專(zhuān)利名稱(chēng)：為MAGE－Xp家族成員的分離的核酸分子及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及編碼腫瘤排斥抗原前體的核酸分子。具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一些基因，這些基因的腫瘤排斥抗原前體特別地被加工成至少一種腫瘤排斥抗原。所說(shuō)的腫瘤排斥抗原前體似乎不和其它已知的腫瘤排斥抗原前體的編碼序列密切相關(guān)，并且在人類(lèi)X染色體的Xp區(qū)中分離了其編碼序列，和與其最密切相關(guān)的基因相反，后者在Xq區(qū)發(fā)現(xiàn)。
背景和現(xiàn)有技術(shù)哺乳動(dòng)物免疫系統(tǒng)識(shí)別并對(duì)異源物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)的過(guò)程是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程。此系統(tǒng)的重要方面是T淋巴細(xì)胞或“T細(xì)胞”應(yīng)答，這種應(yīng)答需要T細(xì)胞識(shí)別并和細(xì)胞表面分子(稱(chēng)為人類(lèi)白細(xì)胞抗原(“HLA”)或主要組織相容性復(fù)合物(“MHCs”)和肽的復(fù)合物相互作用。這些肽來(lái)自由也呈遞HLA/MHC分子的細(xì)胞加工的大分子。關(guān)于這一點(diǎn)，參見(jiàn)Male等，高級(jí)免疫學(xué)(J.P.Lipincott公司，1987)，尤其是6-10章。T細(xì)胞和HLA/肽復(fù)合物的相互作用是受限制的，需要對(duì)HLA分子和肽的特定組合特異性的T細(xì)胞。假如特定的T細(xì)胞不存在，既使它的配對(duì)復(fù)合物存在，也沒(méi)有T細(xì)胞應(yīng)答。同樣，如果缺乏特定的復(fù)合物而T細(xì)胞存在，也沒(méi)有應(yīng)答。這種機(jī)制和免疫系統(tǒng)對(duì)外來(lái)物質(zhì)的反應(yīng)、自體免疫病理和細(xì)胞異常反應(yīng)有關(guān)。大量的工作集中在蛋白質(zhì)加工成HLA結(jié)合肽的機(jī)制上。關(guān)于這一點(diǎn)，參見(jiàn)Barnaga，科學(xué)257880(1992)；Fremont等，科學(xué)257919(1992)；Matsumura等，科學(xué)257927(1992)；Latron等，科學(xué)257964(1992)。
癌癥中也已經(jīng)預(yù)示了T細(xì)胞識(shí)別細(xì)胞異常的機(jī)制。例如，在PCT申請(qǐng)PCT/US92/04354(1992年5月22日申請(qǐng)，1992年11月26日出版，本文一并參考)中公開(kāi)了一個(gè)基因家族，其被加工成肽，肽隨后在細(xì)胞表面表達(dá)，導(dǎo)致通過(guò)特定的CTLs胞溶性T-淋巴細(xì)胞或以下所稱(chēng)的“CTLs”溶解腫瘤細(xì)胞。所說(shuō)的基因編碼“腫瘤排斥抗原前體“或“TRAP”分子，來(lái)源于它們的肽稱(chēng)為“腫瘤排斥抗原”或是“TRAs”。參見(jiàn)Traversari等，免疫遺傳學(xué)35145(1992)；關(guān)于這個(gè)基因家族的其它信息，參見(jiàn)van der Bruggen等，科學(xué)2541643(1991)。也參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)807,043(1991年12月12日申請(qǐng)，現(xiàn)為美國(guó)專(zhuān)利5,342,774，其全部?jī)?nèi)容本文一并參考)。在此專(zhuān)利中，公開(kāi)了“MAGE”腫瘤排斥抗原前體家族。
在美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)938,334(現(xiàn)為美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)＿，1995年4月15日，公開(kāi)內(nèi)容本文一并參考)中解釋了MAGE-1基因編碼腫瘤排斥抗原前體，這種前體加工成由HLA-A1分子呈遞(presented by)的九肽(nonapeptides)。和HLA-A1結(jié)合的這種九肽遵循滿足基序的結(jié)合“規(guī)則”。這一點(diǎn)參見(jiàn)例如PCT/US93/07421；Falk等，自然351290-296(1991)；Engelhard，免疫學(xué)年度綜述12181-207(1994)；Ruppert等，細(xì)胞74929-937(1993)；Rotzschke等，自然348252-254(1990)；Bjorkman，自然329512-518(1987)；Traversari等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志1761453-1457(1992)。這些參考文獻(xiàn)指出，如果已知特定肽針對(duì)特定HLA分子的特異性，可以預(yù)料特定肽和一種HLA分子，而不是其它分子結(jié)合。由于不同個(gè)體具有不同的HLA表型，所以這一點(diǎn)是重要的。因此，盡管鑒定特定肽作為特定HLA分子的配對(duì)物具有診斷和治療效果，但這些只和具有這種特定的HLA表型的個(gè)體有關(guān)。由于細(xì)胞異常不僅限于一種特定的表型，并且定向治療需要一些異常細(xì)胞表型的知識(shí)，所以需要在此領(lǐng)域進(jìn)行進(jìn)一步的工作。
美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)008,446(1993年1月22日申請(qǐng)，本文一并參考)公開(kāi)了MAGE-1表達(dá)產(chǎn)物加工成第二種TRA的事實(shí)。這第二種TRA由HLA-Cw*1601分子呈遞。此說(shuō)明書(shū)顯示一個(gè)給定的TRAP能生產(chǎn)多個(gè)TRAs，每一個(gè)都滿足和MHC分子結(jié)合的基元規(guī)律。
美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)994,928(1992年12月22日申請(qǐng)，本文一并參考)指出了由一些正常細(xì)胞(如黑素細(xì)胞)產(chǎn)生的酪氨酸酶，在腫瘤細(xì)胞中加工產(chǎn)生由HLA-A2分子呈遞的肽。
美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)08/032,978(1993年3月18日申請(qǐng)，其全部?jī)?nèi)容本文一并參考)教導(dǎo)了不是來(lái)源于酪氨酸酶的一個(gè)第二種TRA由HLA-A2分子呈遞。此TRA來(lái)源于TRAP，但其由非MAGE基因編碼。此公開(kāi)內(nèi)容表明特定的HLA可以呈遞(present)不同來(lái)源的TRAs。
美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)08/079,110(1993年6月17日申請(qǐng)，本文一并參考)描述了一種無(wú)關(guān)的腫瘤排斥抗原前體，即所謂的“BAGE”前體。此BAGE前體和MAGE家族無(wú)關(guān)。
美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)08/096,039和08/250,162(二者的內(nèi)容本文一并參考)也公開(kāi)了無(wú)關(guān)的TRAP前體GAGE。
上文引用的這些論文、專(zhuān)利、專(zhuān)利申請(qǐng)顯示的工作在很大程度上是針對(duì)MAGE基因家族的和非相關(guān)BAGE、GAGE和DAGE基因的，表明存在由細(xì)胞表達(dá)的不同的、另外的腫瘤排斥抗原前體。
已發(fā)現(xiàn)還存在另一個(gè)腫瘤排斥抗原前體的基因家族。這些核酸分子和MAGE家族同源，但這種同源性對(duì)通過(guò)和如PCT申請(qǐng)PCT/US92/04354和美國(guó)專(zhuān)利5,342,774中所提出的現(xiàn)有的MAGE家族成員在嚴(yán)格條件下雜交來(lái)鑒定Xp家族成員是不夠的，并且發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的這些分離的核酸分子全部在X染色體的Xp臂上，相反以前鑒定的MAGE家族成員則全部在Xq臂上發(fā)現(xiàn)。這樣，本發(fā)明涉及編碼MAGE-Xp腫瘤排斥抗原前體的分離的核酸分子及其用途。
下面公開(kāi)內(nèi)容進(jìn)一步解釋了本發(fā)明。
優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述實(shí)施例1Muscatelli等在“自然”372672-676(1994)以及Muscatelli等在美國(guó)科學(xué)院學(xué)報(bào)(5/95)(在出版中)中已描述了粘粒D5和4695，其公開(kāi)內(nèi)容本文一并參考。這些粘粒含有X染色體的Xp臂，將這些粘粒用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI、BamHI、HindIII和PstI消化，消化完成之后，將DNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，接著在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行瓊脂糖電泳遷移。
然后，在雜交實(shí)驗(yàn)中利用基于SEQ ID NO1(即Xp1序列)的探針，探針的長(zhǎng)度為大約0.45千堿基，并且含有第一外顯子(總共73個(gè)堿基對(duì))的41個(gè)堿基對(duì)、整個(gè)第二外顯子和第三外顯子(總共1603個(gè)堿基對(duì))的299個(gè)堿基對(duì)。這種本文稱(chēng)為“Xp1”而其它文獻(xiàn)稱(chēng)為“Xp”的序列，可以在Muscatelli等的“美國(guó)科學(xué)院學(xué)報(bào)”(5/59)(正在出版)中也可找到，而且，所說(shuō)序列參照登記號(hào)emb 82539在EMBL序列數(shù)據(jù)庫(kù)中找到?？梢栽诓贿t于1995年2月7日得到。
為了制備0.4kb探針，使用下列引物，即SEQ ID NO11和SEQ ID NO12在Xp1 cDNA上進(jìn)行PCR。
5′-GTGGTGTCCAGCAGTGTCTC-3’5′-GTCAGATTGCCTACATGACACAG-3’具體地說(shuō)，將此DNA用20×SSC(SSC＝0.15M NaCl、0.015M檸檬酸鈉，pH值為7)轉(zhuǎn)移到尼龍膜之前，將其用NaOH變性并在凝膠上中和。轉(zhuǎn)移后，將膜在室溫下于6×SSC中沖洗5分鐘，置于80℃下暴露1小時(shí)，然后，在65℃下在6×SSC、10×Denhardt溶液(0.02％Ficoll，0.02％聚乙烯吡咯烷酮，0.02％BSA)中預(yù)處理4小時(shí)。
將這種膜在3.5×SSC、1×Denhardt溶液、25mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)、0.5％SDS、2mM EDTA和3×106cpm/mlα32P-CTP放射性標(biāo)記探針中雜交。雜交在65℃下進(jìn)行18小時(shí)。然后將膜在65℃下，在2×SSC、0.5％SDS、IxDenhardt的溶液中洗滌4次每次1小時(shí)；再在0.2×SSC、0.1％SDS中洗滌30分鐘；然后在0.1×SSC、0.1％SDS中洗滌30分鐘。利用柯達(dá)X-ARS膠片將此膜用柯達(dá)X-ARS膠片和柯達(dá)X-Omatic精細(xì)增感屏放射自顯影。
雜交后，觀察到不同強(qiáng)度的幾種信號(hào)。其中，分離了來(lái)源于粘粒4965的三個(gè)EcoRI片段，它們的長(zhǎng)度分別為1.5、2.2、2.5kb，然后將它們克隆到載體pTZ19R中，以便測(cè)序。部分測(cè)序表明，每個(gè)片段含有和Xp1的第三外顯子同源的序列。這三種序列相對(duì)于Xp1的同源性是75％、60％和80％。以下稱(chēng)為基因MAGE-Xp2、MAGE-Xp3和MAGE-Xp4，分別如SEQ ID NO2、3和4所示。
前面的描述，給技術(shù)人員提供了很有價(jià)值的工具。首先，此實(shí)施例鑒定了編碼MAGE-Xp腫瘤排斥抗原前體的分離的核酸分子以及其互補(bǔ)的核酸分子。已知DNA以雙鏈的形式存在，并且兩條鏈的每一條和另一條互補(bǔ)。核酸雜交技術(shù)已發(fā)展到這種程度，即給定DNA的一條鏈，技術(shù)人員可以分離或合成它的互補(bǔ)鏈。本發(fā)明特別包括使技術(shù)人員鑒定X染色體(特別是Xp元件)以及此染色體上缺損的雙鏈現(xiàn)象。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員利用標(biāo)準(zhǔn)方法可以進(jìn)行這種分析。例如，通過(guò)公知的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，技術(shù)人員可以利用下列引物用于鑒別Xp25’-TAAAAAAGGTGCCAAGAGCCAC-3’(SEQ ID NO5)；5’-TGAGGCCCTCAGAGGCTTC-3’(SEQ ID NO6)。
用于鑒別Xp35’-AGTCTGCTGGTAGGTCACGTA-3’(SEQ ID NO7)；5’-TCAGGAACTGCACCAACATATTT-3’(SEQ ID NO8)。
用于鑒別Xp45’-AGGGATACTGCCTCCAGCTC-3’(SEQ ID NO9)；5-CAGGAACTGCACTAACATCTTC-3’SEQ ID NO10)。
技術(shù)人員按照標(biāo)準(zhǔn)的PCR方案(此處不再重復(fù))利用這些引物。
本文所用的“核酸分子”指具有上文討論的特性的所有DNA和RNA物種?；蚪M和互補(bǔ)DNA(或“cDNA”)都編碼特定的蛋白質(zhì)，如針對(duì)MAGE編碼序列的分離的例子所示，這些內(nèi)容指導(dǎo)技術(shù)人員如何獲得這兩種DNA。
所有編碼MAGE-Xp蛋白質(zhì)的分離的核酸分子(除MAGE-Xp1之外)都包含在本發(fā)明之內(nèi)。本發(fā)明包括在嚴(yán)格條件下與MAGE-Xp2、MAGE-Xp3或MAGE-Xp4任一雜交的核酸分子。如本文使用的，所指的嚴(yán)格條件包括在65℃下用5×106cpm/ml雜交18小時(shí)；然后在65℃下進(jìn)行4次20分鐘的洗滌，每次使用2×SSC、0.5％SDS和1×Denhardt溶液；接著在0.2×SSC、1％SDS中洗滌兩次(每次20分鐘)；并且，最后68℃下，在1％SDS、變化濃度的SSC中洗滌兩次，每次進(jìn)行20分鐘。SSC的終濃度不應(yīng)超過(guò)0.5×SSC，更優(yōu)選的是0.2×SSC，最優(yōu)選的是0.1×SSC。
同樣地，可以獲得RNA分子(如mRNA)，并且對(duì)于技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，一旦手頭上有編碼序列，可以分離或合成mRNA。
不編碼TRAPs的互補(bǔ)序列(如“反義DNA”或mRNA)也是有用的，例如在探測(cè)編碼序列以及阻斷其表達(dá)的方法上是有用的。
很明顯，技術(shù)人員可以制備細(xì)胞系的生物學(xué)純化培養(yǎng)物，這種細(xì)胞系由編碼或表達(dá)MAGE-Xp分子的核酸序列轉(zhuǎn)染過(guò)?？梢岳眠@些培養(yǎng)物作為腫瘤排斥抗原的來(lái)源，或者例如，作為治療劑。以下討論了發(fā)明的這一方面。
由MAGE-Xp編碼序列轉(zhuǎn)染的細(xì)胞也可以由其它編碼序列轉(zhuǎn)染，其它編碼序列的例子包括細(xì)胞因子基因，例如白細(xì)胞介素(interleukins)(如I1-2或I1-4)或主要組織相容性復(fù)合物(MHC)或人類(lèi)白細(xì)胞抗原(HLA)分子。細(xì)胞因子基因轉(zhuǎn)染是有價(jià)值的，因?yàn)檫@些基因的表達(dá)有希望提高細(xì)胞生物學(xué)純培養(yǎng)物的體內(nèi)治療效率。本領(lǐng)域已知為了治療癌癥，向患者施用白細(xì)胞介素轉(zhuǎn)染子的治療方法。在特定的優(yōu)選實(shí)施方案中，由編碼(i)MAGE-Xp分子、(ii)HLA/MHC分子、(iii)細(xì)胞因子的每種序列轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
由編碼MHC/HLA的序列轉(zhuǎn)染是理想的，這是由于來(lái)源于MAGE-Xp的某些TRAs可以?xún)H由特定的MHC/HLA分子優(yōu)先地或特別地呈遞。這樣，當(dāng)受體細(xì)胞已表達(dá)和TRA的呈遞相關(guān)的MHC/HLA分子時(shí)，盡管可以利用進(jìn)一步的轉(zhuǎn)化以引起此抗原的過(guò)量表達(dá)，但額外的轉(zhuǎn)染是不必要的。另一方面，當(dāng)受體細(xì)胞不正常表達(dá)相關(guān)的MHC/HLA分子時(shí)，希望的是用第二種序列轉(zhuǎn)染。當(dāng)然，可以理解用一種額外的序列轉(zhuǎn)染不會(huì)妨礙用其它序列的進(jìn)一步轉(zhuǎn)染。
所用的和本文描述的細(xì)胞系相關(guān)聯(lián)的術(shù)語(yǔ)“生物學(xué)純的”簡(jiǎn)單地是指這些細(xì)胞基本沒(méi)有其它細(xì)胞。嚴(yán)格地講，“細(xì)胞系”的定義是“生物學(xué)純的”，它的引用完全建立在此基礎(chǔ)上。
細(xì)胞轉(zhuǎn)染要求使用適當(dāng)?shù)妮d體，因此本發(fā)明包含表達(dá)載體，其中，編碼興趣的MAGE-Xp TRAP的序列可操縱地與啟動(dòng)子連接。此啟動(dòng)子可以是強(qiáng)啟動(dòng)子(如本領(lǐng)域公知的那些)，或差異啟動(dòng)子(即其僅在特異細(xì)胞類(lèi)型中是可操縱的)。這種表達(dá)載體也可以包含病毒或者細(xì)菌基因組的全部或一部分(如牛痘病毒或BCG)。這種載體在疫苗的制備中尤其有用。
這種表達(dá)載體可以摻入幾種編碼序列，只要MAGE-Xp序列包含在其中。上文討論的細(xì)胞因子和/或HLA基因可以包含在帶有TRAP序列的單個(gè)載體中。如果不希望如此，可以提供一種表達(dá)系統(tǒng)，其中使用兩個(gè)或多個(gè)不同的載體，載體中每一個(gè)編碼序列可操縱地和啟動(dòng)子連接。另外，此啟動(dòng)子可以是強(qiáng)或差異啟動(dòng)子。共轉(zhuǎn)染是公知的技術(shù)，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員具有這種可以供使用的技術(shù)?？梢詷?gòu)建載體以便它們直接編碼TRA分子，而不是MAGE-Xp TRAP。這消除了對(duì)翻譯后加工的需要。
以上討論很清楚，這些序列編碼“腫瘤排斥抗原前體”(“TRAPs”)，接下來(lái)，將這些前體加工成腫瘤排斥抗原(“TRAs”)。也許它們最值得注意的方面是作為治療各種癌癥的疫苗。有證據(jù)表明TRAs在腫瘤細(xì)胞上呈遞，然后發(fā)生免疫應(yīng)答和細(xì)胞消除(deletion)。本領(lǐng)域的證據(jù)表明，當(dāng)對(duì)細(xì)胞施用各種TRAs時(shí)，便激發(fā)了(mounted)CTL反應(yīng)，并且使呈遞細(xì)胞(presenting cell)消除。這是疫苗的行為特征，因此可以利用TRAPs(其加工成TRAs)和TRAs本身，單獨(dú)使用或在合適的藥物組合物中使用以作為疫苗。同樣，可以以同樣的方式，或者單獨(dú)或者與其它組分結(jié)合或者產(chǎn)生藥物組合物來(lái)利用呈遞細(xì)胞，其它的可以用作疫苗的材料包括表面呈遞TRA分子的分離的細(xì)胞、TRAP片段、突變的病毒(特別是黃化形式)和轉(zhuǎn)化的細(xì)菌。如本文所用的“片段”指小于TRA的肽，但其具有如上文所述的作為疫苗所需的性質(zhì)。另一種疫苗包含TRA和HLA分子的復(fù)合物或者由該復(fù)合物組成。本文所描述類(lèi)型的疫苗可以用于預(yù)防，即向患者施用足夠量的疫苗以預(yù)防癌癥的產(chǎn)生。
和T細(xì)胞或B細(xì)胞相關(guān)的免疫應(yīng)答的產(chǎn)生進(jìn)呈遞的腫瘤排斥抗原的作用的特征。關(guān)于B細(xì)胞應(yīng)答，其特別和TRA抗體的產(chǎn)生相關(guān)，即這種抗體和TRA特異性結(jié)合。此外，TRA分子有足夠的大小以給出它們的免疫原性，并且和其特異結(jié)合的抗體是本發(fā)明的一部分。這些抗體是多克隆或單克隆的，單克隆抗體可通過(guò)用公知的任一方法制備，這里不必重復(fù)。例如，mAba可以通過(guò)利用動(dòng)物模型(如BalB/C小鼠)或在實(shí)驗(yàn)試管中制備(例如，使用EBV轉(zhuǎn)化體)。此外，只要某些細(xì)胞呈遞TRA，就可以從癌癥感染的患者體內(nèi)分離出抗血清，也可以產(chǎn)生由TRA和HLA/MHC分子相互作用限定的抗原表位抗體。
前面綜述的公開(kāi)內(nèi)容表明稱(chēng)為“腫瘤排斥抗原呈遞和識(shí)別”的系統(tǒng)有許多方面。這些現(xiàn)象的識(shí)別具有診斷意義，例如，特異性CTL克隆或TRA抗體的存在，使通過(guò)監(jiān)測(cè)患者樣品中的CTLs活性、抗體和TRA的結(jié)合、或患者樣品中相關(guān)的抗TRA CTLs活性以診斷或監(jiān)測(cè)癌癥(下文解釋)成為可能。同樣，核酸分子表達(dá)TRAPs可以通過(guò)擴(kuò)增(如“聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”)、反義雜交、探針技術(shù)等來(lái)監(jiān)測(cè)。各種患者的樣品包括體液(例如血液、血清和其它滲出物)、組織和腫瘤，都可以如此分析。
診斷學(xué)的一特別方法是應(yīng)用目前，用于診斷結(jié)核病的標(biāo)準(zhǔn)“結(jié)核菌素實(shí)驗(yàn)”的適應(yīng)性改進(jìn)實(shí)驗(yàn)。此標(biāo)準(zhǔn)皮膚試驗(yàn)用穩(wěn)定形式的“純化的蛋白衍生物”或“PPD”為診斷輔助。以類(lèi)似的方式，可以在這種皮膚試驗(yàn)中利用本發(fā)明的TRAs作為診斷輔助或監(jiān)測(cè)方法。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“癌癥”包括所有的以癌開(kāi)始并導(dǎo)致最終的臨床表現(xiàn)的生理事件。腫瘤不以可見(jiàn)的腫瘤從頭開(kāi)始出現(xiàn)；而是出現(xiàn)很多與正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化成惡性相關(guān)的狀態(tài)，然后繼續(xù)生長(zhǎng)(如腫瘤，轉(zhuǎn)移等)。此外，認(rèn)為消退可以是“癌癥”的一部分，因?yàn)槟[瘤很少自然消失。本發(fā)明的診斷方法包括和癌癥有關(guān)的所有狀態(tài)，從最初單一細(xì)胞轉(zhuǎn)化成惡性直至腫瘤的整個(gè)發(fā)育和轉(zhuǎn)移過(guò)程以及消退。本文包括所有這些。
在所有使用“患者”的地方，該術(shù)語(yǔ)包括癌癥感染的任何物種，包括人類(lèi)和非人類(lèi)(如馴養(yǎng)動(dòng)物、繁殖原種等)。
本發(fā)明也包括治療方面。施用作為疫苗的TRAPs和TRAs的效果已在上文討論。同樣，技術(shù)人員可以體外開(kāi)發(fā)特異性CTLs，然后向患者施用?？梢允┯枚嗫寺』騿慰寺】贵w，這些抗體可以和呈遞感興趣TRA的細(xì)胞特異結(jié)合。這些抗體可以和特異的抗腫瘤試劑偶連，這些抗腫瘤試劑包括但不限于氨甲喋呤放射性碘化合物、毒素(如蓖麻素蛋白)、其它抑細(xì)胞或溶細(xì)胞藥物等等。因此“定向”抗體治療法包括在本文之內(nèi)，通過(guò)利用CTLs消除癌細(xì)胞的應(yīng)用也包括在本文內(nèi)。
所用的術(shù)語(yǔ)和表達(dá)被用作描述性術(shù)語(yǔ)，但不是限制性的，并且在這些術(shù)語(yǔ)和表達(dá)的應(yīng)用上，無(wú)意于排除所示的和描述的特性的任何等同部分或其部分，應(yīng)該認(rèn)識(shí)到在本發(fā)明的范圍內(nèi)，各種改變是可能的。
序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人Lurquin，Christophe；Boon-Falleur，Thierry(ii)發(fā)明名稱(chēng)為MAGE-Xp家族成員的分離的核酸分子及其用途(iii)序列數(shù)12(IV)通訊地址(A)收信人Felfe Lynch(B)街道805 Third Avenue(C)城市紐約市(D)州紐約(F)郵政編碼10022(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類(lèi)型軟盤(pán)，3.50英寸，360kb存儲(chǔ)量(B)計(jì)算機(jī)IBM(C)操縱系統(tǒng)PC-DOS(D)軟件Wordperfect(VI)當(dāng)前申請(qǐng)的數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)朠CT/US96/03209(B)申請(qǐng)日1996年3月11日(VI)在先申請(qǐng)的數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)?8/403,388(B)申請(qǐng)日1995年3月14日(C)分類(lèi)435(viii)律師/代理人信息(A)姓名Hanson，Norman D.
(B)登記號(hào)30,946(C)案號(hào)/文檔號(hào)LUD 5408-PCT(ix)電信信息
(A)電話(212)688-9200(B)傳真(212)838-3884(2)SEQ ID NO1信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度1866個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO1GAGTGTTGCA ACTGGGCCTG GCATGTTTCA GCGTGGTGTC CAGCAGTGTC TCCCACTCCT 60TGTGAAGTCT GAGGTTGCAA AAGGACTGTG ATCATATGAA GATCATCCAG GAGTACAACT 120CGAAATTCTC AGAAAACAGG ACCTTGATGT GAGAGGAGCA GGTTCAGGTA AACAAAGGGC 180GAGGACCCGA GCGAGCTTAA GGCCAGTGGG GTGCAGCGTC TGGTCAGCCG AGGGTGAATT 240CTCAGGACTG GTCGGGAGTC AAGGTGCCAC ATCTCCTGCC TTTCTGCTCA CTTTCCTGCC 300TGTTTTGCCT GACCACAGCC ATCATGCCTC GGGGTCAGAA GAGTAAGCTC CGTGCTCGTG 360AGAAACGCCG CAAGGCGCGA GAGGAGACCC AGGGTCTCAA GGTTCGTCAC GCCACTGCAG 420CAGAGAAAGA GGAGTGCCCC TCCTCCTCTC CTGTTTTAGG GGATACTCCC ACAAGCTCCC 480CTGCTGCTGG CATTCCCCAG AAGCCTCAGG GAGCTCCACC CACCACCACT GCTGCTGCAG 540CTGTGTCATG TACCGAATCT GACGAAGGTG CCAAATGCCA AGGTGAGGAA AATGCAAGTT 600TCTCCCAGGC CACAACATCC ACTGAGAGCT CAGTCAAAGA TCCTGTAGCC TGGGAGGCAG 660GAATGCTGAT GCACTTCATT CTACGTAAGT ATAAAATGAG AGAGCCCATT ATGAAGGCAG 720ATATGCTGAA GGTTGTTGAT GAAAAGTACA AGGATCACTT CACTGAGATC CTCAATGGAG 780CCTCTCGCCG CTTGGAGCTC GTCTTTGGCC TTGATTTGAA GGAAGACAAC CCTAGTAGCC 840ACACCTACAC CCTCGTCAGT AAGCTAAACC TCACCAATGA TGGAAACCTG AGCAATGATT 900GGGACTTTCC CAGGAATGGG CTTCTGATGC CTCTCCTGGG TGTGATCTTC TTAAAGGGCA 960ACTCTGCCAC CGAGGAAGAG ATCTGGAAAT TCATGAATGT GTTGGGAGCC TATGATGGAG 1020AGGAGCACTT AATCTATGGG GAACCCCGTA AGTTCATCAC CCAAGATCTG GTGCAGGAAA 1080AATATCTGAA GTACGAGCAG GTGCCCAACA GTGATCCCCC ACGCTATCAA TTCCTATGGG 1140GTCCGAGAGC CTATGCTGAA ACCACCAAGA TGAAAGTCCT CGAGTTTTTG GCCAAGATGA 1200ATGGTGCCAC TCCCCGTGAC TTCCCATCCC ATTATGAAGA GGCTTTGAGA GATGAGGAAG 1260AGAGAGCCCA AGTCCGATCC AGTGTTAGAG CCAGGCGTCG CACTACTGCC ACGACTTTTA 1320GAGCGCGTTC TAGAGCCCCA TTCAGCAGGT CCTCCCACCC CATGTGAGAA CTCAGGCAGA 1380TTGTTCACTT TGTTTTTGTG GCAAGATGCC AACCTTTTGA AGTAGTGAGC AGCCAAGATA 1440TGGCTAGAGA GATCATCATA TATATCTCCT TTGTGTTCCT GTTAAACATT AGTATCTTTC 1500AAGTGTTTTT CTTTTAATAG AATGTTTATT TAGAGTTGGG ATCTATGTCT ATGAGCGACA 1560TGGATCACAC ATTTATTGGT GCTGCCAGCT TTAAGCATAA GAGTTTTGAT ATTCTATATT 1620TTTCAAATCC TTGAATCTTT TTTGGGTTGA AGAAGAAGAA AGCATAGCTT TAGAATAGAG 1680ATTTTCTCAG AAATGTGTGA AGAACCTCAC ACAACATAAT TGGAGTCTTA AAATAGAGGA 1740AGAGTAAGCA AAGCATGTCA AGTTTTTGTT TTCTGCATTC AGTTTTGTTT TTGTAAAATC 1800CAAAGATACA TACCTGGTTG TTTTTAGCCT TTTCAAGAAT GCAGATAAAA TAAATAGTAA 1860TAAATT1866(2)SEQ ID NO2信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度461個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO2GCTGCGGCTG CGGGTGTTTC ATCCACAAAA TCTAAAAAAG GTGCCAAGAG CCACCAAGGT 60GAGAAAAATG CAAGTTCCTC CCAGGCCTCA ACATCCACTA AGAGCCCAAG CGAAGATCCT 120CTAACCAGGA AGTCAGGGTC GTTGGTGCAG TTCCTGTTGT ACAAGTATAA AATAAAAAAG 180TCCGTTACAA AGGGAGAAAT GCTGAAAATT GTTGGCAAAA GGTTCAGGGA GCACTTCCCT 240GAGATCCTCA AGAAAGCCTC TGAGGGCCTC AGTGTTGTCT TTGGCCTTGA GCTGAATAAA 300GTCAACCCCA ACGGCCACAC TTACACCTTC ATCGACAAGG TAGACCTCAC TGATGAGGAA 360TCCCTGCTCA GTTCCTGGGA CTTTCCCAGG AGAAAGCTTC TGATGCCTCT CCTGGGTGTG 420ATCTTCTTAA ATGGCAACTC AGCTACTGAG GAAGAGATCTG 461(2)SEQ ID NO3信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度476個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO3ATCACTGCAA CTAACAAGAA AAAAGTATCC TTTTCATCCC CTCTTATTTT GGGGGCTACT 60ATCCAGAAAA AGTCTGCTGG TAGGTCACGT AGTGCTCTCA AGAAGCCTCA GAGAGCACTA 120TCCACCACTA CATCTGTAGA TGTTTCTTAC AAAAAGTCAT ACAAGGGAGC CAACAGCAAA 180ATTGAGAAAA AGCAAAGCTT CTCTCAGGGT CTATCCTCCA CTGTGCAGTC TCACACAGAC 240CCTCTAACCA TGAAGACAAA TATGTTGGTG CAGTTCCTGA TGGAAATGTA CAAGATGAAA 300AAGCCCATTA TGAAAGCAGA TATGCTAAAA ATTGTCCAAA AAAGCCATAA GAATTGCTTC 360CCTGAGATCC TTAAAAAAGC TTCTTTCAAC ATGGAGGTGG TGTTTGGTGT TGATTTAAAG 420AAAGTTGATT CTACCAAGGA CTCCTATGTC CTTGTCAGCA AAATGGATCT CCCCAA 476(2)SEQ ID NO4信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度687個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO4CATCACCTGC CCTTCTGCCT ACACTCCTGC CTGCTGTGCC TAACCACAGC CATCATGCCT 60CGGGGTCAGA AGAGTAAGCT CCGTGCCCGT GAGAAACGCC AGCGGACCCG TGGTCAGACC 120CAGGATCTCA AGGTTGGTCA GCCTACTGCA GCAGAGAAAG AAGAGTCTCC TTCCTCTTCC 180TCATCTGTTT TGAGGGATAC TGCCTCCAGC TCCCTTGCTT TTGGCATTCC CCAGGAGCCT 240CAGAGAGAGC CACCCACCAC CTCTGCTGCT GCAGCTATGT CATGCACTGG ATCTGATAAA 300GGCGACGAGA GCCAAGATGA GGAAAATGCA AGTTCCTCCC AGGCCTCAAC ATCCACTGAG 360AGATCACTCA AAGATTCTCT AACCAGGAAG ACGAAGATGT TAGTGCAGTT CCTGCTGTAC 420AAGTATAAAA TGAAAGAGCC CACTACAAAG GCAGAAATGC TGAAGATCAT CAGCAAAAAG 480TACAAGGAGC ACTTCCCTGA GATCTTCAGG AAAGTCTCTC AGCGCACGGA GCTGGTCTTT 540GGCCTTGCCT TGAAGGAGGT CAACCCCACC ACTCACTCCT ACATCCTCGT CAGCATGCTA 600GGCCCCAACG ATGGAAACCA GAGCAGTGCC TGGACCCTTC CAAGGAATGG GCTTCTGATG 660CCTCTACTGA GTGTGATCTT CTTAAAT 687(2)關(guān)于序列ID NO的信息5(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO5TAAAAAAGGT GCCAAGAGCC AC 22(2)SEQ ID NO6信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO6TGAGGCCCTC AGAGGCTTTC 20(2)SEQ ID NO7信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度21個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO7AGTCTGCTGG TAGGTCACGT A 21(2)SEQ ID NO8信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度23個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO8TCAGGAACTG CACCAACATA TTT 23(2)SEQ ID NO9信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO9AGGGATACTG CCTCCAGCTC 20(2)SEQ ID NO10信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO10CAGGAACTGC ACTAACATCT TC22(2)SEQ ID NO11信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi)序列描述SEQ ID NO11GTGGTGTCCA GCAGTGTCTC 20(2)SEQ ID NO12信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度23個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(xi)序列描述SEQ ID NO12GTCAGATTGC CTACATGACA CAG 2權(quán)利要求
1.分離的核酸分子，該核酸分子編碼MAGE-Xp腫瘤排斥抗原前體或互補(bǔ)于編碼MAGE-Xp腫瘤排斥抗原前體的分離的核酸分子，其中所說(shuō)的分離的核酸分子(i)不是SEQ ID NO1，和(ii)在嚴(yán)格條件下和包含SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4的至少一種分離的核酸分子雜交。
2.分離的核酸分子，這種核酸分子選自由包含SEQ ID NO2、SEQ ID NO3和SEQ ID NO4的分離的核酸分子組成的一組。
3.權(quán)利要求2的分離的核酸分子，這種核酸分子由SEQ ID NO2組成。
4.權(quán)利要求2的分離的核酸分子，這種核酸分子由SEQ ID NO3組成。
5.權(quán)利要求2的分離的核酸分子，這種核酸分子由SEQ ID NO4組成。
6.表達(dá)載體，這種表達(dá)載體包含可操縱地與啟動(dòng)子連接的權(quán)利要求2的分離的核酸分子。
7.由權(quán)利要求2的分離的核酸分子轉(zhuǎn)染的真核細(xì)胞系。
8.由權(quán)利要求2的分離的核酸分子轉(zhuǎn)化的原核細(xì)胞系。
9.鑒定樣品中人類(lèi)X染色體的方法，這種方法包括在有利于權(quán)利要求1的分離的核酸分子和所說(shuō)的X染色體雜交的條件下，使所說(shuō)的樣品和所說(shuō)的權(quán)利要求1的分離的核酸分子接觸；并且測(cè)定雜交作用以鑒定所說(shuō)的人類(lèi)X染色體。
10.分離的核酸分子，這種核酸分子選自由SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9、和SEQ ID NO10組成的一組。
11.在以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)為基礎(chǔ)的測(cè)定中有用的試劑盒，這種試劑盒包含下列之一(i)SEQ ID NO5和SEQ ID NO6，(ii)SEQ ID NO7和SEQ ID NO8，及(iii)SEQ ID NO9和SEQ ID NO10。
12.確定樣品中MAGE-Xp基因表達(dá)的方法，該方法包括在有利于(i)SEQID NO5和SEQ ID NO6、(ii)SEQ ID NO7和SEQ ID NO8或(iii)SEQ ID NO9和SEQ ID NO10與MAGE-Xp編碼序列雜交的條件下，使所說(shuō)的樣品和(i)、(ii)、(iii)的序列中至少之一接觸；進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；并且測(cè)定表達(dá)產(chǎn)物以確定所說(shuō)的樣品中MAGE-Xp編碼序列的存在。
全文摘要
本發(fā)明涉及MAGE－Xp核酸分子家族的成員。由于這些MAGE－Xp家族成員不能和先前鑒定的MAGE序列雜交,所以這些分子不同于先前描述的MAGE核酸分子。并且,發(fā)現(xiàn)這些MAGE－Xp家族成員位于X染色體的Xp臂上,不在Xq染色體上,而先前鑒定的MAGE基因則在Xq染色體上。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1178534SQ96192537
公開(kāi)日1998年4月8日 申請(qǐng)日期1996年3月11日 優(yōu)先權(quán)日1995年3月14日
發(fā)明者克里斯托夫·呂爾茨, 蒂爾瑞·博恩-法勒爾 申請(qǐng)人:路德維格癌癥研究所