專利名稱：一種長(zhǎng)效生長(zhǎng)激素的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種聚乙二醇修飾的蛋白質(zhì)藥物。具體為雙端活化的聚乙二醇修飾生長(zhǎng)激素。
背景技術(shù)：
人生長(zhǎng)激素(hGH)是二十世紀(jì)20年代發(fā)現(xiàn)的由人垂體前葉嗜酸細(xì)胞分泌的重要激素，是由191個(gè)氨基酸殘基組成的單鏈、非糖化親水性蛋白，在第53-165和第182-189氨基酸之間各有一個(gè)二硫鍵連接，相對(duì)分子質(zhì)量約為21700道爾頓，pI4. 9-5. 2。用糜蛋白酶或胰蛋白酶處理生長(zhǎng)激素使其部分水解，活性并不喪失，可見(jiàn)生長(zhǎng)激素的活性并不需要整個(gè)分子。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，人生長(zhǎng)激素N-端的1 134氨基酸段肽鏈為活性所必需，C-端的一段肽鏈可能起保護(hù)作用，使生長(zhǎng)激素在血循環(huán)中不致被酶破壞。人生長(zhǎng)激素分子相當(dāng)穩(wěn)定，其活性在冰凍條件下可保持?jǐn)?shù)年，在室溫放置4 無(wú)變化。不同種屬的哺乳動(dòng)物的生長(zhǎng)激素之間有明顯的種屬特異性，只有靈長(zhǎng)類的生長(zhǎng)激素對(duì)人有活性。hGH的作用機(jī)理一般認(rèn)為是通過(guò)cAMP進(jìn)行的，在與靶細(xì)胞結(jié)合后能改變氨基酸及代謝產(chǎn)物的運(yùn)轉(zhuǎn)，誘導(dǎo)某些特異性蛋白質(zhì)和核酸的合成。1、人生長(zhǎng)激素的促生長(zhǎng)作用人生長(zhǎng)激素最明顯的作用是促進(jìn)骨、軟骨和組織的生長(zhǎng)。它能刺激蛋白質(zhì)和膠原的合成，促進(jìn)組織對(duì)循環(huán)系統(tǒng)中氨基酸的攝取和利用。人在幼年與成年時(shí)hGH的水平并無(wú)多大的差異(血清或血漿中檢測(cè)的常規(guī)參考值為成年男性< 2μ g/L ；成年女性< 10 μ g/ L ；兒童< 20 μ g/L)，但在人生長(zhǎng)發(fā)育的幼年期時(shí)，機(jī)體組織對(duì)hGH更為敏感，hGH對(duì)骨的促生長(zhǎng)作用取決于骺軟骨在成長(zhǎng)中的狀況。人在幼年和育成期時(shí)GH對(duì)四肢長(zhǎng)骨生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，故出生后至性成熟期先是身高增長(zhǎng)加快，隨后主要促進(jìn)軀干和脊柱的生長(zhǎng)；此時(shí)體長(zhǎng)的生長(zhǎng)較為迅速，至成年時(shí)四肢和脊柱的生長(zhǎng)已基本結(jié)束。hGH對(duì)維持骨的延長(zhǎng)雖屬必要， 但并非起直接作用。它是通過(guò)血中SM或稱硫酸化因子(Sulfationfactor)來(lái)實(shí)現(xiàn)。這是一種肽類激素，分子量4000Da，能促進(jìn)S042_、H-胸苷、H-尿苷和C-亮氨酸進(jìn)入軟骨，增加膠原組織和蛋白質(zhì)合成，促進(jìn)軟骨細(xì)胞、肝、肌肉和纖維母細(xì)胞的分裂。SM-C及其運(yùn)載蛋白的含量受hGH調(diào)控。2、hGH促進(jìn)蛋白質(zhì)合成hGH能促進(jìn)氨基酸進(jìn)入細(xì)胞，加速蛋白質(zhì)的合成，減少尿素、肌酸和氮的排出，促使體內(nèi)保持氮的動(dòng)態(tài)平衡。在蛋白質(zhì)的合成過(guò)程中，hGH可加強(qiáng)tRNA合成，促進(jìn)氨基酸的攝取，嘌呤霉素不能阻斷此效應(yīng)，提示hGH不是促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)形成某種新蛋白質(zhì)而是加強(qiáng)氨基酸的運(yùn)轉(zhuǎn)。胰島素能促進(jìn)氨基酸進(jìn)入細(xì)胞，但要在hGH存在時(shí)有此效應(yīng)。3、hGH對(duì)脂肪和糖代謝的影響hGH能促使動(dòng)物的脂肪分解，抑制葡萄糖氧化，減少葡萄糖的消耗、hGH對(duì)糖代謝作用較復(fù)雜。生理水平的hGH可刺激胰島素B細(xì)胞，引起胰島素分泌，加強(qiáng)葡萄糖的利用， 過(guò)量的hGH則抑制葡萄糖的利用。
人生長(zhǎng)激素提取并試用于兒童侏儒癥始于1958年。后經(jīng)不斷改進(jìn)產(chǎn)品純度和進(jìn)行臨床試驗(yàn)，在確認(rèn)臨床有效后自1975年起逐步在各國(guó)正式獲準(zhǔn)臨床應(yīng)用。由于提取的人生長(zhǎng)激素來(lái)于死人腦垂體，臨床用量難以保證，因此人們開(kāi)始嘗試用化學(xué)合成和基因重組方法生產(chǎn)人生長(zhǎng)激素。其中前法效率甚低，無(wú)實(shí)用價(jià)值。后法卻在美國(guó)Genentech公司等的努力下于1981年實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化。Genentech公司生產(chǎn)的基因重組人生長(zhǎng)激素商品名為Somatrem，在臨床試驗(yàn)中被證明與提取的人生長(zhǎng)激素生理活性完全相同。美國(guó)Li 1 Iy公司和丹麥Novo Nordisk公司等也相繼開(kāi)發(fā)成功了重組人生長(zhǎng)激素。人生長(zhǎng)激素的工業(yè)化生產(chǎn)現(xiàn)均已采用基因重組技術(shù)， 其一般方法是化學(xué)合成人生長(zhǎng)激素的DNA片段，再用分子克隆技術(shù)擴(kuò)增、克隆，獲得人生長(zhǎng)激素的完整基因，通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌，經(jīng)培養(yǎng)、發(fā)酵及后處理即得到目的蛋白純品。但溶解度低、穩(wěn)定性差、半衰期短、存在免疫原性等缺陷限制其給藥途徑和藥效的發(fā)揮。目前PEG修飾技術(shù)日趨成熟，修飾后的蛋白其溶解性和穩(wěn)定性增加，耐酶水解的能力增強(qiáng)，免疫原性減弱甚至消除，半衰期延長(zhǎng)，增加藥物的治療指數(shù)，擴(kuò)大臨床使用，生物利用度提高，毒副作用減小，熱穩(wěn)定性和機(jī)械穩(wěn)定性增加?；诖耍梦夜颈容^成熟的PEG 修飾技術(shù)平臺(tái)對(duì)重組人生長(zhǎng)激素進(jìn)行修飾。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種聚乙二醇修飾的雙價(jià)重組人生長(zhǎng)激素，該修飾產(chǎn)物不僅延長(zhǎng)了重組人生激素的半衰期，提高了穩(wěn)定性，降低了免疫原性，而且降低了該藥物的給藥次數(shù)和給藥劑量，一次給藥比需每天注射多次給藥具有高強(qiáng)的促進(jìn)動(dòng)物機(jī)體生長(zhǎng)的生物活性和長(zhǎng)效的藥理作用。本發(fā)明通過(guò)對(duì)PEG雙端活化，形成一種新的修飾劑ALD-PEG-ALD，方法參考文 獻(xiàn) J. MiltonHarris, Evelyn C.Struck. Synthesis and Characterrization of Poly (ethylene Glycol) Derivatives，采用該新型修飾劑對(duì)重組人生長(zhǎng)激素進(jìn)行修飾，獲得一種雙價(jià)蛋白質(zhì)修飾藥物GH-PEG-GH，其活性是GH的1. 7倍。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1雙端活化聚乙二醇獲得ALD-PEG-ALD以分子量為20000道爾頓藥用級(jí)聚乙二醇為底物，加入草酰氯，DMSO在-60°C 到-70°C反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后用三乙胺淬滅，二氯甲烷萃取，飽和的氯化鈉洗，濃縮至干，加乙醚析出固體抽濾干燥生成雙端活化的聚乙二醇ALD-PEG-ALD。實(shí)施例2重組人生長(zhǎng)激素的純化配制20mM ρΗ8· OTris-HCl,緩沖液Α,按菌體抽提緩沖液(g/ml)為1 20超聲破碎，超聲按工作Is間歇Is全程時(shí)間40min，1200-1600W，30°C過(guò)熱保護(hù)，破碎后按 4900rpm*35min離心，收集沉淀，洗滌包涵體。將包涵體溶于8M尿素，20mM Tris-HCl中，PH9. 0，在室溫下攪拌變性1小時(shí)，離心去除不溶物，上清用4倍體積的10%甘油，20mMTris-HCl PH8. 0稀釋，4°C過(guò)夜，用Q柱純化， GH單體和二聚體可用250mM NaCl洗脫，進(jìn)一步用S-200可將二聚體和單體分離，單體可用于修飾反應(yīng)。
實(shí)施例3修飾反應(yīng)GH純品濃度調(diào)節(jié)至5.0mg/ml，加入20mM氫硼氰化鈉，充分溶解，按摩爾比 GH ALD-PEG-ALD = 1 1，1 5，1 10加入 ALD-PEG_ALD，4°C反應(yīng)4hr，以確定兩種試劑的最佳比例。用非還原電泳檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)主要為雙修飾產(chǎn)物，掃描分析修飾率達(dá)到30%。 利用S-300分子篩層析將修飾物GH-PEG-GH與其他多修飾分子及未修飾的GH分離，目標(biāo)物質(zhì)可用非還原電泳檢測(cè)，分離后純品凍干保存。實(shí)施例4全身過(guò)敏反應(yīng)檢驗(yàn)豚鼠60只，雌雄各半，體重250_300g，均分為三組，將GH與GH-PEG-GH按人用劑量的三倍腹腔給藥，隔日一次，給藥三次，使其致敏，將GH與GH-PEG-GH按人用劑量的六倍與致敏后的第14天，21天分別于豚鼠小腿脛靜脈注射激發(fā)，30min內(nèi)觀察并記錄結(jié)果。表1豚鼠全身過(guò)敏試驗(yàn)級(jí)數(shù)判斷標(biāo)準(zhǔn)
權(quán)利要求
1.一種聚乙二醇修飾的生長(zhǎng)激素，其特征在于該聚乙二醇化生長(zhǎng)激素是以聚乙二醇為連接物的兩個(gè)生長(zhǎng)激素分子的串聯(lián)體。
2.權(quán)利要求1所述的聚乙二醇修飾的生長(zhǎng)激素，其特征在于生長(zhǎng)激素可以來(lái)源于動(dòng)物，也可以是基因重組人源生長(zhǎng)激素，優(yōu)選基因重組人源生長(zhǎng)激素。
3.權(quán)利要求1-2所述的聚乙二醇修飾的生長(zhǎng)激素，其特征在于所用的聚乙二醇雙端均經(jīng)過(guò)活化，并且都能與生長(zhǎng)激素共價(jià)交聯(lián)。
4.權(quán)利要求1-3所述的聚乙二醇修飾的生長(zhǎng)激素，其特征在于聚乙二醇兩端被活化成醛或酮結(jié)構(gòu)，優(yōu)選為醛結(jié)構(gòu)。
5.權(quán)利要求1-4所述的聚乙二醇修飾的生長(zhǎng)激素，其特征在于所用聚乙二醇分子量從200-200000道爾頓，優(yōu)選2000-10000道爾頓，更優(yōu)選為2000道爾頓。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種聚乙二醇修飾的雙價(jià)生長(zhǎng)激素，旨在提供一種免疫原性低、活性高、半衰期長(zhǎng)、給藥次數(shù)少、穩(wěn)定的蛋白質(zhì)藥物，主要用于治療生長(zhǎng)遲緩性疾病。其中的聚乙二醇雙端活化，通過(guò)與蛋白質(zhì)的游離氨基連接將兩個(gè)生長(zhǎng)激素分子連接成一個(gè)雙價(jià)的柔性分子。
文檔編號(hào)A61P43/00GK102190721SQ201010117330
公開(kāi)日2011年9月21日 申請(qǐng)日期2010年3月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月3日
發(fā)明者吳彥卓, 徐明波, 楊仲璠, 王俊玲 申請(qǐng)人:北京雙鷺立生醫(yī)藥科技有限公司, 北京雙鷺?biāo)帢I(yè)股份有限公司