專利名稱：能夠抑制肝癌生長轉(zhuǎn)移的靶向多肽spscvlp及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種能夠抑制肝癌生長轉(zhuǎn)移的靶向多肽SPSCVLP。
背景技術(shù)：
肝細(xì)胞肝癌(簡稱肝癌)是世界上最常見、惡性度最高的腫瘤之一，位居全球惡性腫瘤發(fā)病率的第6位、死因的第3位，在我國已成為惡性腫瘤的第2位死因。近幾十年來盡管對肝癌的基礎(chǔ)研究和診斷治療都取得了顯著進(jìn)步，但肝癌的總體預(yù)后仍然很差，并沒有顯著的改善，5年生存率僅為5%左右。能夠有治愈可能的治療方法是手術(shù)切除，但大多數(shù)肝癌首次診斷已屬晚期，適合手術(shù)治療的肝癌患者只有10%，即使手術(shù)切除后還存在復(fù)發(fā)的問題，術(shù)后5年復(fù)發(fā)率40%-60% ；而復(fù)發(fā)是術(shù)后死亡的首要原因，且大多數(shù)復(fù)發(fā)患者也不適合手術(shù)切除；對于不適合手術(shù)治療的肝癌患者，目前常用的方法是介入治療；由于我國肝癌患者大多伴有肝硬化，因此許多患者無法耐受介入治療的副作用。Sorafenib等靶向藥物雖然能延長部分患者的生存，但臨床副反應(yīng)顯著，導(dǎo)致部分患者不能耐受。近期的研究還表明Sorafenib會增加腫瘤細(xì)胞的侵襲性和肝內(nèi)播散。因此，臨床上迫切需要治療肝癌的新藥。此外，由于疾病本身的特點(diǎn)，治療肝癌的藥物需為低毒、靶向。鑒于肝癌治療的復(fù)雜性，目前臨床治療肝癌尚缺乏有效的藥物。已有的藥物療效還遠(yuǎn)不盡如人意，且具有明顯的毒副作用。多肽藥物除了能夠與其靶向的受體分子特異結(jié)合外，還具有分子量小，無免疫原性；只與特定受體結(jié)合發(fā)揮作用，靶向性較好；可人工合成，或基因工程生產(chǎn)等顯著優(yōu)點(diǎn)。但多肽在體內(nèi)容易被降解，半衰期短，導(dǎo)致針對腫瘤細(xì)胞本身的多肽不能產(chǎn)生明顯的腫瘤抑制作用。腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞作為腫瘤微環(huán)境中重要的間質(zhì)細(xì)胞對于維持腫瘤的生長發(fā)揮著重要的作用。同時腫瘤內(nèi)新生血管壁的高通透性非常有利于腫瘤細(xì)胞離開原發(fā)部分向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。因此，抑制腫瘤血管生成是目前腫瘤靶向治療研究的熱點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能夠抑制肝癌生長轉(zhuǎn)移的靶向多肽及其用途。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了一種靶向肝癌血管內(nèi)皮細(xì)胞的多肽，其特征在于，由氨基酸序列SPSCVLP:Ser- Pro- Ser- Cys- Val- Leu- Pro (絲氨酸-脯氨酸-絲氨酸-半胱氨酸-纈氨酸-亮氨酸-脯氨酸)組成。優(yōu)選地，所述的氨基酸序列的氨基端標(biāo)記FITC綠色熒光基團(tuán)。本發(fā)明還提供了上述靶向肝癌血管內(nèi)皮細(xì)胞的多肽在制備抑制肝癌生長轉(zhuǎn)移藥物中的用途。本發(fā)明的原理如下
腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞和正常血管內(nèi)皮細(xì)胞間存在差異，但如何發(fā)現(xiàn)兩者的差異是研究的難點(diǎn)之一首先血管內(nèi)皮細(xì)胞不容易分離純化；其次血管內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)會喪失很多固有的生物學(xué)屬性；再者確認(rèn)兩者具體的分子靶點(diǎn)存在困難。
本發(fā)明采用磁珠分選技術(shù)，在國際上首先利用CD105磁珠分選到肝癌血管內(nèi)皮細(xì)胞(TEC)和正常肝組織血管內(nèi)皮細(xì)胞(NEC)。在噬菌體展示技術(shù)的基礎(chǔ)上，采用體外快速差減篩選(BRASIL)方法篩選出針對TEC的多肽SPSCVLP。BLAST結(jié)果提示SPSCVLP和胎盤生長因子PlGF高度同源。研究表明，PlGF在正常組織中基本不表達(dá)，而在腫瘤環(huán)境中 P1GF-VEGFR1通路過度激活，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長轉(zhuǎn)移。體外實(shí)驗(yàn)表明SPSCVLP多肽能顯著抑制TEC的增殖、運(yùn)動和成管，并抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子VEGF刺激下TEC膜表面VEGF受體1的再分布和關(guān)鍵分子磷酸化水平。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示該多肽經(jīng)尾靜脈注射后能在肝癌局部富集，而肝組織中僅有微量的表達(dá)，靜脈給藥能抑制肝癌的生長，尤其是減少肺轉(zhuǎn)移。本發(fā)明的多肽SPSCVLP可以靶向肝癌血管內(nèi)皮細(xì)胞，主要抑制腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的PII-AKT信號通路，抑制其生物學(xué)功能，而對正常肝組織內(nèi)皮細(xì)胞無顯著影響。本發(fā)明的靶向多肽可以用于肝癌的實(shí)驗(yàn)研究包括體外觀察肝癌血管內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)功能和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察SPSCVLP多肽對肝癌生長轉(zhuǎn)移的抑制；早期診斷肝內(nèi)微小轉(zhuǎn)移灶和肺轉(zhuǎn)移灶；在評估毒副作用的前提下開展臨床1期實(shí)驗(yàn)研究，觀察臨床肝癌病人應(yīng)用該多肽治療后的毒副反應(yīng)和治療效果。


圖1為臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)、正常肝組織血管內(nèi)皮細(xì)胞(NECs)、肝癌血管內(nèi)皮細(xì)胞(TECs)在不同培養(yǎng)條件下增殖的比較圖2為TECs、HUVECs、NECs的運(yùn)動和成管能力比較圖； 圖3為CD105+TEC、HUVEC, NEC的黏附能力比較圖； 圖4為HUVEC、NEC、⑶105+TEC對氟尿嘧啶的抗性比較圖； 圖5為HUVEC、NEC、⑶105+TEC對阿霉素的抗性比較圖； 圖6為HUVEC、NEC、⑶105+TEC對索拉菲尼的抗性比較圖； 圖7為SPSCVLP抑制TEC成管并促使VEGF受體1重新分布圖； 圖8為VEGF刺激條件下腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGFR/AKT/Src通路關(guān)鍵分子的磷酸化水平圖9為FITC-SPSCVLP多肽體內(nèi)注射不同時間點(diǎn)在肝臟和腫瘤內(nèi)分布的差異圖； 圖10為SPSCVLP多肽對肝臟原為種植的人肝癌的抑制作用圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例來具體說明本發(fā)明。 實(shí)施例(1)采用磁珠分選技術(shù)，利用⑶105磁珠分選到肝癌血管內(nèi)皮細(xì)胞(TEC)和正常肝組織血管內(nèi)皮細(xì)胞(NEC)，并對二者的生物學(xué)特性進(jìn)行了鑒定，發(fā)現(xiàn)TEC和NEC存在著較多的生物學(xué)差異。如圖1 3所示，與NEC相比，TEC具有更強(qiáng)的血管生成、增殖和運(yùn)動以及黏附能力，如圖4 6所示，TEC對抗血管生成的靶向藥物以及化療藥物具有更強(qiáng)的耐受力。(2)通過BRASIL方法篩選隨機(jī)噬菌體肽庫首先將隨機(jī)噬菌體肽庫與NEC共育， 這樣得到的新噬菌體肽庫就消除了與NEC細(xì)胞表面結(jié)合的非特異性噬菌體，然后再篩選與TEC細(xì)胞表面結(jié)合的噬菌體。由于TEC和相應(yīng)的NEC具有相似的遺傳背景，從而消除了不同樣本由于遺傳背景不同而固有的性狀差異，將混雜因素減少到最低。研究顯示經(jīng)過3輪連續(xù)差減篩選，獲得9種肽序列，其中展示SPSCVLP肽的噬菌體被高度富集。(3)人工多肽合成及標(biāo)記人工合成SPSCVLP及其隨機(jī)對照肽，并在氨基端標(biāo)記 FITC綠色熒光，所述人工合成由上海生工生物工程有限公司按照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法合成，所述隨機(jī)對照肽為與本發(fā)明的靶向多肽氨基酸組分相同但隨機(jī)組合的多肽。(4)靶向多肽的體外實(shí)驗(yàn)
將篩選到的TEC (2 5代)和NEC (2 5代)分別在六孔板培養(yǎng)，加入25nmol/L的 SPSCVLP,分別采用MTT法檢測TEC和NEC的增殖，流式細(xì)胞儀Armexin V/PI雙染色法檢測細(xì)胞凋亡，劃痕實(shí)驗(yàn)和成管實(shí)驗(yàn)檢測TEC和NEC的運(yùn)動和成管能力。同時給予VEGF刺激， 激光共聚焦檢測VEGFRl的分別，Western blot方法檢測現(xiàn)有關(guān)鍵分子VEGFRl、AKT、ERK、 Src磷酸化水平。體外研究結(jié)果提示，如圖7所示，SPSCVLP能顯著抑制TEC的血管生成，對裸鼠原位種植的人肝癌的生長和轉(zhuǎn)移具有抑制作用。免疫熒光結(jié)果表明，在血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子作用下，TEC細(xì)胞表面的VEGFRl發(fā)生再分布，并成管腔樣排列，而SPSCVLP可以抑制VEGFRl 的再分布。進(jìn)一步提取純化膜蛋白檢測發(fā)現(xiàn)，SPSCVLP能顯著抑制細(xì)胞膜上VEGFRl的內(nèi)吞和循環(huán)，進(jìn)而影響VEGFRl在細(xì)胞膜上的再分布。如圖8所示，體現(xiàn)在信號通路上表現(xiàn)為 VEGFRU AKT, ERK、Src磷酸化水平顯著降低。(5)肝癌原位接種肺轉(zhuǎn)移模型的建立取對數(shù)生長期的MHCC-97H細(xì)胞，用含0. 25% 胰蛋白酶和0. 25%EDTA的消化液消化，制成濃度為5 X IO5個/0. 2ml單細(xì)胞懸液，接種于裸鼠右肩背部皮下。長至Icm大小后取出皮下瘤，切割成ImmX ImmX Imm大小，原位接種至裸鼠肝臟。(6)體內(nèi)分布實(shí)驗(yàn)取原位接種的MHCC-97H肝癌長至1. 5cm大小的裸鼠，尾靜脈注射FITC-SPSSCVLP 5nmol/L lOOul，注射前以及注射后不同時間點(diǎn)在體視熒光顯微鏡下觀察綠色熒光在肝臟以及腫瘤的分布。3小時后取出腎、心、脾觀察是否有熒光分布。體內(nèi)研究結(jié)果表明，如圖9所示，F(xiàn)ITC-SPSCVLP經(jīng)尾靜脈注射到原位種植人肝癌裸鼠體內(nèi)，主要分布在肝癌內(nèi)，而很少分布在肝臟上以及脾、腎、心、腸管等器官。(7)SPSCVLP抑制MHCC-97H生長和轉(zhuǎn)移取皮下接種MHCC-97H 10天的裸鼠，尾靜脈注射SPSCVLP，靜脈給藥，每只裸鼠200ul，每4天1次。動態(tài)檢測皮下瘤的大小。50天后收獲腫瘤和肺組織，稱量腫瘤重量，肺組織切片HE染色，計(jì)數(shù)肺轉(zhuǎn)移率。如圖10所示，SPSCVLP尾靜脈注射治療原位種植人肝癌裸鼠發(fā)現(xiàn)該多肽能部分抑制原位接種的腫瘤，對肺轉(zhuǎn)移則有顯著的抑制作用，同時還發(fā)現(xiàn)SPSCVLP治療組裸鼠的重量高于對照組。
權(quán)利要求
1.一種靶向肝癌血管內(nèi)皮細(xì)胞的多肽，其特征在于，由氨基酸序列SPSCVLP組成。
2.如權(quán)利要求1所述的靶向肝癌血管內(nèi)皮細(xì)胞的多肽，其特征在于，所述的氨基酸序列的氨基端標(biāo)記FITC綠色熒光基團(tuán)。
3.權(quán)利要求1所述的靶向肝癌血管內(nèi)皮細(xì)胞的多肽在制備抑制肝癌生長轉(zhuǎn)移藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明本發(fā)明提供了一種靶向肝癌血管內(nèi)皮細(xì)胞的多肽及用途，其特征在于，由氨基酸序列SPSCVLP組成。本發(fā)明的多肽SPSCVLP可以靶向肝癌血管內(nèi)皮細(xì)胞，主要抑制腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的PI3K-AKT信號通路，抑制其生物學(xué)功能，而對正常肝組織內(nèi)皮細(xì)胞無顯著影響。
文檔編號A61K38/08GK102432671SQ20111038983
公開日2012年5月2日 申請日期2011年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月30日
發(fā)明者任正剛, 孫惠川, 張博恒, 張巨波, 徐泱, 樊嘉, 湯釗猷 申請人:復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院