專利名稱：細(xì)胞因子IL-16及其調(diào)控的PepT1表達(dá)的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)治療領(lǐng)域，特別涉及一種IL-16分子靶點(diǎn)在炎癥性腸病治療中的作用，以及IL-16調(diào)控的PepTl表達(dá)在炎癥性腸病治療中的作用，以及IL-16誘導(dǎo)的魚(yú)類結(jié)腸炎模型的建立。
背景技術(shù)：
炎癥性腸病(IBD) —種常見(jiàn)和多發(fā)的慢性炎癥性疾病和自身免疫性疾病，隨著它在世界范圍內(nèi)發(fā)病率的逐年上升，這已經(jīng)成為一個(gè)世界性醫(yī)學(xué)衛(wèi)生難題。該病累及整個(gè)胃腸道和結(jié)腸粘膜，伴隨著一些常見(jiàn)的病理組織學(xué)特征如炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、隱窩炎、隱窩膿腫和肉芽腫等，并且會(huì)大大增加患者罹患結(jié)腸癌的風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)，炎癥性腸病還多伴有發(fā)熱、營(yíng)養(yǎng)障礙、貧血、關(guān)節(jié)炎、虹膜炎、肝病等明顯的腸外病變，由于缺乏有效規(guī)范的治療方法，病情反復(fù)發(fā)作，遷延不愈。因此，尋找有效的炎癥性腸病的治療的分子靶點(diǎn)顯得十分迫切。關(guān)于炎癥性腸病的病理學(xué)特征已經(jīng)有了一定研究，但對(duì)其復(fù)雜的病因和發(fā)病的分子機(jī)制仍然缺乏清楚的認(rèn)識(shí)?？傮w來(lái)說(shuō)，遺傳因素是患病基礎(chǔ)，免疫調(diào)節(jié)紊亂是發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵，其中涉及復(fù)雜的先天性免疫和適應(yīng)性免疫之間的相互調(diào)控，寄生菌群失調(diào)引起的持續(xù)性的免疫調(diào)節(jié)紊亂引起腸道粘膜損傷，對(duì)病原攻擊敏感性和反應(yīng)性增強(qiáng)，激活的免疫細(xì)胞及其產(chǎn)生的炎癥性細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、抗體、一氧化氮、蛋白酶和活性氧類都可以通過(guò)激活花生四烯酸途徑導(dǎo)致組織損傷破壞，目前有一些基因和因子被鑒定出來(lái)與炎癥性腸病可能相關(guān)，此外還涉及一系列環(huán)境因素在其中的作用。因此，對(duì)于炎癥性腸病發(fā)病過(guò)程中眾多復(fù)雜的因素及其中的具體分子機(jī)制的揭示還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，還需要進(jìn)一步研究。IL-16作為一種⑶4+免疫細(xì)胞的趨化因子最早發(fā)現(xiàn)于1982年，與其它具有淋巴細(xì)胞趨化活性的蛋白無(wú)同源性，廣泛分布于人淋巴組織T細(xì)胞、DC細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞中，同時(shí)也組成型表達(dá)于一些成纖維細(xì)胞和上皮類細(xì)胞中。IL-16的前體蛋白包含三個(gè)PDZ結(jié)構(gòu)域,被caspase3切割后形成僅含有一個(gè)PDZ結(jié)構(gòu)域的121aa的活性形式分泌到細(xì)胞外。一般，IL-16組成型表達(dá)于⑶4+和⑶8+T細(xì)胞中，但僅有⑶8+T細(xì)胞組成型表達(dá)成熟的IL-16。IL-16的趨化活性主要通過(guò)與其受體CD4分子的D4結(jié)構(gòu)域相互作用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制誘導(dǎo)各種不同的CD4+ T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞以及樹(shù)突細(xì)胞等在炎癥部位產(chǎn)生的趨化作用與免疫調(diào)節(jié)，同時(shí)上調(diào)IL-2R (⑶25)的表達(dá)，與IL-2協(xié)同作用來(lái)促進(jìn)⑶4+ T淋巴細(xì)胞的增生，上調(diào)HLA-DR的表現(xiàn)，短暫抑制TCR信號(hào)傳導(dǎo)可暫停趨化作用和抑制混合淋巴反應(yīng)(mixed lymphocyte reaction ;MLR),但并不依賴于TCR復(fù)合體。盡管有關(guān)IL-16在免疫系統(tǒng)中的趨化作用已經(jīng)有較為清楚的研究，但是關(guān)于IL-16在炎癥性腸病的發(fā)病中的作用及其功能機(jī)制還沒(méi)有報(bào)道。小肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白一PepTl (oligopeptide transporterl)在正常生理狀況下主要表達(dá)于小腸刷狀緣膜上的肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體，吸收蛋白質(zhì)降解產(chǎn)物二肽和三肽以及一些擬肽類藥物，但對(duì)于游離氨基酸和四肽及其以上的寡肽沒(méi)有吸收功能，這種小肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)具有轉(zhuǎn)運(yùn)速度快、耗能低、不易飽和的特點(diǎn)，它對(duì)于機(jī)體的營(yíng)養(yǎng)攝取和藥物代謝起著關(guān)鍵性作用。不同物種之間的P印Tl氨基酸序列具有高度同源性，基因結(jié)構(gòu)上具有23個(gè)外顯子，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)上具有12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和I個(gè)胞外結(jié)構(gòu)域。它的功能域是N端前四個(gè)氨基酸以及第七個(gè)和第九個(gè)跨膜區(qū)，這對(duì)底物結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)功能是必須的。正常情況下，PepTl特異性分布于小腸刷狀緣膜上，而在結(jié)腸不表達(dá)。鑒于PepTl在人體物質(zhì)吸收轉(zhuǎn)運(yùn)方面的重要作用，近年來(lái)，對(duì)于PepTl在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝以及藥物吸收方面的作用已有不少研究，對(duì)于新藥開(kāi)發(fā)提供了重要指導(dǎo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題 是提供細(xì)胞因子IL-16及其調(diào)控的轉(zhuǎn)運(yùn)體PepTl表達(dá)在作為治療炎癥性腸病的靶點(diǎn)的用途，以及用于研究炎癥性腸病的魚(yú)類模型。為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種細(xì)胞因子IL-16的用途作為治療炎癥性腸病的靶點(diǎn)。作為本發(fā)明的細(xì)胞因子IL-16的用途的改進(jìn)利用該靶點(diǎn)制備治療炎癥性腸病的藥物。作為本發(fā)明的細(xì)胞因子IL-16的用途的進(jìn)一步改進(jìn)IL-16的多克隆抗體IL-16Ab用于制備治療炎癥性腸病的藥物。本發(fā)明還同時(shí)提供了 IL-16調(diào)控的PepTl表達(dá)的用途作為治療炎癥性腸病的靶點(diǎn)。作為本發(fā)明的IL-16調(diào)控的PepTl表達(dá)的用途的改進(jìn)利用該靶點(diǎn)制備治療炎癥性腸病的藥物。作為本發(fā)明的IL-16調(diào)控的PepTl表達(dá)的用途的進(jìn)一步改進(jìn)針對(duì)PepTl基因的siRNA用于制備治療炎癥性腸病的藥物。在本發(fā)明中以IL-16為靶點(diǎn)，設(shè)計(jì)相關(guān)藥物降低IL-16的產(chǎn)生，或抑制IL-16的功能，進(jìn)而抑制PepTl在結(jié)腸非正常表達(dá)，從而改善腸道炎癥。在本發(fā)明中以IL-16調(diào)控P印Tl表達(dá)過(guò)程中的相關(guān)信號(hào)通路分子為靶點(diǎn)，設(shè)計(jì)相關(guān)制劑抑制相關(guān)信號(hào)通路或直接抑制PepTl基因表達(dá)，降低或抑制PepTl的表達(dá)，從而改善腸道炎癥。本發(fā)明還提供了一種可用于研究細(xì)胞因子在腸炎發(fā)生中作用的魚(yú)類模型IL_16誘導(dǎo)的河豚魚(yú)結(jié)腸炎模型。本發(fā)明的發(fā)明人在炎癥性腸病研究中，首次發(fā)現(xiàn)IL-16是一個(gè)與結(jié)腸炎癥密切相關(guān)的細(xì)胞因子，是抗腸炎治療的新分子靶點(diǎn)。表現(xiàn)在IL-16在腸道炎癥機(jī)體模型中的血清學(xué)水平明顯增高，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均證明IL-16能夠促進(jìn)結(jié)腸P印Tl的非正常表達(dá)上調(diào)(對(duì)應(yīng)的外在表現(xiàn)是腸道炎癥的發(fā)生，以MPO活性的上調(diào)為指標(biāo))。體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，在葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)的標(biāo)準(zhǔn)腸炎模型中，利用特異性抗體針對(duì)IL-16的封閉實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蝻@著抑制腸炎的發(fā)生和結(jié)腸P印Tl的非正常表達(dá)上調(diào)；體內(nèi)研究還發(fā)現(xiàn)，在IL-16誘導(dǎo)的腸炎模型中，針對(duì)上調(diào)的P印Tl，采用siRNA干擾技術(shù)，能顯著抑制IL-16誘導(dǎo)的結(jié)腸炎的發(fā)生。由此說(shuō)明，IL-16是腸炎過(guò)程中抑制P印Tl表達(dá)、改善腸道炎癥的靶點(diǎn)，并且通過(guò)調(diào)節(jié)IL-16誘導(dǎo)的PepTl表達(dá)，也是腸炎治療的有效途徑。本發(fā)明中，IL-16的多克隆抗體為公知技術(shù)，例如可根據(jù)Cell Research雜志2002年 12 卷上的文章 “Get effective polyclonal antisera in one month” 所述方法制備，再例如，人IL-16多克隆抗體可從sigma公司購(gòu)買。上述制備方法例如具體為IL_16的多克隆抗體可通過(guò)對(duì)新西蘭兔皮內(nèi)注射重組IL-16蛋白，然后取兔血清制備將300 μ g經(jīng)純化的IL-16重組蛋白與完全弗氏佐劑等體積混合乳化后，對(duì)新西蘭兔進(jìn)行多點(diǎn)皮內(nèi)注射；第一次注射后的第3天和第28天分別進(jìn)行相同方法的重復(fù)注射加強(qiáng)免疫(但佐劑改用不完全弗氏佐劑);第35天對(duì)兔子進(jìn)行耳緣靜脈采血，血液置37°C放置30min至血凝，2000g室溫離心IOmin后收集上層血清。此多抗效價(jià)經(jīng)檢測(cè)為I : 150000。重組IL-16 蛋白例如可根據(jù) Cellular and Molecular Life Sciences 雜志 2011年 68 卷上的文章“Identi cation of Treg-Iike cells in Tetraodon: insight intothe origin of regulatory T subsets during early vertebrate evolution，，所述方法實(shí)現(xiàn)。再例如，人的IL-16重組蛋白可從sigma公司購(gòu)買(貨號(hào)SRP3079)。本發(fā)明中，siRNA通過(guò)化學(xué)合成獲得，然后通過(guò)T4連接酶連接到經(jīng)Hind III和Bgl II雙酶切后的pSUPER質(zhì)粒上。pSUPER質(zhì)粒購(gòu)自于Oligoengine公司，具體操作根據(jù)其說(shuō)明書(shū)(貨號(hào)VEC-PRT-0002)進(jìn)行。本發(fā)明利用河豚魚(yú)和DSS誘導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)結(jié)腸炎模型 ，首次證明以IL-16為靶點(diǎn)，通過(guò)腹腔注射針對(duì)IL-16的特異性抗體，能顯著降低炎癥水平和結(jié)腸段P印Tl的非正常表達(dá)上調(diào)。本發(fā)明利用河豚魚(yú)IL-16誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型，首次證明以IL-16調(diào)控的P印Tl表達(dá)為靶點(diǎn)，通過(guò)肌肉注射針對(duì)P印Tl基因的PSUPER-SiRNA能夠抑制P印Tl表達(dá)，從而顯著降低炎癥水平。IL-16封閉/中和實(shí)驗(yàn)的抗體用量如下將河豚魚(yú)IL-16多克隆抗體用PBS稀釋，按6-20 μ g/g (體重)進(jìn)行腹腔注射。誘導(dǎo)河豚魚(yú)腸炎模型的IL-16用量如下將重組河豚魚(yú)IL-16蛋白溶于PBS緩沖液中，按0. 1-2. 5 μ g/g (體重)進(jìn)行肌肉注射。備注說(shuō)明該重組河豚魚(yú)IL-16蛋白可按照Wen, Y. , ff. Fang, L. X. Xiang, R.L. Pan, and J. Z. Shao. 2011. Identification of Treg-Iike cells in Tetraodon:insight into the origin of regulatory T subsets during early vertebrateevolution. Cell Mol Life Sci 68: 2615-2626.的方法制備。綜上所述，本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)IL-16能夠通過(guò)上調(diào)結(jié)腸P印Tl的表達(dá)誘導(dǎo)炎癥性腸病的發(fā)生，證明了以IL-16為分子靶點(diǎn)治療炎癥性腸病的有效性。


下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。圖I是河豚魚(yú)在DSS誘導(dǎo)的標(biāo)準(zhǔn)腸炎模型中IL-16的檢測(cè)以及實(shí)行IL-16抗體中和之后炎癥變化和PepTl表達(dá)檢測(cè)。圖I中，對(duì)照組(Control)表示口腔灌注PBS的對(duì)照組，DSS表示口腔灌注DSS的實(shí)驗(yàn)組，Ctl +Ab表示無(wú)關(guān)IgG對(duì)照。A，MPO檢測(cè)5%DSS連續(xù)灌注7天后結(jié)腸炎癥水平，證明DSS誘導(dǎo)的標(biāo)準(zhǔn)結(jié)腸炎模型建立成功。B，ELISA檢測(cè)DSS誘導(dǎo)的腸炎下，IL-16的血清水平。C，MPO檢測(cè)實(shí)施IL-16抗體中和之后，DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎癥水平變化。D，real-timePCR檢測(cè)實(shí)施抗體中和之后，結(jié)腸PepTl表達(dá)變化，以β-actin為內(nèi)參。*表示與control組比較差異顯著(P < 0.05)，#表示與control組比較差異極顯著(P < 0.01)。圖2是河豚魚(yú)誘導(dǎo)腸道炎癥發(fā)生以及P印Tl上調(diào)的檢測(cè)圖。圖2中，對(duì)照組(Control)表示注射PBS的對(duì)照組。A, MPO檢測(cè)IL-16誘導(dǎo)腸炎后 I 天(Dayl)、2 天(Day2)、4 天(Day4)、7 天(Day7)、14 天(Dayl4)和 21 天(Day21)結(jié)腸炎癥水平。B, real-time PCR 檢測(cè) IL-16 處理后 I 天(Dayl)、2 天(Day2)、4 天(Day4)、7 天(Day7)、14天(Dayl4)和21天(Day21)結(jié)腸PepTl表達(dá)，以β-actin為內(nèi)參。*表示與control組比較差異顯著(P < 0.05),**表不與control組比較差異極顯著(P < 0.01)。圖3是體外IL-16促進(jìn)結(jié)腸細(xì)胞P印Tl表達(dá)上調(diào)的檢測(cè)。圖3中，對(duì)照組(Control)表示不加因子的正常培養(yǎng)基對(duì) 照組，另一個(gè)是加IL-16的處理組。**表示與control組比較差異極顯著(P < 0.01)。圖4是注射pSUPER-siRNA后結(jié)腸P印Tl的表達(dá)情況和IL-16誘導(dǎo)的腸道炎癥水
平變化。圖4中，Control表示注射PBS的對(duì)照組，IL-16和pSUPER-siRNA分別表示注射IL-16 和 siRNA 組。A，注射后結(jié)腸P印Tl表達(dá)變化。B，注射后，結(jié)腸MPO活性變化，代表了結(jié)腸炎癥程度。**表示與control組比較差異極顯著(P < 0.01)。C，注射PBS后結(jié)腸組織病理切片HE染色。D，注射IL-16 +PBS后結(jié)腸組織病理切片HE染色。E，注射pSUPER-siRNA后，結(jié)腸組織病理切片HE染色。其中，測(cè)定時(shí)間點(diǎn)均為IL-16注射后第7天。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I :河豚魚(yú)DSS誘導(dǎo)的標(biāo)準(zhǔn)腸炎模型的制備和IL-16抗體中和實(shí)驗(yàn)利用5% (即50g/L) DSS (溶于無(wú)菌PBS)對(duì)河豚魚(yú)(體重約5g)誘導(dǎo)結(jié)腸炎，每條魚(yú)每天口腔灌注300-800 μ L，連續(xù)7天；在此期間魚(yú)在清潔的水中正常喂養(yǎng)，作為DSS處理組。河豚魚(yú)每天口腔灌注等量PBS (即，每條魚(yú)每天口腔灌注300-800 μ L，連續(xù)7天)，在此期間魚(yú)在清潔的水中正常喂養(yǎng)，作為對(duì)照組。對(duì)于抗體中和實(shí)驗(yàn)，利用5%DSS (溶于無(wú)菌PBS)對(duì)河豚魚(yú)(體重約5g)誘導(dǎo)結(jié)腸炎，每條魚(yú)每天口腔灌注300-800 μ L的同時(shí)，每條魚(yú)每天腹腔注射30-100 μ g IL_16Ab或無(wú)關(guān)對(duì)照兔IgG，連續(xù)7天；在此期間魚(yú)在清潔的水中正常喂養(yǎng)，分別作為DSS+IL-16Ab組和DSS+對(duì)照抗體組。實(shí)驗(yàn)I、取對(duì)照組、DSS處理組河豚魚(yú)結(jié)腸，檢測(cè)MPO活性以反映炎癥程度。盡量去除結(jié)腸組織的水分與雜物，稱重后放入加有300 μ L pH為7. 4的KPB緩沖液的Eppendorf管中，勻漿達(dá)到同質(zhì)化；再次加入ImL工作緩沖液(即pH為7. 4的KPB緩沖液)，IOOOOrpm,離心15min，去上清;加入含有50mM HTAB的KPB緩沖液(pH為7. 4) 300 μ L，混勻30s，加Λ 700 μ L Krebs液混勻；超聲20s，急速冷凍至_70°C或液氮中3min，室溫融化，重復(fù)此過(guò)程 3 次；IOOOOrpm,離心 IOmin ；取 100 μ L 上清加入含 0. 167mg/mL 的 O-dianisidinedihydrochloride和0. 0005% (體積濃度)的H2O2的Krebs液2. 9mL,用分光光度計(jì)測(cè)量460nm處的值，每隔30s記錄一次數(shù)值。按每隔120s的數(shù)值之差計(jì)算OD46tl的變化值。按經(jīng)驗(yàn)公式(OD46tl*13. 5) /魚(yú)腸重量計(jì)算MPO的相對(duì)值。結(jié)果如圖IA所示對(duì)照組的MPO的相對(duì)值為5. 02 UI/g，DSS處理組的MPO的相對(duì)值為35· 71 UI/g。實(shí)驗(yàn)2、取對(duì)照組、DSS處理 組河豚魚(yú)血，室溫孵育30min, 3000rpm離心15min,取上層血清。用包被緩沖液(Na2CO3 I. 59g，NaHCO3 2. 94g,用去離子水定容至1L，pH9. 6)按I ::10稀釋血清，按100 μ L/孔鋪于ELISA檢測(cè)板上，用100 μ L/孔2%BSA (即，20g/L的BSA)(含體積濃度0.1% Tween-20)作為封閉液，4°C封閉過(guò)夜。用IL-16 Ab在37°C孵育2小時(shí)，用1:10000稀釋的HRP標(biāo)記的抗兔IgG的二抗在37°C孵育I小時(shí)，然后用底物反應(yīng)液(ELISA底物液)在37°C反應(yīng)至顏色鮮明(即由無(wú)色變?yōu)槊黠@顯色)，以2M硫酸終止反應(yīng)后雙波長(zhǎng)(450nm和630nm)測(cè)吸光度。具體結(jié)果如圖IB所示DSS組血清IL-16含量較對(duì)照組上升5. 3倍。實(shí)驗(yàn)3、取對(duì)照組、DSS單獨(dú)處理組、DSS+對(duì)照抗體組、DSS+IL-16 Ab組河豚魚(yú)結(jié)腸，按上述實(shí)驗(yàn)I的方法測(cè)MPO活性，檢測(cè)中和IL-16之后，結(jié)腸炎癥水平變化。結(jié)果如圖IC所示對(duì)照組的MPO的相對(duì)值為4. 01 UI/g,DSS單獨(dú)處理組的MPO的相對(duì)值為28. 86 UI/g,DSS+對(duì)照抗體組的MPO的相對(duì)值為32. 15 UI/g,DSS+IL-16 Ab 組的 MPO 的相對(duì)值為9· 59 UI/g 。實(shí)驗(yàn)4、取對(duì)照組、DSS單獨(dú)處理組、DSS+對(duì)照抗體組、DSS+IL-16 Ab組河豚魚(yú)結(jié)腸組織，用TRizol( Invetigen)提取總RNA,提取方法按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,然后用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒RNAPCR kit (AMV) Ver3. O (TaKaRa)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。Real-time PCR檢測(cè)P印Tl表達(dá)水平，引物序列為AGCCTTTAACCTGAGCCTGGGGCTT(sense)，GATACGCTGACATGTTGTTGGGGAC(antisense)，由上海英俊公司合成。結(jié)果如圖ID所示DSS單獨(dú)處理組的P印Tl mRNA水平是對(duì)照組的2. 76倍，DSS+對(duì)照抗體組的P印TlmRNA水平是對(duì)照組的2. 82倍，DSS+IL-16 Ab組的P印Tl mRNA水平是對(duì)照組的I. 25倍。上述結(jié)果表明DSS能夠成功誘導(dǎo)河豚魚(yú)的標(biāo)準(zhǔn)結(jié)腸炎模型，并且在腸炎狀態(tài)下，IL-16的血清含量顯著上調(diào)，這與人類流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果一致。實(shí)施IL-16抗體中和之后，炎癥水平顯著降低，并且同時(shí)結(jié)腸P印Tl的非正常表達(dá)上調(diào)也得到明顯抑制。實(shí)施例2 :河豚魚(yú)腸炎模型的制備和PepTl表達(dá)水平檢測(cè)利用IL-16 (體外表達(dá)的重組河豚魚(yú)IL-16)對(duì)黑青斑河豚魚(yú)誘導(dǎo)結(jié)腸炎，建立結(jié)腸炎模型，注射后魚(yú)在清潔的水中正常喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)I、取對(duì)照(注射100μ 1PBS)、損傷I天、2天、4天、7天、14天和21天河豚魚(yú)結(jié)腸，檢測(cè)MPO活性以反應(yīng)炎癥程度。盡量去除結(jié)腸組織的水分與雜物，稱重后(即取
O.02-0. 05g)放入加有300 μ L Krebs液的Eppendorf管中，勻衆(zhòng)達(dá)到同質(zhì)化；加至ImL工作緩沖液，IOOOOrpm,離心15min,去上清；加入含有50mM HTAB的Krebs液300 μ L，混勻30s，加入700 μ L Krebs液混勻；超聲20s，急速冷凍至_70°C或液氮中3min，室溫融化，重復(fù)此過(guò)程 3 次；IOOOOrpm,離心 IOmin ;取 100 μ L 上清加入含 O. 167mg/mL 的 O-dianisidinedihydrochloride和O. 0005% (體積比)的H2O2的Krebs液2. 9mL,用分光光度計(jì)測(cè)量460nm處的值，每隔30s記錄一次數(shù)值。按每隔120s的數(shù)值之差計(jì)算OD46tl的變化值。按經(jīng)驗(yàn)公式(OD46tl*13. 5) /魚(yú)腸重量計(jì)算MPO的相對(duì)值。結(jié)果如圖2A所示對(duì)照組的MPO的相對(duì)值為5· 63 UI/g損傷I天組的MPO的相對(duì)值為9· 36 UI/g損傷2天組的MPO的相對(duì)值為18. 14 UI/g
損傷4天組的MPO的相對(duì)值為31· 98 UI/g損傷I天組的MPO的相對(duì)值為69. 64 UI/g損傷14天組的MPO的相對(duì)值為46. 38 UI/g損傷21天組的MPO的相對(duì)值為27· 97 UI/g。實(shí)驗(yàn)2、取對(duì)照、損傷I天、2天、4天、7天、14天和21天河豚魚(yú)結(jié)腸組織,用TRizol(Invetigen)提取總RNA,提取方法按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，然后用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒RNA PCR kit(AMV) Ver3. O (TaKaRa)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。Real-time PCR檢測(cè)P印Tl表達(dá)水平，引物序列為AGCCTTTAACCTGAGCCTGGGGCTT (sense),GATACGCTGACATGTTGTTGGGGAC (antisense),由上海英俊公司合成。結(jié)果如圖2B所示損傷I天組的P印Tl mRNA水平是對(duì)照組的3. 21倍損傷2天組的P印Tl mRNA水平是對(duì)照組的7. 54倍損傷4天組的P印Tl mRNA水平是對(duì)照組的15. 77倍損傷7天組的P印Tl mRNA水平是對(duì)照組的32. 38倍損傷14天組的P印Tl mRNA水平是對(duì)照組的4. 21倍損傷21天組的P印Tl mRNA水平是對(duì)照組的4. 22倍。上述結(jié)果表明IL_16可以顯著誘導(dǎo)結(jié)腸炎癥的發(fā)生，成功建立細(xì)胞因子誘導(dǎo)的河豚魚(yú)結(jié)腸炎模型。并且正常結(jié)腸幾乎檢測(cè)不到PepTl表達(dá)，炎癥過(guò)程中，PepTl易于被IL-16誘導(dǎo)且持續(xù)有表達(dá)。實(shí)施例3 :體外實(shí)驗(yàn)證明IL-16促進(jìn)P印Tl表達(dá)用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)腸細(xì)胞系SW480(g卩，人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480)，向體外培養(yǎng)的SW480細(xì)胞中分別加入25-100ng/ml IL-16，刺激三天后，提取細(xì)胞總mRNA，以不加IL-16的培養(yǎng)細(xì)胞為對(duì)照組，RT-PCR和real-time PCR檢測(cè)P印Tl基因表達(dá)。結(jié)果如圖3所示加入IL-16之后，PepTl mRNA水平是對(duì)照組的I. 02倍。上述結(jié)果表明IL_16處理可以顯著誘導(dǎo)PepTl表達(dá)。實(shí)施例4 :siRNA抑制P印Tl表達(dá)，降低腸炎程度上述IL-16誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型河豚魚(yú)，IL-16注射后第二天，肌肉注射針對(duì)P印Tl基因的pSUPER-siRNA連續(xù)5天(每天的注射量為12. 5ug)，序列為5，-GATCCCCTGGAAGCACTCGCAACACCTTCAAGAGAGGTGTTGCGAGTGCTTCCATTTTTA-3，(正向)
5’-AGCTTAAAAATGGAAGCACTCGCAACACCTCTCTTGAAGGTGTTGCGAGTGCTTCCAGGG-3’ (反向)上述siRNA序列由上海英俊生物公司合成，正向和反向鏈分別溶解在退火緩沖液(10 mM Tris-HCl, pH 7.5，I mM EDTA, I OOmM NaCl)中至終濃度 10mM，取正向和反向鏈的DNA溶液各5 μ I混合均勻后按如下程序進(jìn)行退火反應(yīng)90°C，4 min ；70°C, 10 min ;自然冷卻至10°C。取5μ I上述退火產(chǎn)物與1μ I經(jīng)Hind III和Bgl II雙酶切的pSUPER質(zhì)粒混合，加入I μ I Τ4連接酶(購(gòu)于生工生物公司)、1 μ I的10 X連接緩沖液(由Τ4連接酶試劑盒提供)和2μ1 ddH20在16°C進(jìn)行連接反應(yīng)15h。將該連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化(“轉(zhuǎn)化”屬于公知技術(shù))ToplO大腸桿菌，挑取陽(yáng)性克隆擴(kuò)增，用質(zhì)粒中抽試劑盒提取質(zhì)粒，即得到pSUPER-siRNA質(zhì)粒。12. 5 μ g的pSUPER-siRNA溶解在IOO ul PBS中通過(guò)背鰭下肌肉注射，每天一次(每次的用量為12. 5 μ g的pSUPER-siRNA溶解在IOOul PBS中)，連續(xù)注射五天，同時(shí)對(duì)其他同樣腸損傷的河豚魚(yú)注射IOOul PBS作為對(duì)照。注射IL-16后的第七天，取河豚結(jié)腸組織，進(jìn)行MPO測(cè)定和組織切片H E染色判斷炎癥水平差異，進(jìn)行RT-PCR和real-time PCR檢測(cè)PepTl表達(dá)。結(jié)果如圖4A所示IL-16組的P印Tl mRNA水平是對(duì)照組的33. 32倍；IL-16+siRNA組的P印Tl mRNA水平是對(duì)照組的9. 05倍。如圖4B所示對(duì)照組的MPO的相對(duì)值為4. 91 UI/g ;IL_16組的MPO的相對(duì)值為42.67 UI/g ;IL-16+siRNA 組的 MPO 的相對(duì)值為11.07 UI/g。組織切片HE染色結(jié)果顯示，對(duì)照組(如圖4C):腸粘膜完整，未見(jiàn)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。IL-16組(如圖4D):絨毛明顯受損變鈍，中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯；IL-16+siRNA組(如圖4E):炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，粘膜損傷程度明顯減輕。上述結(jié)果表明siRNA注射組河豚，PepTl基因表達(dá)明顯受到抑制，同時(shí)與對(duì)照組相比，MPO活性顯著下降，組織學(xué)損傷顯著改善，表明炎癥程度得到明顯降低。這說(shuō)明注射針對(duì)河豚PepTl基因的siRNA能夠抑制PepTl表達(dá)，從而有效抑制該模型中河豚魚(yú)結(jié)腸炎癥的發(fā)生。并且證明了 IL-16調(diào)控的P印Tl表達(dá)可以作為藥物設(shè)計(jì)的分子靶點(diǎn)。最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個(gè)具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.細(xì)胞因子IL-16的用途，其特征是作為治療炎癥性腸病的靶點(diǎn)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的細(xì)胞因子IL-16的用途，其特征是利用所述靶點(diǎn)制備治療炎癥性腸病的藥物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的細(xì)胞因子IL-16的用途，其特征是IL-16的多克隆抗體IL-16AL·用于制備治療炎癥性腸病的藥物。
4.IL-16調(diào)控的PepTl表達(dá)的用途，其特征是作為治療炎癥性腸病的靶點(diǎn)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的IL-16調(diào)控的PepTl表達(dá)的用途，其特征是利用所述靶點(diǎn)制備治療炎癥性腸病的藥物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的IL-16調(diào)控的P印Tl表達(dá)用途，其特征是針對(duì)PepTl基因的siRNA用于制備治療炎癥性腸病的藥物。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種細(xì)胞因子IL-16的用途，作為治療炎癥性腸病的靶點(diǎn)，利用該靶點(diǎn)可用于制備治療炎癥性腸病的藥物。本發(fā)明還同時(shí)公開(kāi)了IL-16調(diào)控的PepT1表達(dá)的用途，作為治療炎癥性腸病的靶點(diǎn)，利用該靶點(diǎn)可用于制備治療炎癥性腸病的藥物。
文檔編號(hào)A61K48/00GK102872459SQ20121021161
公開(kāi)日2013年1月16日 申請(qǐng)日期2012年6月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月24日
發(fā)明者邵健忠, 王萍, 項(xiàng)黎新, 董偉仁, 潘若浪 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)