專利名稱：乙型肝炎核酸疫苗及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種新的抗HBV病毒的DNA疫苗及其構(gòu)
建方法。
背景技術(shù)：
乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的一種世界性的傳染病。我國是HBV感染 高發(fā)區(qū)，約有7-8億人感染過乙型肝炎，約1.2億人為乙肝病毒攜帶者，他們中的1/4發(fā)展 為慢性肝炎、肝硬化或原發(fā)性肝癌。自1985年我過開始接種乙肝疫苗以來，在免疫兒童中 乙肝病毒攜帶者已由10%降至左右。因此實踐證明，乙肝疫苗是預防和控制乙型肝炎 最有效的武器。乙型肝炎病毒為嗜肝DNA病毒，具有雙層殼結(jié)構(gòu)，外殼由乙型肝炎病毒表面抗 原(HBsAg)、前Sl蛋白(preSl)、前S2蛋白(preS2)構(gòu)成；內(nèi)殼由乙型肝炎病毒核心抗原 (HBcAg)和e抗原(HBeAg)構(gòu)成；內(nèi)殼內(nèi)有雙鏈環(huán)狀DNA和DNA聚合酶。目前有報道的乙肝病毒疫苗主要包含HBsAg、preSl、preS2和HBcAg任意一種或者 幾種基因，再加上一些具有免疫增強作用的細胞因子基因，或者淋巴細胞表位基因等(Qing Y, et al. Construction of an HBV DNA vaccine byfusion of the GM-CSF gene to the HBV-S gene and examination of its immuneeffects in normal and HBV-transgenic mice. Vaccine. 2010Junll ；28 (26) :4301_7.)。但是其免疫預防效果和治療效果一直不盡 人意，尤其是對慢性HBV感染者來說，由于體內(nèi)長期存在相應抗原，機體免疫系統(tǒng)對于HBV 抗原已經(jīng)形成免疫耐受狀態(tài)，因此其接種該疫苗后，免疫反應性遠遠低于正常人。因此乙肝 DNA疫苗對于慢性乙肝患者的免疫耐受和激活HBV特異性T細胞免疫的效果不是很理想。microRNA作為近年來生物學研究的熱門分子受到廣泛的關(guān)注。microRNA參與了 生物體眾多轉(zhuǎn)錄后調(diào)控過程，在細胞增殖分化、抗腫瘤與免疫等領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。有研究 表明，microRNA參與了人體許多免疫通路的調(diào)控，細胞免疫與體液免疫等領(lǐng)域都發(fā)揮重要 作用。miRNA-lSla能夠調(diào)節(jié)B細胞分化，并能夠調(diào)節(jié)CD4+T細胞活化與敏感性，因此可以 作為天然的疫苗佐劑力口 以利用(Mark A. Lindsay. microRNAs and the immune response. Trends inlmmunology, Volume 29,Issue 7,343-351)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種能夠同時激活機體體液免疫與細胞免疫，免疫效果 強，免疫作用持久，構(gòu)建工藝簡便的抗HBV病毒DNA疫苗。如背景技術(shù)所述，現(xiàn)有的乙肝核酸疫苗存在諸多缺陷，因此如果能夠在傳統(tǒng)核酸 疫苗后直接連接疫苗佐劑便可提高其免疫效果?；谝陨侠碚?，本發(fā)明人用分子生物學技 術(shù)手段，將HBV病毒的表面抗原、核心抗原與e抗原基因克隆入真核表達載體，并在其后加 入miRNAlSla前體片段作為增強免疫效果的疫苗佐劑，從而構(gòu)建一種既含有抗原蛋白基因 又含有疫苗佐劑的新型乙肝DNA疫苗。
本發(fā)明提供了一種乙型肝炎核酸疫苗，以真核表達載體為基本骨架，含有乙肝病 毒HBV包膜蛋白基因HBsAg、乙肝病毒核心抗原HBc與e抗原基因；還含有人的pre-miR181a 序列，其中乙肝病毒HBV包膜蛋白基因HBsAg的核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示、乙肝病毒 核心抗原HBc與e抗原基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示；人的pre_miR181a序列如 SEQ ID NO 5 所示。所述的真核表達載體為Invitrogen公司的真核表達質(zhì)粒pcDNA 3. l/V5_His B。本發(fā)明還提供了上述乙肝核酸疫苗的構(gòu)建方法，包含以下步驟A、乙型肝炎病毒HBV包膜抗原、乙肝病毒核心抗原HBc與e抗原基因以及人 miR181a前體基因克隆(I)以HBV全基因組為模板，設(shè)計引物，通過PCR反應擴增得到HBV SDNA片段，引 物序列如下S-F :ATGGAGAGCACAACATCAGGS-F TCAAATGTATACCCAAAGACAAAAGA(II)以HBV全基因組為模板，設(shè)計引物，通過PCR反應擴增得到HBV C抗原與e抗 原的DNA序列，引物序列如下C-F :ATGGACATTGACCCGTATAAC-F CTAACATTGAGATTCCCGAGAT(III)以THP-I細胞基因組為模板，設(shè)計引物，通過PCR反應擴增得到miR181a前 體，引物序列如下181F TCGACTTGAAACCCAGAGAGG18IR :AATTCACTGGACCACATTTGGB、將上述乙型肝炎病毒HBV包膜抗原、乙肝病毒核心抗原HBc與e抗原基因以及 人miR181a前體基因插入同一真核表達載體pcDNA 3. l/V5_His B。本發(fā)明還提供了上述乙肝核酸疫苗在用于制備治療乙型肝炎藥物中的應用。本發(fā)明的乙肝核酸疫苗具有以下優(yōu)點第一，本疫苗通過真核表達質(zhì)粒介導注射 方式接種，安全可靠；第二，本疫苗能夠同時作用機體體液免疫與細胞免疫，免疫效果較好； 第三，由于本疫苗克隆表達HBV病毒完整的表面抗原、核心抗原與e抗原，所以其免疫效果 與對機體的保護力明顯高于多表位疫苗；第四，本疫苗以真核表達質(zhì)粒為載體，能夠在體內(nèi) 長期表達，免疫效果持久；第五，本疫苗自身已包括microRNA佐劑，不需額外添加，簡化制 作工藝。


圖1為本核酸疫苗pcDNA3. l_S-C_181a結(jié)構(gòu)示意2為HBV S抗原真核表達載體制備流程3為HBV核心抗原與e抗原真核表達載體制備流程4為pre-miR181a表達載體制備流程5為ELISP0T法測定在HBsAg與HBc刺激后本核酸疫苗對于小鼠脾臟細胞免疫 激活情況，其中圖5a縱坐標表示每IO6脾臟中產(chǎn)生INF-γ的細胞數(shù)目，橫坐標表示組別； 圖5b縱坐標表示每IO6脾臟中產(chǎn)生IL-4的細胞數(shù)目，橫坐標表示組別。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作詳細描述，但本發(fā)明的實施例僅用于說明本發(fā) 明而不用于限制本發(fā)明的保護范圍。實施例1 本發(fā)明核酸疫苗的構(gòu)建本發(fā)明所采用PCR、酶切、連接、轉(zhuǎn)化等分子生物學實驗方法構(gòu)建DNA疫苗，可 以參考美國薩姆布魯克著《分子克隆》第二版。PCR引物設(shè)計軟件為Premier Biosoft International ^w] ^ Primer PREMER V。構(gòu)建本疫苗的基本材料包括人單核細胞THP-I (購自中國科學院細胞庫)、穩(wěn)定 轉(zhuǎn)染HBV全病毒的H印G 2. 215肝癌細胞(購自中國科學院武漢病毒所)；真核表達載體 pcDNA 3. 1/V5-His B 質(zhì)粒(購自 Invitrogen 公司)。構(gòu)建本核算病毒所需試劑包括Prime Star高保真DNA聚合酶(購自TaKaRa公 司)、pMD18T克隆載體(購自TaKaRa公司)、各種限制性內(nèi)切酶(購自NEB公司)、T4連接 酶(購自TaKaRa公司)、反轉(zhuǎn)錄試劑M-MLV (購自Invitrogen公司)、RNA抽提Trizol試 劑(購自Invitrogen公司)。構(gòu)建本疫苗的基本步驟包括(I)HBV S抗原表達載體制備如圖2所示，以HBV全基因組為模板，設(shè)計特異性引物，通過PCR反應擴增得到HBV S DNA片段，核苷酸序列如SEQ ID Ν0:1所示。引物序列為S-F :ATGGAGAGCACAACATCAGGS-F TCAAATGTATACCCAAAGACAAAAGAPCR反應體系為ddH2036 μ 1IOXPrime Star Buffer5μ 1dNTPs4 μ 1S-F1 μ 1S-R1 μ 1HBV 基因組1·5μ1Prime Star 酶1. 5μ 1_50 μ 1PCR 反應條件為94°C預變性 5min -MV -30s, 55°C -30s, 72°C -lmin，30 個循環(huán)； 72°C后延伸7min ；4°C保存。將HBV S PCR產(chǎn)物通過1. 5%的瓊脂糖凝膠電泳后進行膠回收，得到HBVS DNA片 段。將該片段連接入克隆載體PMD18T，連接體系為HBV S DNA18 μ 1pMD18T1 μ 1Solution I1 μ 1
_20 μ 116°C連接過夜后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入ToplOCaCl2感受態(tài)細胞中，經(jīng)挑克隆，委托 Invitrogen公司測序。待確定測序結(jié)果正確后，確定得到HBV S抗原克隆載體T-S，并保存 該菌種。將T-S質(zhì)粒與真核表達載體pcDNA 3. l/V5_His B用Kpn I與BamH I限制性內(nèi)切 酶消化，分別回收消化后的HBV S DNA片段與載體pcDNA 3. 1/V5-His B。酶切體系為ddH2049 μ 1T-S/pcDNA 3. 140 μ 1IOXK Buffer5μ 1KpnI3 μ 1BamHI3 μ 1_100 μ 1Τ4連接酶16°C連接片段與載體過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入ToplOCaCl2 胞，挑取單克隆菌落并進行菌落PCR鑒定與酶切鑒定。鑒定成功后保存菌落， pcDNA3. I-S。(2) HBV C抗原與e抗原表達載體制備如圖3所示，以HBV全基因組為模板，設(shè)計引物，通過PCR反應得到HBV e抗原的DNA序列，核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示。引物序列為C-F :ATGGACATTGACCCGTATAAC-F CTAACATTGAGATTCCCGAGATPCR反應體系參照HBV S DNA片段制備。PCR反應條件為94 °C預變性5min ； 940C -30s, 530C -30s, 72°C _lmin，30 個循環(huán)；72°C后延伸 7min ；4°C保存。將HBV C抗原與e抗原的PCR產(chǎn)物膠回收后連接入pMD18T，連接體系及條件與HBV S抗原相同。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化后經(jīng)挑克隆，委托Irwitrogen公司測序，并將測序正確的克隆保 菌并命名為T-C。用EcoR I與Xba I限制性內(nèi)切酶酶切T-C質(zhì)粒與HBV S抗原表達載體pcDNA3. 1_S 以及空載體pcDNA 3. 1/V5-His B。酶切體系為ddH2044 μ 1T-C/pcDNA3. l_S/pcDNA3. 140 μ 1IOXM Buffer10 μ 1EcoRI3 μ 1XbaI3 μ 1_100 μ 1 37°C酶切過夜，用的瓊脂糖膠回收酶切產(chǎn)物，T4連接酶16°C連接片段與載體 過夜。將連接好的片段與載體轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細胞，之后挑克隆并進行菌落PCR鑒定與酶切
感受態(tài)細 并命名為
C抗原與鑒定，鑒定正確后保菌并分別命名為pcDNA3. I-S-C與pcDNA3. I-C0(3)miR181a前體疫苗佐劑表達載體構(gòu)建如圖 4 所示，通過在 Sanger miRBase 數(shù)據(jù)庫(http://www.mirbase.org)上檢索， 我們得到人的miRlSla的前體序列，如SEQ ID NO :3所示。將該序列進行人類基因組BLAST， 對其所在基因座位進行定位，并向其兩側(cè)翼延伸大約200bp得到一段DNA序列，如SEQ ID NO 4所示，根據(jù)該序列設(shè)計特異性引物181F TCGACTTGAAACCCAGAGAGG18IR :AATTCACTGGACCACATTTGG參照美國薩姆布魯克著《分子克隆》第二版，通過酚氯仿法提取THP-I細胞基因 組，并以此基因組為模板通過PCR反應得到miRlSla前體。PCR反應體系與條件如下
0088]ddH2036 μ 1
0089]IOXPrime Star Buffer5μ 1
0090]dNTPs4 μ 1
0091]181F1 μ 1
0092]181R1 μ 1
0093]THP-I細胞基因組1· 5 μ 1
0094]Prime Star 酶1· 5 μ 1
0095]_
0096]50 μ 1PCR 反應條件為94°C預變性 5min -MV -30s, 59°C -30s, 72°C -lmin，30 個循環(huán)； 72°C后延伸7min ；4°C保存。將miRlSla的PCR產(chǎn)物連接入pMD18T載體，連接體系與條件如前所述。將連接產(chǎn) 物轉(zhuǎn)化后委托Irwitrogen公司測序鑒定。測序正確的保菌，并命名為T-181a。用Hind III與Kpn I雙酶切T_181a與pcDNA3. I-S-C質(zhì)粒，酶切體系如下
0100]ddH2044 μ 1
0101]T_181a/pcDNA3. I-S-C40 μ 1
0102]IOXM Buffer10 μ 1
0103]Hind III3μ 1
0104]Kpn I3μ 1
0105]_
0106]100 μ 1酶切反應條件為37°C，4小時。將酶切產(chǎn)物回收后通過T4連接酶連接，并轉(zhuǎn)化。經(jīng) 挑克隆，菌落PCR與酶切鑒定后，將鑒定正確的菌落保菌，命名為pcDNA3. l-S-C-181a。實施例2 本發(fā)明核酸疫苗的動物實驗為了驗證本發(fā)明對于HBV感染的保護效力，本發(fā)明比較了 pcDNA3. 1-S-C_181a、表 達HBV S抗原的pcDNA3. 1-S、表達HBV C抗原與e抗原的pcDNA3. 1_C對于小鼠免疫效果的差別。實驗用小鼠為雌性8周齡Balb/C小鼠，30只，共分為3組，每組10只。其中一組 注射pcDNA3. l-S-C-181a，二組注射pcDNA3. 1-S，三組注射pcDNA3. 1-C，注射方式為肌肉注射，按0. Img/只小鼠的注射量實施。為了增強免疫效果，注射后再以注射孔為中心，將電脈 沖電擊垂直插入，電極針插入略深于注射深度，電場強度為200v/cm，放電6次，10秒后拔出 電極針。共進行3次免疫，每次免疫間隔2周。每次免疫前斷尾取血10 μ 1，與90 μ IPBS混 合，3000轉(zhuǎn)/分離心lOmin，去上清檢測抗體。最后一次免疫后4周處死小鼠，去脾臟細胞 進行原代培養(yǎng)，并通過ELISP0T檢測疫苗激活細胞免疫的情況。第一次免疫后，注射PCDNA3. l-S-C-181a組與pcDNA3. I-S組小鼠血清中抗-HBs 抗體陽性轉(zhuǎn)化率分別為6/10與2/10，而注射pcDNA3. l_S-C_181a組與pcDNA3. I-C組小鼠 血清中抗-HBc抗體陽性轉(zhuǎn)化率分別為9/10與7/10。第二次免疫后，注射pcDNA3. l_S-C_181a組與pcDNA3. I-S組小鼠血清中抗-HBs 抗體陽性轉(zhuǎn)化率分別為9/10與5/10，而注射pcDNA3. l_S-C_181a組與pcDNA3. I-C組小鼠 血清中抗-HBc抗體陽性轉(zhuǎn)化率分別為10/10與8/10。第三次免疫后，注射pcDNA3. l_S-C_181a組與pcDNA3. I-S組小鼠血清中抗-HBs 抗體陽性轉(zhuǎn)化率分別為10/10與8/10，而注射pcDNA3. l_S-C_181a組與pcDNA3. 1-C組小鼠 血清中抗-HBc抗體陽性轉(zhuǎn)化率分別為10/10與9/10。待最后一次免疫后4周，頸椎脫白法處死小鼠，在無菌條件下取出脾臟，置于盛 有RPMI1640培養(yǎng)基的平皿中，用玻棒研磨破碎，200目尼龍網(wǎng)過濾成單細胞懸液，IOOOr/ min離心lOmin。棄上清，用Hanks洗2遍，離心，將細胞重懸于含10% FBS的RPMI1640培 養(yǎng)基中。臺盼蘭染色計數(shù)每組小鼠活的的活淋巴細胞數(shù)目，調(diào)整細胞密度為3X105/ml，至 370C 5% CO2培養(yǎng)箱中以供ELISP0T檢測。ELISP0T檢測封閉ELISP0T培養(yǎng)板，按3X IO5/孔加入細胞，37°C 5% CO2培養(yǎng)箱 中孵育12h。依次加入生物素標記的檢測抗體和酶標記的抗體(GABA)，加入顯色劑顯色后， 觀察斑點形成。去除顯色液，使用去離子水清洗ELISP0T板。室溫干燥ELISP0T板，在倒置 顯微鏡下觀察結(jié)果。實驗結(jié)果表明，在HBsAg與HBV核心蛋白HBc刺激后，各實驗組活性細胞數(shù)目顯著 高于刺激前水平。pcDNA3. l-S-C-181a組刺激后特異性細胞因子INF-γ和IL-4的分泌細 胞數(shù)量顯著高于其他兩組。圖5a為產(chǎn)生INF-Y的T細胞數(shù)目/IO6脾細胞。圖5b為產(chǎn)生 IL-4的T細胞數(shù)目/IO6脾細胞。* :p < 0. 05由此可以看出，本發(fā)明設(shè)計、構(gòu)建的核酸疫苗pcDNA3. 1-S-C_181a在激活機體體 液免疫、細胞免疫，產(chǎn)生抗HBs與HBc抗體血清與特異性的細胞因子等方面明顯的強與單純 HBV胞膜蛋白與核心蛋白的核酸疫苗。
權(quán)利要求
一種乙型肝炎核酸疫苗，以真核表達載體為基本骨架，其特征在于該疫苗含有乙肝病毒HBV包膜蛋白基因HBsAg、乙肝病毒核心抗原HBc與e抗原基因；還含有人的pre miR181a序列，其中乙肝病毒HBV包膜蛋白基因HBsAg的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示、乙肝病毒核心抗原HBc與e抗原基因的核苷酸序列如SEQ ID NO2所示；人的pre miR181a序列如SEQ ID NO4所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種乙型肝炎核酸疫苗，其特征在于其中所述的真核表達載 體為 pcDNA 3. 1/V5-His B 質(zhì)粒。
3.—種如權(quán)利要求1或2所述的乙肝核酸疫苗的構(gòu)建方法，包含以下步驟A、乙型肝炎病毒HBV包膜抗原、乙肝病毒核心抗原HBc與e抗原基因以及人miR181a 前體基因克隆(I)以HBV全基因組為模板，設(shè)計引物，通過PCR反應擴增得到HBVSDNA片段，引物序 列如下S-F :ATGGAGAGCACAACATCAGGS-F TCAAATGTATACCCAAAGACAAAAGA(II)以HBV全基因組為模板，設(shè)計引物，通過PCR反應擴增得到HBVC抗原與e抗原的 DNA序列，引物序列如下C-F :ATGGACATTGACCCGTATAAC-F CTAACATTGAGATTCCCGAGAT(III)以THP-I細胞基因組為模板，設(shè)計引物，通過PCR反應擴增得到miRlSla前體181F TCGACTTGAAACCCAGAGAGG18IR :AATTCACTGGACCACATTTGGB、將上述乙型肝炎病毒HBV包膜抗原、乙肝病毒核心抗原HBc與e抗原基因以及人 miR181a前體基因插入同一真核表達載體pcDNA 3. l/V5_His B。
4.如權(quán)利要求1或2所述的乙肝核酸疫苗在用于制備治療乙型肝炎藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，目前有報道的乙肝病毒疫苗主要包含HBsAg、preS1、preS2和HBcAg任意一種或者幾種基因，再加上一些具有免疫增強作用的細胞因子基因，或者淋巴細胞表位基因等，但是其免疫預防效果和治療效果一直不盡人意。本發(fā)明提供一種乙肝疫苗包括乙型肝炎病毒表面抗原基因HBsAg、核心蛋白基因HBc以及e抗原基因，還含有人microRNA181a前體基因序列，可以輔助刺激機體免疫通路。本疫苗的構(gòu)建過程涉及PCR、酶切、連接、轉(zhuǎn)化等分子生物學操作手段。本疫苗能夠有效激活機體產(chǎn)生針對乙型肝炎病毒的特異性抗體，并能夠刺激機體細胞免疫，分泌多種細胞因子，從而達到治療慢性乙型肝炎的目的。
文檔編號A61P31/20GK101954093SQ20101028066
公開日2011年1月26日 申請日期2010年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月14日
發(fā)明者商京麗, 孫樹漢, 章意亮, 魏偉 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學