專利名稱：γδT淋巴細胞中δ1鏈互補決定域3的優(yōu)勢序列及其TCR受體轉染細胞與應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域中的多肽及其編碼基因與應用，特別是涉及人胃癌組織來源腫瘤浸潤性Y S T淋巴細胞中δ 1鏈互補決定域3的優(yōu)勢序列GTM及其TCR受體轉染細胞與在制備治療惡性腫瘤藥物中的應用。
背景技術：
機體的免疫系統(tǒng)在進化過程中產生了四種主要的抗原識別機制，分為巨噬細胞和樹突狀細胞(DC)的模式識別、α βΤ細胞和B細胞的特異性識別、NK細胞針對內部自我異常改變的識別和Y δ T細胞對抗原的識別(Morita CTHH, HHMariuzza RAHH, HHBrenner ΜΒΗΗ. Antigen recognition by human gamma delta T cells :pattern recognition by the adaptive immune system. HHSpringer Semin Immunopathol. HH2000 ；22 (3) 191-217 ；Zocchi MRHH, HHPoggi AHH. Role of gammadelta T lymphocytes in tumor defense. HHFront Biosci. HH 2004 Sep 1 ；9 :2588-604 ；Hochstenbach FHH, HHBrenner ΜΒΗΗ. Newly identified gamma delta and beta delta T-cell receptors. HHJ Clin Immunol. HH 1990 Jan ； 10(1) :1-18.)。目前，前三種抗原識別機制已基本研究清楚。巨噬細胞和樹突狀細胞(DC)是通過模式識別受體(pattern recognition receptor, PRR)如 TLR(toll-like receptor)識別種屬間標志分子如病原相關分子(pathogen associated molecular pattern, PAMPs)，依據兩個最保守分子之間的相互識別對侵入宿主的病原微生物進行清除，其特點是簡單快速(Takeda KHH，HHKaisho THH, HHAkira SHH. Toll-like receptors. HHAnnu Rev Immunol. HH2003 ；21 :335-76. Epub 2001 Dec 19·)。α β T 細胞和B細胞為主的抗原識別以精細而準確的識別方式為特征，它們依據其抗原受體庫的高度多樣性和多信號協(xié)同作用能精細的區(qū)分一個抗原和其它數量眾多的外來抗原(抗原表位) 細微的差別。NK細胞能夠直接識別和殺傷一些腫瘤細胞而無需抗原預先作用。NK細胞的活性被其活化受體(殺傷細胞活化受體，KAR)或抑制受體(殺傷細胞抑制受體，KIR)與靶細胞上的某些配體或MHC-I類分子的相互作用所控制，其識別特點是通過帶有保守序列的受體對不變的配體進行識別，針對內部自我異常改變(Allison TJ, Winter CC, Fournie JJ, Bonneville Μ, Garboczi DN Structure of a human gammadelta T-cell antigen receptor. Nature 2001,411 :820-824 ；Kabelitz D， Wesch D， Hinz T gamma delta T cells, their T cell receptor usage and role in human diseases. Springer Semin Immunopathol 1999,21 :55-75.)。但作為天然免疫及獲得性免疫之間橋梁的、δ T細胞具體的識別機制目前還不清楚。人γ δ T細胞占人外周血⑶3+Τ細胞的2-5%，但是在小腸或皮膚等局部組織中為主要的T細胞亞群。、δτ細胞根據δ鏈V基因的不同，主要分為兩個亞型，外周血主要是γ9δ2Τ(νδ2)細胞亞型，而上皮組織中以δ 1型(ν δ 1)為主，同時配有不同的γ鏈 (Hayday AC. γ δ T cells :a right time and a right place for a conserved third wayof protection. Annu Rev Immunol 2000 ; 18 :975-1026.)?；罨?γ δ T細胞具有很強的細胞毒效應細胞活性，并能產生各種細胞因子(通常包括TNF-α和IFN-Y)。然而，由于對抗原的MHCI非限制性識別的特點，γ δΤ可能識別與α βΤ細胞不同的抗原配體，這使γ δΤ 細胞處于機體防御和免疫監(jiān)視的第一線(Hayday AC. γ δ T cells :a right time and a right place for a conserved third way of protection. Annu Rev Immunol 2000 ；18 975-1026. Girardi Μ, Oppenheim DE, Steele CR, et al. Regulation of cutaneous mal ignancy by gy T cells.Science 2001；294 :605-9.)。人γ δ T細胞識別腫瘤表面表達的抗原。V δ 1識別MICA/B和ULBP家族。從結直腸癌患者腫瘤浸潤性T淋巴細胞(TIL)中分離出來的νδ1Υ δΤ細胞不僅能裂解來自自體的，也能裂解各種同種異體上皮腫瘤細胞(Maeurer MJ, Martin D, Walter W, et al. Human intestinal Vyl+T lymphocytes recognize tumor cells of epithelial origin. J Exp Med 1996;183:1681-96.)。在熱應激或者氧化壓力條件下，可以誘導MICA/B和ULBP1-3 在許多上皮腫瘤細胞以及一些淋巴瘤細胞表面以各種水平表達。表達MICA/B和ULBP1-3 的腫瘤及淋巴瘤細胞能夠被V δ IT細胞所識別并殺傷，且這種殺傷是通過MICA直接識別 γ δ TCR(y δ T 細胞受體)來實現的(Wu J. ,Groh V. ,Spies Τ. T cell antigen receptor engagement and specificity in the recognition of stress-inducible MIC by human epithelial γ δ T cells. J. Immumol2002 ；169 :1236-1240. Zhao J, Huang J, Chen H, Cui L, He W. V δ 1 T cell receptor binds specifically to MHC I chain related A:molecular and biochemical evidences. Biochem Biophys Res Commun 2006 ；339 232-40.)。￥5 21~細胞識別磷酸類非肽抗原和？141 &紹。這類抗原通常是來自類異戊二烯(isoprenoid)生物合成途徑的產物。其中對Y δ T刺激活性最強的是羥甲異戊烯二磷酸酉旨((E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2_enyl pyrophosphate, HMBPP)。TCR(人T細胞受體)由δ鏈和與其匹配的γ鏈組成，其抗原結合部位是由六個抗原決定簇(CDR)形成的，這六個CDR在識別抗原時作用是不同的，其中CDR3區(qū)在抗原識別時，占有主導地位。鑒于TCR δ⑶R3區(qū)(⑶R3 δ )與抗體重鏈的⑶R3區(qū)在結構和功能上的相似性，因此，研究人員提出了 CDR3 δ的一級結構是決定TCR γ δ識別抗原特異性關鍵部位的學術假說。根據卵巢上皮癌(OEC)組織浸潤的γ δΤ細胞(γ STIDTCR的一個 ⑶R3 δ的基因序列(OB)，人工合成了 0Τ3肽，并通過體外一系列0Τ3肽與靶細胞、靶組織或來源于靶細胞的蛋白的結合實驗，驗證0Τ3肽的結合特異性；同時，在用0Τ3序列替代抗體重鏈⑶R3區(qū)序列構建的0Τ3移植抗體0)T3Ab)進行的相應實驗中得到進一步驗證。證明⑶R3S確實在TCR γ δ抗原識別特異性上起關鍵作用。通過親和層析的方法利用0Τ3肽作為探針在人卵巢癌SK0V3細胞總蛋白中尋找到與之結合的分子hMSH2配體(TCRy δ所識別的新型配體)。通過RT-PCR、Western Blot、流式細胞術、免疫組化等方法證實hMSH2 在腫瘤細胞及組織中表達；而且，體外實驗證實hMSH2蛋白能特異性與V δ 2Τ細胞結合，并刺激其活化增殖，分泌Y干擾素，促進VS 2Τ細胞對靶細胞的殺傷活性。上述結果是來自Y 9 δ 2Τ細胞對腫瘤識別的研究。而另一類上皮來源的V δ IT細胞與腫瘤的識別特性、CDR3區(qū)序列特征、識別的腫瘤抗原以及識別腫瘤抗原的分子機制還未見報道。V δ 1與V δ 2Τ細胞在序列和結構、分布、識別抗原配體、功能等方都有很大區(qū)別， 因此，γ δ 2TCR結構⑶R3序列不能代表其它類型TCR的其它⑶R3序列與腫瘤的識別機制。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供了一個人胃癌組織來源腫瘤浸潤性Y δ T淋巴細胞 (tumor-infiltrating γ δ T cell, γ δ TIL)中 δ 1 鏈互補決定域 3 (CDR3 δ 1)的優(yōu)勢序歹Ij GTM0本發(fā)明所提供的人胃癌組織來源腫瘤浸潤性Y δ T淋巴細胞中δ 1鏈互補決定域 3的優(yōu)勢序列，命名為GTM，是下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的 SEQ ID NO 1 ；2)將序列表中SEQ ID NO 1的氨基酸殘基序列經過一至十個氨基酸殘基的取代、 缺失或添加并具有抗原識別作用的蛋白質。序列表中的SEQ ID NO :1由15個氨基酸殘基組成。含有上述人胃癌組織來源腫瘤浸潤性、δ T淋巴細胞中δ 1鏈互補決定域3的優(yōu)勢序列GTM的TCR受體的δ 1鏈蛋白也屬于本發(fā)明的保護范圍。具體來講，含有上述人胃癌組織來源腫瘤浸潤性Y δ T淋巴細胞中δ 1鏈互補決定域3的優(yōu)勢序列GTM的TCR受體的δ 鏈，命名為TRD1G，是下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的 SEQ ID NO 2 ；2)將序列表中SEQ ID NO 2的氨基酸殘基序列經過一至十個氨基酸殘基的取代、 缺失或添加并具有抗原識別作用的蛋白質。序列表中的SEQ ID NO 2由286個氨基酸殘基組成，自氨基端第111-125位氨基酸殘基為GTM序列。與上述含有上述人胃癌組織來源腫瘤浸潤性Y δΤ淋巴細胞中δ 1鏈互補決定域 3的優(yōu)勢序列GTM的TCR受體的δ 1鏈TRDlG相匹配的、4鏈，命名為TRG4G，是下述氨基
酸殘基序列之一1)序列表中的 SEQ ID NO 3 ；2)將序列表中SEQ ID NO 3的氨基酸殘基序列經過一至十個氨基酸殘基的取代、 缺失或添加并具有抗原識別作用的蛋白質。序列表中的SEQ ID NO 3由3Μ個氨基酸殘基組成。一種胃癌組織來源腫瘤浸潤性Y δ T淋巴細胞(γ δ TIL)的TCR，其δ 1鏈的氨基酸殘基序列如序列表中SEQ ID Ν0:2所示(TRDlG)，其γ 4鏈的氨基酸殘基序列如序列表中 SEQ ID NO 3 所示(TRG4G)。編碼上述人胃癌組織來源腫瘤浸潤性Y δ T淋巴細胞中δ 1鏈互補決定域3的優(yōu)勢序列GTM的基因(GTM)，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID NO 4的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID NO 1的DNA序列；3)與序列表中SEQ ID NO 4限定的核苷酸序列具有90%以上同源性且具有抗原識別作用的核苷酸序列；4)在高嚴謹條件下可與序列表中的SEQ ID NO 4限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
所述高嚴謹條件為雜交后用含0.1XSSPE(或0.1XSSC)、0.1(% SDS的溶液在 65 °C下洗膜。序列表中的SEQ ID NO 4由45個堿基組成，其編碼序列為自5，端第1_45位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID NO 1的氨基酸殘基序列的蛋白質。編碼含有上述人胃癌組織來源腫瘤浸潤性Y δ T淋巴細胞中δ 1鏈互補決定域3 的優(yōu)勢序列GTM的TCR受體的δ 1鏈蛋白的基因也屬于本發(fā)明的保護范圍。具體來講，編碼含有上述人胃癌組織來源腫瘤浸潤性Y δ T淋巴細胞中δ 1鏈互補決定域3的優(yōu)勢序列GTM的TCR受體的δ 1鏈TRDlG的基因(TRDlG)，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID NO 5的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID NO 2的DNA序列；3)與序列表中SEQ ID NO 5限定的核苷酸序列具有90%以上同源性且具有抗原識別作用的核苷酸序列；4)在高嚴謹條件下可與序列表中的SEQ ID NO 5限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。所述高嚴謹條件為雜交后用含0. IXSSPE(或0. IXSSC)、0. SDS的溶液在 65 °C下洗膜。序列表中的SEQ ID NO 5由858個堿基組成，其編碼序列為自5，端第1_858位堿基，自5，端第331-375位堿基為GTM編碼序列，編碼具有序列表中SEQ ID NO 2的氨基酸殘基序列的蛋白質。編碼含有上述人胃癌組織來源腫瘤浸潤性Y δ T淋巴細胞中δ 1鏈互補決定域3 的優(yōu)勢序列GTM的TCR受體的δ 1鏈TRDlG相匹配的Y 4鏈TRG4G的基因(TRG4G)，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID NO 6的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID NO 3的DNA序列；3)與序列表中SEQ ID NO 6限定的核苷酸序列具有90%以上同源性且具有抗原識別作用的核苷酸序列；4)在高嚴謹條件下可與序列表中的SEQ ID NO 6限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。所述高嚴謹條件為雜交后用含0. IXSSPE(或0. IXSSC)、0. SDS的溶液在 65 °C下洗膜。序列表中的SEQ ID NO 6由972個堿基組成，其編碼序列為自5’端第1-972位堿
基，編碼具有序列表中SEQ ID NO :3的氨基酸殘基序列的蛋白質。編碼所述胃癌組織來源腫瘤浸潤性Y δ T淋巴細胞(Y δ TIL)的TCR的基因，其 S 1鏈編碼基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:5所示(TRDlG)，其Y 4鏈編碼基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 6所示(TRG4G)。含有本發(fā)明基因的表達載體、轉基因細胞系及宿主菌均屬于本發(fā)明的保護范圍。擴增本發(fā)明基因中任一片段的引物對也在本發(fā)明的保護范圍之內。所述轉基因細胞系為轉基因J. RT3-T3. 5細胞，這是一種人Jurkat白血病細胞系CN 102532269 A的衍生體，它不能產生有功能的TCR受體，但可用于轉染其它外源的TCR以研究其抗原特異性；可按照常規(guī)方法將編碼所述胃癌組織來源腫瘤浸潤性淋巴細胞(Y δ TIL)細胞的 TCR的基因轉染J. RT3-T3. 5細胞，如通過含有編碼所述胃癌組織來源腫瘤浸潤性γ δ T淋巴細胞(Y δ TIL)的TCR基因的重組真核表達載體將編碼所述胃癌組織來源腫瘤浸潤性 Y δ T淋巴細胞(Y δ TIL)的TCR基因導入J. RT3-T3. 5細胞。用于構建含有編碼所述胃癌組織來源腫瘤浸潤性、δ T淋巴細胞(Y δ TIL)的 TCR基因的重組真核表達載體的出發(fā)載體可為pRSV-rev、pLentilox 3. 7、pMDLg、pRRE、 PffPXL或pLVX-DsRed等慢病毒表達載體，優(yōu)選為pWPXL ；以pWPXL為出發(fā)載體，構建的攜帶所述胃癌組織來源腫瘤浸潤性Y S T淋巴細胞(γ δ TIL)的TCR的δ 1鏈編碼基因(TRDlG) 的重組真核表達載體為pWPXL-δ 1，構建的攜帶所述胃癌組織來源腫瘤浸潤性^5 1~淋巴細胞(Y δ TIL)的TCR的Y 4鏈編碼基因(TRG4G)的重組真核表達載體為pWPXL-γ 4。所述攜帶有編碼所述胃癌組織來源腫瘤浸潤性、δ T淋巴細胞(、δ TIL)的TCR 基因的重組真核表達載體可通過脂質體介導法、電轉、腺病毒、腺相關病毒、逆轉錄病毒或慢病毒等常規(guī)的生物學方法轉化J. RT3-T3. 5細胞。所述轉染有編碼所述胃癌組織來源腫瘤浸潤性Y δ T淋巴細胞(Y δ TIL)的TCR 基因的J. RT3-T3. 5細胞為TCR δ 1轉染細胞。所述人胃癌組織來源腫瘤浸潤性、δ T淋巴細胞中δ 1鏈互補決定域3的優(yōu)勢序列GTM，含有上述人胃癌組織來源腫瘤浸潤性γ δ T淋巴細胞(γ δ TIL)中δ 1鏈互補決定域3的優(yōu)勢序列GTM的TCR受體的δ 1鏈蛋白，δ 1鏈為TRD1G、γ 4鏈為TRG4G的胃癌組織來源腫瘤浸潤性、S T淋巴細胞(γ δ TIL)的TCR以及編碼所述多肽、蛋白的基因可用于制備殺滅腫瘤細胞的藥物或制劑，因而本發(fā)明為進一步開發(fā)一種抗腫瘤藥物提供了依據。本發(fā)明所指的抗腫瘤藥物，它的活性成分為上述具有抗腫瘤作用的人胃癌組織來源腫瘤浸潤性Y S T淋巴細胞中δ 1鏈互補決定域3的優(yōu)勢序列GTM，或含有上述人胃癌組織來源腫瘤浸潤性Y δ T淋巴細胞中δ 1鏈互補決定域3的優(yōu)勢序列GTM的TCR受體的 S 1鏈蛋白，或δ 1鏈為TRD1G、γ 4鏈為TRG4G的胃癌組織來源腫瘤浸潤性Y δ T淋巴細胞(Y δ TIL)的TCR或編碼所述多肽、蛋白的基因。編碼所述多肽、蛋白的基因可存在于J. RT3-T3. 5細胞中，其中轉染有編碼所述胃癌組織來源腫瘤浸潤性Y δ T淋巴細胞(Y δ TIL)的TCR的基因的J. RT3-T3. 5細胞為 TCR γ 4 δ 1。需要的時候，在上述藥物中還可以加入一種或多種藥學上可接受的載體。所述載體包括藥學領域常規(guī)的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑和吸附載體等。本發(fā)明的藥物可以制成注射液或凍干粉劑等多種形式。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學領域的常規(guī)方法制備。上述蛋白藥物和基因藥物的用量可采用藥學領域中蛋白藥物和基因藥物的常規(guī)劑量，并可根據實際情況調整。一般情況下，本發(fā)明的TCR γ 4 δ 1細胞在注射劑量為 1. OX 105-2. OX IO5個/kg體重時，能夠延緩腫瘤的生長。本發(fā)明提供了人胃癌組織來源腫瘤浸潤性Y δ T淋巴細胞中δ 1鏈互補決定域3的優(yōu)勢序列GTM、含有該序列的TCR以及TCR受體轉染細胞。實驗證明，GTM肽可以與腫瘤細胞、腫瘤組織以及V δ IT細胞配體MICA蛋白特異性結合。通過Lentivirus表達系統(tǒng)建立了在J.RT3-T3.5表面表達含有人胃癌組織來源腫瘤浸潤性γ δ T淋巴細胞中δ 鏈互補決定域3的優(yōu)勢序列GTM的TCR的J. RT3-T3. 5細胞平臺，在細胞水平上模擬了 Y δ ITIL 及其識別殺傷腫瘤的機制(其中一條途徑為TCR識別腫瘤抗原，進而釋放細胞因子TNF α 來殺傷腫瘤細胞)，結果表明轉染細胞TCR γ 4 δ 1對腫瘤細胞的殺傷活性明顯增高，且這種殺傷作用是TCR依賴性的。本發(fā)明將在惡性腫瘤治療藥物的開發(fā)及其過繼治療中發(fā)揮重要作用，應用前景廣闊。下面結合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明。


圖1為4例胃癌來源TIL中γ δ TIL的比例圖2為一例胃癌來源Y δ TIL(W2-y δ TIL)中δ鏈的亞型分析圖3為PCR擴增W2- γ δ TIL的δ的V區(qū)全長序列的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果圖4為W2- γ δ TIL(A)和S2- γ δ TIL(B)對不同腫瘤細胞的殺傷效應圖5為流式細胞術檢測W2- γ δ TIL的表型圖6為GTM肽與不同腫瘤細胞、腫瘤組織及配體蛋白MICA的結合實驗結果圖7為PCR擴增的δ 1鏈全長基因和γ 4鏈全長基因的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果圖8為TCR γ 4 δ 1轉染細胞表面、δ TCR表達情況的流式細胞術檢測結果(pWPXL 轉染細胞為對照)圖9為TCR γ 4 δ 1轉染細胞對Daudi細胞的殺傷作用圖10為流式細胞術檢測TCRY4 δ 1轉染細胞(pWPXL轉染細胞為對照)分別與 anti-y δ TCR(A)和MICA蛋白(B)孵育后TNF α的表達情況
具體實施例方式本發(fā)明優(yōu)化了體外擴增培養(yǎng)腫瘤浸潤性Y δ T細胞(γ δ TIL)的條件，成功從4 例胃癌來源的腫瘤組織中培養(yǎng)出νδ 表型的γ δ TIL。體外對腫瘤細胞具有殺傷活性。本發(fā)明對體外擴增培養(yǎng)的腫瘤Y δ ITIL的⑶R3 δ 1序列進行分析，結果發(fā)現每例Y δ ITIL的⑶R3 δ 1序列具有相對優(yōu)勢特征；其中4例胃癌來源γ δ ITIL中3例的 CDR3區(qū)優(yōu)勢序列相同且共有優(yōu)勢序列較其它序列短。選取3例胃癌來源γ δ TIL共有的 ⑶R3 δ 1區(qū)優(yōu)勢序列GTM作為后續(xù)結構研究的基礎。人工合成GTM肽，利用流式細胞術、激光共聚焦掃描顯微鏡技術、ELISA、Sra、免疫組化方法在Y S IT-⑶R3肽水平證明GTM肽能與腫瘤細胞或組織區(qū)特異性結合。親和層析方法證實在腫瘤細胞總蛋白中缺失存在與GTM肽特異性結合的蛋白，即腫瘤抗原配體。成功從一例胃癌來源的Y STIL中擴增出完整的Y4鏈和δ 鏈全長，并通過 Lentivirus表達系統(tǒng)建立了在J. RT3-T3. 5細胞表面穩(wěn)定表達完整TCR γ 4 δ 1的平臺，以期在細胞水平上模擬Y S ITIL進而研究其識別腫瘤的分子機制。轉染細胞能夠殺傷腫瘤細胞且這種殺傷作用是TCR依賴性的，給功能基因組和未來基因治療應用帶來了廣闊的可能性。
實施例在以本發(fā)明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施例。下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。實施例1、人胃癌組織來源腫瘤浸潤性Y δ T淋巴細胞(tumor-infiltrating Y δ T cell, γ δ TIL)中δ 1鏈互補決定域3(⑶R3 δ 1)的優(yōu)勢序列GTM的獲得一、上皮來源腫瘤中Y δ TIL細胞的培養(yǎng)及鑒定1、Y δ TIL細胞的培養(yǎng)用anti-pan-TCR γ δ mAb (購自 Beckman Coulter)包被24孔板，5 μ g/孔，37°C孵育池。將無菌手術采集的胃癌、腎癌等實體瘤標本(上皮來源)在RPMI-1640培養(yǎng)基(含青霉素200 μ g/mL、鏈霉素100 μ g/mL、慶大霉素100 μ g/mL)中浸洗2次，IOmin/次；去除壞死組織、周圍血管及正常組織；將洗好的組織剪碎，用RPMI-1640培養(yǎng)基(含青霉素200 μ g/ mL、鏈霉素100 μ g/mL)洗2次，IOmin/次，然后重懸于RPMI-1640完全培養(yǎng)基中。將重懸的組織碎塊上板，添加IL-2(白細胞介素_2，購自北京瑞得合通藥業(yè)有限公司，200U/mL)； 37°C,5% CO2培養(yǎng)兩周，每3天換液一次。2、流式細胞儀檢測培養(yǎng)TIL細胞的TCR表型收集細胞，IOOOrpm離心5min，調每管細胞數至1 X IO6個。加ImL PBS洗液輕輕吹打，重懸細胞，IOOOrpm 離心 5min，洗 2 次。加抗體(FITC-anti-TCR γ δ/PE-anti-TCR α β 或者 FITC-anti-V δ UPE-anti-V δ 1、FITC-anti-V δ 3，購自 Beckman Coulter 或 Pierce) 及同型對照(FITC-mouse IgG/PE-mouse IgG，購自 Beckman Coulter 或 Pierce)，不加抗體管作陰性對照，4°C避光孵育30min。加ImL PBS洗液洗滌細胞，3000rpm離心5min，洗3次。 每管細胞加入4 V預冷的PBS固定液0. 5mL,輕輕吹打，懸起細胞，400目濾網過濾，4 V避光保存待測。部分檢測結果如圖1(橫坐標表示TCR γ δ，縱坐標表示TCR α β ；W2表示一例胃癌組織來源、3 111^(命名為12)，13表示一例胃癌組織來源、5 111^(命名為13)，14表示一例胃癌組織來源Y 3 111^(命名為14)，15表示一例胃癌組織來源γ 5 111^(命名為15)和圖2 (橫坐標表示V δ 1或V δ 2或V δ 3，縱坐標表示細胞數)所示，共成功培養(yǎng)多例不同腫瘤組織來源的Y S TIL，流式細胞術檢測上皮來源腫瘤中γ δ TIL細胞多數為δ 1型。符合文獻(Bennett WTHH,HHPandolfi FHH,HHGrove BHHH,HHHawes GEHH,HHBoyle LAHH,HHKradin RLHH, HHKurnick JTHH. Dominant rearrangements among human tumor infiltrating lymphocytes. Analysis of T cells derived from 32 patients with melanoma, lung, and renal cell carcinoma. HHCancer. HH 1992 May 1 ；69 (9) :2379-84.)報導的上皮來源的Y δ TIL細胞主要為V δ 1型，而外周血來源的γ δ TIL細胞主要為V δ 2型。二、γ δ ITIL CDR3 δ 1 區(qū)序列分析1、細胞總RNA的提取收集培養(yǎng)的不同來源(來源于胃癌、腎癌等實體瘤組織)的Y δ TIL細胞，PBS洗一次；按每5X IO6ceIlsAiL的比例加入Trizol試劑，反復吹打使細胞完全裂解，室溫孵育 5min ；移入經DEPC處理的EP管中，加入1/5體積的氯仿，劇烈振蕩15sec，室溫靜置^iin ； 4°C、10，OOOrpm離心15min，小心吸取上層水相至一個新管中；加入1/2體積的異丙醇，冰浴IOmin ；4°C、12，OOOrpm離心lOmin，棄上清，加入ImL 75%乙醇清洗沉淀，洗兩次。4°C、12，OOOrpm離心lOmin，吸棄上清，室溫干燥沉淀。用DEPC水溶解沉淀，立即用于逆轉錄或-80°C保存?zhèn)溆谩?、逆轉錄合成cDNA第一鏈用購自!Iomega的MMLV逆轉錄試劑盒，以步驟1提取的細胞總RNA為模板，反轉錄合成其cDNA第一鏈，方法為取RNA樣品2 μ g和Oligo (dT) 15(500 μ g/ml) 1 μ 1，補加DEPC 水至13μ 1，70°C IOmin ；取出后馬上置于冰浴中，依次加入5 XBuffer5 μ 1、dNTP (lOmmol/ L)5y 1、RNA酶抑制劑1μ 1、MMLV逆轉錄酶1μ 1，補加DEPC水至25 μ 1，42°C，60min進行逆轉錄反應；70°C 15min滅活酶活性。3、PCR 擴增 TCR δ 基因本步驟所使用的引物由擎科生物技術有限公司合成，引物濃度均為lOpmol/μ 1， 使用內參引物P-UP、P-DN以及γ STIL δ鏈V區(qū)(簡稱νδ)全長測序引物V δ 1、V δ 2、 νδ3、εδ。其中νδ為5'端特異性引物，與3'端引物CS配對使用，可擴增出⑶R3基因片段，引物序列如表1所示表1引物序列
權利要求
1.人胃癌組織來源腫瘤浸潤性YS T淋巴細胞中δ 1鏈互補決定域3的優(yōu)勢序列，是下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQID NO 1 ；2)將序列表中SEQID NO 1的氨基酸殘基序列經過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加并具有抗原識別作用的蛋白質。
2.含有權利要求1所述人胃癌組織來源腫瘤浸潤性YδΤ淋巴細胞中δ 1鏈互補決定域3的優(yōu)勢序列的TCR受體的δ 1鏈蛋白。
3.根據權利要求2所述的TCR受體的δ1鏈蛋白，其特征在于所述蛋白是下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQID NO 2 ；2)將序列表中SEQID NO 2的氨基酸殘基序列經過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加并具有抗原識別作用的蛋白質。
4.與權利要求3所述含有上述人胃癌組織來源腫瘤浸潤性γδ T淋巴細胞中δ 鏈互補決定域3的優(yōu)勢序列GTM的TCR受體的δ 1鏈相匹配的γ 4鏈，是下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQID NO 3 ；2)將序列表中SEQID NO 3的氨基酸殘基序列經過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加并具有抗原識別作用的蛋白質。
5.一種胃癌組織來源腫瘤浸潤性Y δ T淋巴細胞(γ δ TIL)的TCR，其δ 1鏈的氨基酸殘基序列如序列表中SEQ ID NO :2所示，其Y 4鏈的氨基酸殘基序列如序列表中SEQ ID NO 3所示。
6.編碼權利要求1所述人胃癌組織來源腫瘤浸潤性Yδ T淋巴細胞中δ 1鏈互補決定域3的優(yōu)勢序列GTM的基因，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQID NO 4的DNA序列；2)編碼序列表中SEQID NO 1的DNA序列；3)與序列表中SEQID NO :4限定的核苷酸序列具有90%以上同源性且具有抗原識別作用的核苷酸序列；4)在高嚴謹條件下可與序列表中的SEQID NO :4限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
7.編碼權利要求2所述含有上述人胃癌組織來源腫瘤浸潤性γδ T淋巴細胞中δ 1鏈互補決定域3的優(yōu)勢序列GTM的TCR受體的δ 1鏈蛋白的基因。
8.編碼權利要求3所述人胃癌組織來源腫瘤浸潤性γδΤ淋巴細胞中δ 1鏈互補決定域3的優(yōu)勢序列的TCR受體的δ 1鏈蛋白的基因，其特征在于所述基因是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQID NO 5的DNA序列；2)編碼序列表中SEQID NO 2的DNA序列；3)與序列表中SEQID NO :5限定的核苷酸序列具有90%以上同源性且具有抗原識別作用的核苷酸序列；4)在高嚴謹條件下可與序列表中的SEQID NO :5限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
9.編碼權利要求4所述人胃癌組織來源腫瘤浸潤性γδ T淋巴細胞中δ 1鏈互補決定域3的優(yōu)勢序列GTM的TCR受體的δ 1鏈TRDlG相匹配的、4鏈的基因，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQID NO 6的DNA序列；2)編碼序列表中SEQID NO 3的DNA序列；3)與序列表中SEQID NO :6限定的核苷酸序列具有90%以上同源性且具有抗原識別作用的核苷酸序列；4)在高嚴謹條件下可與序列表中的SEQID NO :6限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
10.編碼權利要求5所述胃癌組織來源腫瘤浸潤性γδ T淋巴細胞的TCR的基因，其 Sl鏈編碼基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID Ν0:5所示，其鏈編碼基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 6所示。
11.含有權利要求6-10任一項所述基因的表達載體、轉基因細胞系及宿主菌。
12.根據權利要求11所述的轉基因細胞系，其特征在于所述轉基因細胞系為轉基因 J.RT3-T3. 5細胞；可按照常規(guī)方法將編碼所述胃癌組織來源腫瘤浸潤性γ δ T淋巴細胞的 TCR基因轉染J.RT3-T3. 5細胞，如通過含有編碼所述胃癌組織來源腫瘤浸潤性Y δ T淋巴細胞的TCR基因的重組真核表達載體將編碼所述胃癌組織來源腫瘤浸潤性γ δ T淋巴細胞的TCR基因導入J. RT3-T3. 5細胞。
13.根據權利要求12所述的轉基因細胞系，其特征在于用于構建含有編碼所述胃癌組織來源腫瘤浸潤性Y ST淋巴細胞的TCR基因的重組真核表達載體的出發(fā)載體為 pRSV-rev, pLentilox 3. 7、pMDLg、pRRE、pffPXL 或 pLVX-DsRed 等慢病毒表達載體，優(yōu)選為 pWPXL;以pWPXL為出發(fā)載體，構建的攜帶所述胃癌組織來源腫瘤浸潤性γ δ T淋巴細胞的 TCR的δ 1鏈編碼基因的重組真核表達載體為pWPXL-δ 1，構建的攜帶所述胃癌組織來源腫瘤浸潤性Y δ T淋巴細胞的TCR的γ 4鏈編碼基因的重組真核表達載體為pWPXL- γ 4。
14.根據權利要求13所述的轉基因細胞系，其特征在于所述轉染有編碼所述胃癌組織來源腫瘤浸潤性Y δ T淋巴細胞的TCR基因的J. RT3-T3. 5細胞為TCR γ 4 δ 1轉染細胞。
15.權利要求1所述的人胃癌組織來源腫瘤浸潤性Yδ T淋巴細胞中δ 1鏈互補決定域3的優(yōu)勢序列，權利要求2或3所述的含有上述人胃癌組織來源腫瘤浸潤性Y δ T淋巴細胞中Sl鏈互補決定域3的優(yōu)勢序列的TCR受體的δ 1鏈蛋白，或者權利要求5所述的胃癌組織來源腫瘤浸潤性Y S T淋巴細胞的TCR在制備殺滅腫瘤細胞的藥物或制劑中的應用，所述腫瘤細胞與人B淋巴瘤細胞Daudi相關。
全文摘要
本發(fā)明公開了人胃癌組織來源腫瘤浸潤性γδT淋巴細胞中δ1鏈互補決定域3的優(yōu)勢序列GTM、含有該序列的TCR以及TCR受體轉染細胞。GTM氨基酸殘基序列如序列表中的SEQ ID NO1所示。實驗證明，GTM肽可以與腫瘤細胞、腫瘤組織以及Vδ1T細胞配體MICA蛋白特異性結合。通過Lentivirus表達系統(tǒng)建立了在J.RT3-T3.5表面表達含有人胃癌組織來源腫瘤浸潤性γδT淋巴細胞中δ1鏈互補決定域3的優(yōu)勢序列GTM的TCR的J.RT3-T3.5細胞平臺，在細胞水平上模擬了γδ1TIL及其識別殺傷腫瘤的機制，表明轉染細胞TCRγ4δ1對腫瘤細胞的殺傷活性明顯增高，且這種殺傷作用是TCR依賴性的。本發(fā)明將在惡性腫瘤治療藥物的開發(fā)及其過繼治療中發(fā)揮重要作用，應用前景廣闊。
文檔編號A61K38/10GK102532269SQ201110126369
公開日2012年7月4日 申請日期2011年5月16日 優(yōu)先權日2011年5月16日
發(fā)明者何維, 姜燕, 崔蓮仙 申請人:中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所