骨的生長(zhǎng)速度難以匹配；
(3)復(fù)合支架中無(wú)機(jī)相分散性差，與有機(jī)相相互作用力弱，影響復(fù)合支架的力學(xué)性能；(4)材料制備工藝條件較復(fù)雜,材料性能難以穩(wěn)定，給加工造成困難。鑒于此，本發(fā)明選用具有良好生物相容性的殼聚糖/硫酸軟骨素/透明質(zhì)酸為有機(jī)基質(zhì)，模仿骨組織形成過程中無(wú)機(jī)鈣磷礦物在有機(jī)基質(zhì)生物大分子調(diào)控下原位析晶過程，采用原位仿生法和納米自組裝技術(shù)在成分仿生的基礎(chǔ)上進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能仿生制備一種具有較好力學(xué)性能、生物性能，分級(jí)結(jié)構(gòu)的新型無(wú)機(jī)-有機(jī)雙相納米復(fù)合骨組織工程支架一納米羥基磷灰石/殼聚糖/硫酸軟骨素/透明質(zhì)酸骨組織工程支架。殼聚糖是由氨基葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖兩種氨基多糖組成的帶正電荷的天然聚多糖，N-乙酰氨基葡萄糖也是細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的成分,它可與核心蛋白通過共價(jià)鍵連接成蛋白多糖，形成多孔親水的凝膠結(jié)構(gòu)，有利于水分及小分子的滲透，并調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化與膠原形成。因此，殼聚糖在組成和結(jié)構(gòu)上與ECM具有部分相似性，且生物相容性好。硫酸軟骨素是一種帶負(fù)電荷的是酸性粘多糖，是細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成之一，對(duì)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)形態(tài)、遷移、增殖、分化具有重要作用。透明質(zhì)酸也是一種帶負(fù)電荷的酸性粘 多糖，由于其結(jié)構(gòu)疏松，含水及多孔性特別適于細(xì)胞的遷移及增殖，防止細(xì)胞在遷移到位及增殖夠數(shù)之前過早地進(jìn)行分化。殼聚糖和硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸的分子結(jié)構(gòu)極其類似，且均具有良好的細(xì)胞親和性，分子中的重復(fù)單元均具有六元環(huán)的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，比較適合作為受力材料。而它們所帶電荷卻剛好相反，可以利用它們之間的靜電作用預(yù)組織成有機(jī)基質(zhì)組裝體，為無(wú)機(jī)納米晶體提供結(jié)構(gòu)框架的同時(shí)，與無(wú)機(jī)離子在界面上通過靜電匹配、幾何相似性和立體化學(xué)互補(bǔ)、表面絡(luò)和、氫鍵聯(lián)接等方式來(lái)控制納米晶體的成核和生長(zhǎng)，制備具有一定形狀和結(jié)構(gòu)的無(wú)機(jī)-有機(jī)納米復(fù)合材料。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服目前用于骨組織工程的各種材料在微觀結(jié)構(gòu)、機(jī)械性能、生物相容性、生物礦化活性等方面的一些不足，模擬天然骨的成分和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，利用原位仿生法和納米自組裝技術(shù)將性能完全不同的有機(jī)相與無(wú)機(jī)相結(jié)合起來(lái)，實(shí)現(xiàn)二者分子級(jí)復(fù)合，制備一種新型的納米復(fù)合骨組織工程支架。該方法的制備工藝條件溫和，操作簡(jiǎn)捷，制備所得的支架性能優(yōu)越，可塑性強(qiáng)，可被加工成所需的形狀。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案
一種無(wú)機(jī)/有機(jī)雙相納米復(fù)合骨組織工程支架的制備方法，采用原位仿生法和納米自組裝技術(shù)制備骨組織工程支架；以殼聚糖、硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸為有機(jī)基質(zhì)，可溶性鈣鹽和可溶性磷酸鹽為無(wú)機(jī)相納米羥基磷灰石的前驅(qū)體，模仿生物礦化采取有機(jī)大分子調(diào)控?zé)o機(jī)相生長(zhǎng)的方式，在有機(jī)基質(zhì)上原位成核結(jié)晶制備無(wú)機(jī)/有機(jī)雙相納米復(fù)合骨組織工程支架一納米羥基磷灰石/殼聚糖/硫酸軟骨素/透明質(zhì)酸骨組織工程支架。包括以下步驟
(1)稱取殼聚糖溶解于乙酸溶液，硫酸軟骨素和透明質(zhì)酸溶解于去離子水；
(2)緩慢將硫酸軟骨素和透明質(zhì)酸的混合溶液加入殼聚糖的乙酸溶液；隨后加入可溶性鈣鹽和可溶性磷酸鹽溶液；
(3)在步驟(2)的混合液中加入交聯(lián)劑進(jìn)行交聯(lián)，注入模具，移至冰箱預(yù)冷凍，轉(zhuǎn)入冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行冷凍干燥；(4)將步驟(3)的干燥樣品置于醇?jí)A溶液中進(jìn)行原位結(jié)晶，再用去離子水反復(fù)浸洗至中性，冷藏后進(jìn)行冷凍干燥，即得到無(wú)機(jī)/有機(jī)雙相納米復(fù)合骨組織工程支架一納米羥基磷灰石/殼聚糖/硫酸軟骨素/透明質(zhì)酸骨組織工程支架。復(fù)合骨組織工程支架包括以下質(zhì)量百分比的組分
硫酸軟骨素O. I 1%
透明質(zhì)酸O. 05 O. 5%
殼聚糖I 3%
羥基磷灰石O. 5 2%。
、
各步驟的工藝參數(shù)如下
(1)乙酸溶液的體積分?jǐn)?shù)為I 2%；
(2)可溶性鈣鹽溶液的濃度為1.5 3mol/L，可溶性磷酸鹽溶液的濃度為O.6
I.8mol/L，二者間隔 30-60min 加入；
(3)加入交聯(lián)劑，常溫交聯(lián)4-8h，注入模具，4°C冰箱靜置4-6h，-5°C _80°C冰箱至少冷凍24h，轉(zhuǎn)入冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行冷凍干燥至完全脫水；
(4)將干燥樣品置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3 10%NaOH或KOH的乙醇/水中進(jìn)行原位結(jié)晶，乙醇/水中乙醇與水的體積比為I 2 :1，再用去離子水反復(fù)浸洗至中性，-5°C _80°C冷藏后進(jìn)行冷凍干燥獲得產(chǎn)品。硫酸軟骨素為硫酸軟骨素A或硫酸軟骨素C，透明質(zhì)酸選用它的鈉鹽；可溶性鈣鹽是硝酸鈣或氯化鈣；可溶性磷酸鹽是磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉或磷酸二氫鈉。無(wú)機(jī)相納米羥基磷灰石前驅(qū)體Ca/P摩爾比為n(Ca2+) :n(PO43O=L 67 :1。交聯(lián)劑為I-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)0交聯(lián)劑中EDC的質(zhì)量百分比為O. 02 O. 2%，EDC和NHS的質(zhì)量比為I. 5 4 :1。一種無(wú)機(jī)/有機(jī)雙相納米復(fù)合骨組織工程支架的制備，可以簡(jiǎn)單概括為以下幾個(gè)過程
(1)殼聚糖/硫酸軟骨素/透明質(zhì)酸有機(jī)基質(zhì)的預(yù)組裝；
(2)有機(jī)基質(zhì)與無(wú)機(jī)離子的界面識(shí)別，形成有效的成核位點(diǎn)；
(3)交聯(lián)劑進(jìn)行交聯(lián)，進(jìn)一步保護(hù)和固定有機(jī)基質(zhì)組裝體；
(4)支架前驅(qū)體的預(yù)成型；
(5)有機(jī)基質(zhì)調(diào)控?zé)o機(jī)離子原位成核結(jié)晶自組裝成納米粒，形成具有多級(jí)結(jié)構(gòu)的復(fù)合支架；
(6)復(fù)合支架的后處理。本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)在于硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸均屬于陰離子糖胺聚糖，是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，可促進(jìn)細(xì)胞粘附，提高骨組織的韌性，具有極好的生物活性。殼聚糖中的N-乙?；拎c硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸等糖胺聚糖結(jié)構(gòu)類似，因此也具有類似于糖胺聚糖的特性。殼聚糖本身帶有獨(dú)特的陽(yáng)離子特性，可以與硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸(聚陰離子)通過靜電絡(luò)合作用，預(yù)組織成有機(jī)基質(zhì)組裝體；接著加入無(wú)機(jī)相前驅(qū)體可溶性鈣鹽和可溶性磷酸鹽，此時(shí)有機(jī)基質(zhì)的極性官能團(tuán)與無(wú)機(jī)離子在界面上發(fā)生相互作用(有機(jī)基質(zhì)上的官能團(tuán)酰胺基、羧基、磺酸基、氨基、羥基與無(wú)機(jī)鈣離子、磷酸根離子可通過離子配位、靜電吸引以及氫鍵相互結(jié)合)為后續(xù)無(wú)機(jī)晶體的定位生長(zhǎng)提供了有效的成核位點(diǎn)，再利用交聯(lián)劑的交聯(lián)作用，進(jìn)一步穩(wěn)定該組裝體的結(jié)構(gòu)；最后，模仿骨組織形成過程中無(wú)機(jī)鈣磷礦物在有機(jī)基質(zhì)生物大分子調(diào)控下原位析晶過程，采用原位仿生法和納米自組裝技術(shù)在成分仿生的基礎(chǔ)上進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能仿生制備一種新型的無(wú)機(jī)-有機(jī)雙相納米復(fù)合骨組織工程支架一納米羥基磷灰石/殼聚糖/硫酸軟骨素/透明質(zhì)酸骨組織工程支架。相對(duì)于其他復(fù)合支架有以下優(yōu)點(diǎn)
(1)復(fù)合支架中的各組分與細(xì)胞外基質(zhì)的組成成分相似，支架具有較好的生物相容性、生物礦化活性；
(2)采用原位仿生法和納米自組裝技術(shù)，使得無(wú)機(jī)相在支架上實(shí)現(xiàn)了納米級(jí)分散，改善了無(wú)機(jī)相與有機(jī)相的界面相容性，從而改善復(fù)合支架的力學(xué)性能；
(3)復(fù)合支架獨(dú)特的表面性能(比表面積大、表面能高、表面粗糙度及表面潤(rùn)濕性增加) 有利于生長(zhǎng)因子的吸附，細(xì)胞的粘附、增殖、分化；
(4)可以通過改變交聯(lián)劑的用量來(lái)控制交聯(lián)度，得到具有不同親水性和力學(xué)性能的復(fù)合支架；
(5)體外生物礦化研究表明，該復(fù)合支架材料具有較高的表面礦化能力；
(6)該復(fù)合支架的制備工藝較簡(jiǎn)單，操作方便，成本低。


圖1-2是純有機(jī)組分支架的SEM掃描電子顯微鏡圖。圖3-5是無(wú)機(jī)/有機(jī)雙相納米復(fù)合骨組織工程支架的SEM掃描電子顯微鏡圖。圖6-7是無(wú)機(jī)/有機(jī)雙相納米復(fù)合骨組織工程支架在模擬體液(SBF)中浸泡礦化24h、48h的SEM掃描電子顯微鏡圖。圖8是礦化結(jié)晶體的SEM掃描電子顯微鏡圖。圖9-11是礦化結(jié)晶體的倒置相差顯微鏡圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I
1)配制I.5mol/L的可溶性鈣鹽溶液，I. 8mol/L的可溶性磷酸鹽溶液；按質(zhì)量百分比計(jì)殼聚糖、硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸的含量分別為2%、0. 1%、0. 05% ；
2)將所述配比的殼聚糖溶于1%乙酸溶液，所述配比的硫酸軟骨素/透明質(zhì)酸溶于去離子水；
3)將硫酸軟骨素/透明質(zhì)酸混合液緩慢地加入殼聚糖乙酸溶液中，攪拌使其充分混合均勻；
4)按照η(Ca2+) :n (PO43O=L 67:1的比例將一定量的可溶性鈣鹽溶液，可溶性磷酸鹽溶液分別加入到上述混合液中，持續(xù)攪拌2 h，理論形成HAP的質(zhì)量配比為1% ；
5)加入交聯(lián)劑EDC/NHS,EDC質(zhì)量配比為O. 02%, EDC和NHS質(zhì)量比2:1，常溫交聯(lián)5h ；最終混合液注入模具，移至4°C冰箱靜置4 h，隨后放入-10°C冰箱冷凍，再進(jìn)行冷凍干燥至完全脫水；6)將干燥樣品置于3% NaOH的乙醇/水中進(jìn)行原位結(jié)晶，再用去離子水反復(fù)浸洗至中性，-io°c冷凍后進(jìn)行冷凍干燥獲得產(chǎn)品。實(shí)施例2
1)配制2mol/L的可溶性鈣鹽溶液，I.2mol/L的可溶性磷酸鹽溶液；按質(zhì)量百分比計(jì)殼聚糖、硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸的含量分別為1%、0. 1%、0. 05% ；
2)將所述配比的殼聚糖溶于1%乙酸溶液，所述配比的硫酸軟骨素/透明質(zhì)酸溶于去離子水；
3)將硫酸軟骨素/透明質(zhì)酸混合液緩慢地加入殼聚糖乙酸溶液中，攪拌使其充分混合均勻；
4)按照η(Ca2+) :n (PO43O=L 67:1的比例將一定量的可溶性鈣鹽溶液，可溶性磷酸鹽溶液分別加入到上述混合液中，持續(xù)攪拌I h，理論形成HAP的質(zhì)量配比為O. 5% ；
5)加入交聯(lián)劑EDC/NHS,EDC質(zhì)量配比為O. 02%, EDC和NHS質(zhì)量比3:1，常溫交聯(lián)4h ；最終混合液注入模具，移至4°C冰箱靜置6h，隨后放入-20°C冰箱冷凍，再進(jìn)行冷凍干燥至完全脫水；
6)將干燥樣品置于5%NaOH的乙醇/水中進(jìn)行原位結(jié)晶，再用去離子水反復(fù)浸洗至中性，-20°C冷凍后進(jìn)行冷凍干燥獲得產(chǎn)品。實(shí)施例3
1)配制3mol/L的可溶性鈣鹽溶液，O.6mol/L的可溶性磷酸鹽溶液；按質(zhì)量百分比計(jì)殼聚糖、硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸的含量分別為2%、0. 2%、0. 065% ；
2)將所述配比的殼聚糖溶于2%乙酸溶液，所述配比的硫酸軟骨素/透明質(zhì)酸溶于去離子水；
3)將硫酸軟骨素/透明質(zhì)酸混合液緩慢地加入殼聚糖乙酸溶液中，攪拌使其充分混合均勻；
4)按照η(Ca2+) :n (PO43O=L 67:1的比例將一定量的可溶性鈣鹽溶液，可溶性磷酸鹽溶液分別加入到上述混合液中，持續(xù)攪拌I. 5 h，理論形成HAP的質(zhì)量配比為O. 8% ；
5)加入交聯(lián)劑EDC/NHS,EDC質(zhì)量配比為O. 04%, EDC和NHS質(zhì)量比3:1，常溫交聯(lián)6h ；最終混合液注入模具，移至4°C冰箱靜置5 h，隨后放入-80°C冰箱冷凍，再進(jìn)行冷凍干燥至完全脫水；
6)將干燥樣品置于5%KOH的乙醇/水中進(jìn)行原位結(jié)晶，再用去離子水反復(fù)浸洗至中性，-80°C冷凍后進(jìn)行冷凍干燥獲得產(chǎn)品。實(shí)施例4
1)配制2mol/L的可溶性鈣鹽溶液，I.5mol/L的可溶性磷酸鹽溶液；按質(zhì)量百分比計(jì)殼聚糖、硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸的含量分別為1%、0. 5%、0. 05% ；
2)將所述配比的殼聚糖溶于1%乙酸溶液，所述配比的硫酸軟骨素/透明質(zhì)酸溶于去離子水；
3)將硫酸軟骨素/透明質(zhì)酸混合液緩慢地加入到殼聚糖乙酸溶液中，攪拌使其充分混合均勻；
4)按照η(Ca2+) :n (PO43O=L 67:1的比例將一定量的可溶性鈣鹽溶液，可溶性磷酸鹽溶液分別加入到上述混合液中，持續(xù)攪拌I h，理論形成HAP的質(zhì)量配比為O. 5% ；5)加入交聯(lián)劑EDC/NHS,EDC質(zhì)量配比為O. 05%, EDC和NHS質(zhì)量比4:1，常溫交聯(lián)5h ；最終混合液注入模具，移至4°C冰箱靜置4 h，隨后放入-10°C冰箱冷凍，再進(jìn)行冷凍干燥至完全脫水；
6)將干燥樣品置于3%KOH的乙醇/水中進(jìn)行原位結(jié)晶，再用去離子水反復(fù)浸洗至中性，-io°c冷凍后進(jìn)行冷凍干燥獲得產(chǎn)品。實(shí)施例5
1)配制3mol/L的可溶性鈣鹽溶液，O.9mol/L的可溶性磷酸鹽溶液；按質(zhì)量百分比計(jì)殼聚糖、硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸的含量分別為3%，0. 1%，0. 05% ；
2)將所述配比的殼聚糖溶于2%乙酸溶液，所述配比的硫酸軟骨素/透明質(zhì)酸溶于去離子水；
3)將硫酸軟骨素/透明質(zhì)酸混合液緩慢地加入到殼聚糖乙酸溶液中，攪拌使其充分混 合均勻；
4)按照η(Ca2+) :n (PO43O=L 67:1的比例將一定量的可溶性鈣鹽溶液，可溶性磷酸鹽溶液分別加入到上述混合液中，持續(xù)攪拌I. 5 h,理論形成HAP的質(zhì)量配比為2% ；
5)加入交聯(lián)劑EDC/NHS，EDC質(zhì)量配比為O.04%，EDC和NHS質(zhì)量比I. 5:1，常溫交聯(lián)5h ；最終混合液注入模具，移至4°C冰箱靜置5 h，隨后放入-20°C冰箱冷凍，再進(jìn)行冷凍干燥至完全脫水；
6)將干燥樣品置于10%NaOH的乙醇/水中進(jìn)行原位結(jié)晶，再用去離子水反復(fù)浸洗至中性，_20°C冷凍后進(jìn)行冷凍干燥獲得產(chǎn)品。實(shí)施例6
1)配制2mol/L的可溶性鈣鹽溶液，I.8mol/L的可溶性磷酸鹽溶液；按質(zhì)量百分比計(jì)殼聚糖、硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸的含量分別為3%、1%、0. 5% ；
2)將所述配比的殼聚糖溶于1%乙酸溶液，所述配比的硫酸軟骨素/透明質(zhì)酸溶于去離子水；
3)將硫酸軟骨素/透明質(zhì)酸混合液緩慢地加入殼聚糖乙酸溶液中，攪拌使其充分混合均勻；
4)按照η(Ca2+) :n (PO43O=L 67:1的比例將一定量的可溶性鈣鹽溶液，可溶性磷酸鹽溶液分別加入到上述混合液中，持續(xù)攪拌2 h，理論形成HAP的質(zhì)量配比為I. 5% ；
5)加入交聯(lián)劑EDC/NHS，EDC質(zhì)量配比為O.2%，EDC和NHS質(zhì)量比4:1，常溫交聯(lián)6h ;最終混合液注入模具，移至4°C冰箱靜置5 h，隨后放入-10°C冰箱冷凍，再進(jìn)行冷凍干燥至完全脫水；
6)將干燥樣品置于5%KOH的乙醇/水中進(jìn)行原位結(jié)晶，再用去離子水反復(fù)浸洗至中性，-io°c冷凍后進(jìn)行冷凍干燥獲得產(chǎn)品。實(shí)施例7
1)配制2.5mol/L的可溶性鈣鹽溶液，I. 2mol/L的可溶性磷酸鹽溶液；按質(zhì)量百分比計(jì)殼聚糖、硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸的含量分別為2%、1%、0. 1% ；
2)將所述配比的殼聚糖溶于1%乙酸溶液，所述配比的硫酸軟骨素/透明質(zhì)酸溶于去離子水；
3)將硫酸軟骨素/透明質(zhì)酸混合液緩慢地加入殼聚糖乙酸溶液中，攪拌使其充分混合均勻；
4)按照η(Ca2+) :n (PO43O=L 67:1的比例將一定量的可溶性鈣鹽溶液，可溶性磷酸鹽溶液分別加入到上述混合液中，持續(xù)攪拌lh，理論形成HAP的質(zhì)量配比為1% ；
5)加入交聯(lián)劑EDC/NHS，EDC質(zhì)量配比為O.1%，EDC和NHS質(zhì)量比3:1，常溫交聯(lián)5h ;最終混合液注入模具，移至4°C冰箱靜置6 h，隨后放入-20°C冰箱冷凍，再進(jìn)行冷凍干燥至完全脫水；
6)將干燥樣品置于5%NaOH的乙醇/水中進(jìn)行原位結(jié)晶，再用去離子水反復(fù)浸洗至中性，-20°C冷凍后進(jìn)行冷凍干燥獲得產(chǎn)品。實(shí)施例8
1)配制3mol/L的可溶性鈣鹽溶液，O.6mol/L的可溶性磷酸鹽溶液；按質(zhì)量百分比計(jì)殼聚糖、硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸的含量分別為2%、0. 5%、0. 05% ；
2)將所述配比的殼聚糖溶于1%乙酸溶液，所述配比的硫酸軟骨素/透明質(zhì)酸溶于去離子水；
3)將硫酸軟骨素/透明質(zhì)酸混合液緩慢地加入殼聚糖乙酸溶液中，攪拌使其充分混合均勻；
4)按照η(Ca2+) :n (PO43O=L 67:1的比例將一定量的可溶性鈣鹽溶液，可溶性磷酸鹽溶液分別加入到上述混合液中，持續(xù)攪拌I. 5 h，理論形成HAP的質(zhì)量配比為I. 2% ；
5)加入交聯(lián)劑EDC/NHS,EDC質(zhì)量配比為O. 05%, EDC和NHS質(zhì)量比4:1，常溫交聯(lián)4h ；最終混合液注入模具，移至4°C冰箱靜置6 h，隨后放入-10°C冰箱冷凍，再進(jìn)行冷凍干燥至完全脫水；
6)將干燥樣品置于5%KOH的乙醇/水中進(jìn)行原位結(jié)晶，再用去離子水反復(fù)浸洗至中性，-io°c冷凍后進(jìn)行冷凍干燥獲得產(chǎn)品。將所制備的一系列支架進(jìn)行結(jié)構(gòu)和性能表征，并采用乳鼠成骨細(xì)胞建立復(fù)合支架的體外評(píng)價(jià)模型，考察殼聚糖/硫酸軟骨素/透明質(zhì)酸/納米羥基磷灰石復(fù)合支架的細(xì)胞學(xué)特性。結(jié)論制備所得的復(fù)合支架易于塑形，可以根據(jù)需要加工成各種形狀和大小，且具有良好的機(jī)械性能；支架的孔隙率大于83%，具有極好的吸水/保水性能；比較圖1-2與圖3-5可發(fā)現(xiàn)納米復(fù)合支架的表面粗糙度大大增加；由3-5圖可以觀察到支架具有較好的微觀孔結(jié)構(gòu)，孔徑大小范圍為45-136 μ m,孔間連通性好，支架孔壁上有均勻分布的細(xì)小納米顆粒，無(wú)機(jī)相呈納米狀態(tài)分散在有機(jī)相中，起彌散增強(qiáng)作用，提高支架的力學(xué)強(qiáng)度；由支架的仿生礦化圖6-7，可發(fā)現(xiàn)礦化24h后支架上有許多近球形顆粒生成，48h后支架上細(xì)小的晶體顆粒融合成不規(guī)則塊狀晶體，表明支架具有良好的生物礦化活性；圖8-11中的礦化結(jié)晶體是成骨細(xì)胞與無(wú)機(jī)/有機(jī)雙相納米復(fù)合骨組織工程支架浸提液相互作用的一種富含有鈣元素的結(jié)晶物質(zhì)，表明復(fù)合支架可以提升成骨細(xì)胞的功能。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施方式，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
權(quán)利要求
1.一種無(wú)機(jī)/有機(jī)雙相納米復(fù)合骨組織工程支架的制備方法，其特征在于采用原位仿生法和納米自組裝技術(shù)制備骨組織工程支架；以殼聚糖、硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸為有機(jī)基質(zhì)，可溶性鈣鹽和可溶性磷酸鹽為無(wú)機(jī)相納米羥基磷灰石的前驅(qū)體，模仿生物礦化采取有機(jī)大分子調(diào)控?zé)o機(jī)相生長(zhǎng)的方式，在有機(jī)基質(zhì)上原位成核結(jié)晶制備無(wú)機(jī)/有機(jī)雙相納米復(fù)合骨組織工程支架一納米羥基磷灰石/殼聚糖/硫酸軟骨素/透明質(zhì)酸骨組織工程支架。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的無(wú)機(jī)/有機(jī)雙相納米復(fù)合骨組織工程支架的制備方法，其特征在于包括以下步驟(1)稱取殼聚糖溶解于乙酸溶液，硫酸軟骨素和透明質(zhì)酸溶解于去離子水；(2)緩慢將硫酸軟骨素和透明質(zhì)酸的混合溶液加入殼聚糖的乙酸溶液；隨后加入可溶性鈣鹽和可溶性磷酸鹽溶液；(3)在步驟(2)的混合液中加入交聯(lián)劑進(jìn)行交聯(lián)，注入模具，移至冰箱預(yù)冷凍，轉(zhuǎn)入冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行冷凍干燥；(4)將步驟(3)的干燥樣品置于醇?jí)A溶液中進(jìn)行原位結(jié)晶，再用去離子水反復(fù)浸洗至中性，冷藏后進(jìn)行冷凍干燥，即得到無(wú)機(jī)/有機(jī)雙相納米復(fù)合骨組織工程支架一納米羥基磷灰石/殼聚糖/硫酸軟骨素/透明質(zhì)酸骨組織工程支架。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的無(wú)機(jī)/有機(jī)雙相納米復(fù)合骨組織工程支架的制備方法，其特征在于骨組織工程支架包括以下質(zhì)量百分比的組分硫酸軟骨素O. I 1%透明質(zhì)酸O. 05 O. 5%殼聚糖I 3%羥基磷灰石O. 5 2%。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的無(wú)機(jī)/有機(jī)雙相納米復(fù)合骨組織工程支架的制備方法，其特征在于各步驟的工藝參數(shù)如下(1)乙酸溶液的體積分?jǐn)?shù)為I 2%；(2)可溶性鈣鹽溶液的濃度為1.5 3mol/L，可溶性磷酸鹽溶液的濃度為O.6 I. 8mol/L，二者間隔 30-60min 加入；(3)加入交聯(lián)劑，常溫交聯(lián)4-8h，注入模具，4°C冰箱靜置4-6h，-5°C _80°C冰箱至少冷凍24h，轉(zhuǎn)入冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行冷凍干燥至完全脫水；(4)將干燥樣品置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3 10%NaOH或KOH的乙醇/水中進(jìn)行原位結(jié)晶，乙醇/水中乙醇與水的體積比為I 2 :1，再用去離子水反復(fù)浸洗至中性，-5°C _80°C冷藏后進(jìn)行冷凍干燥獲得產(chǎn)品。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的無(wú)機(jī)/有機(jī)雙相納米復(fù)合骨組織工程支架的制備方法，其特征在于硫酸軟骨素為硫酸軟骨素A或硫酸軟骨素C，透明質(zhì)酸選用它的鈉鹽；可溶性鈣鹽是硝酸鈣或氯化鈣；可溶性磷酸鹽是磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉或磷酸二氫鈉。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的無(wú)機(jī)/有機(jī)雙相納米復(fù)合骨組織工程支架的制備方法，其特征在于無(wú)機(jī)相納米羥基磷灰石前驅(qū)體Ca/P摩爾比為η (Ca2+) : n (PO43O=L 67 :1。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的無(wú)機(jī)/有機(jī)雙相納米復(fù)合骨組織工程支架的制備方法，其特征在于交聯(lián)劑為I-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的無(wú)機(jī)/有機(jī)雙相納米復(fù)合骨組織工程支架的制備方法，其特征在于交聯(lián)劑中I-乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)碳二亞胺的質(zhì)量百分比為O. 02 O. 2%， I-乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺的質(zhì)量比為I. 5 4 :1。
9.一種如權(quán)利要求I所述的方法制得的無(wú)機(jī)/有機(jī)雙相納米復(fù)合骨組織工程支架。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種無(wú)機(jī)/有機(jī)雙相納米復(fù)合骨組織工程支架及其制備方法，采用原位仿生法和納米自組裝技術(shù)制備骨組織工程支架；以殼聚糖、硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸為有機(jī)基質(zhì)，可溶性鈣鹽和可溶性磷酸鹽為無(wú)機(jī)相納米羥基磷灰石的前驅(qū)體，模仿生物礦化采取有機(jī)大分子調(diào)控?zé)o機(jī)相生長(zhǎng)的方式，在有機(jī)基質(zhì)上原位成核結(jié)晶制備無(wú)機(jī)/有機(jī)雙相納米復(fù)合骨組織工程支架—納米羥基磷灰石/殼聚糖/硫酸軟骨素/透明質(zhì)酸骨組織工程支架。本發(fā)明制備程序簡(jiǎn)單，工藝條件溫和，制備的復(fù)合支架在宏觀及微觀上與天然骨相似，性能優(yōu)越，成型加工方便。
文檔編號(hào)A61L27/20GK102973980SQ201210555888
公開日2013年3月20日 申請(qǐng)日期2012年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月20日
發(fā)明者陳景帝, 余其鳳, 張玉玨, 張惠, 張其清 申請(qǐng)人:福州大學(xué)