專利名稱：一種納米磁粒復(fù)合系統(tǒng)的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種一種納米磁粒復(fù)合系統(tǒng)的制備方法。
背景技術(shù)：
腫瘤放射一基因治療是近年來國際上針對腫瘤放療和基因治療在各自實踐中存在的問題而提出的治療惡性腫瘤的新思路，其含義是將經(jīng)射線誘導(dǎo)表達(dá)并對腫瘤具有殺傷作用的基因轉(zhuǎn)入腫瘤細(xì)胞，然后對腫瘤實施局部放療時誘導(dǎo)基因表達(dá)，造成射線和基因?qū)δ[瘤的雙重殺傷作用，使兩者的優(yōu)勢得以互補，協(xié)同發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。這一治療模式已成為腫瘤研究領(lǐng)域的新熱點。Egr-I基因是輻射早期對細(xì)胞起調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子，可在電離輻射作用下誘導(dǎo)下游基因表達(dá)，實現(xiàn)對目的基因表達(dá)的時空調(diào)控。利用Egr-I基因啟動子調(diào)控序列的放射敏感性而進(jìn)行的輻射-基因治療的研究取得了令人鼓舞的成績，但是該方法仍然面臨著基因治療中普遍存在的問題——缺乏合適的基因傳遞方法將基因安全有效地轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)并高效地表達(dá)，而且，由于實體瘤普遍存在的缺氧微環(huán)境也可使輻射啟動子的誘導(dǎo)活性降低，從而影響了這一療法的療效和應(yīng)用。乏氧反應(yīng)元件(HRE)是一種缺氧敏感性增強子，能夠與缺氧誘導(dǎo)因子-1 (HIF-I) 特異性結(jié)合而誘導(dǎo)下游基因表達(dá)。HRE/HIF調(diào)節(jié)系統(tǒng)是哺乳動物細(xì)胞和人類組織共有的，HIF-I α 在 68-84% 的月中瘤中過表達(dá)(Semenza GL. Targeting HIF-I for cancer therapy. Nat Rev Cancer, 2003, 3:721-732)，這提示腫瘤乏氧環(huán)境中可以用HRE序列調(diào)控目的基因表達(dá)。Shibata 等(Shibata T, Giaccia AJ, Brown JM. Development of ahypoxia-responsive vecter for tumor-specific gene therapy. Gene Ther, 2000, 7:403-498.)證實了 5拷貝的HRE與啟動子連接能使乏氧下的基因表達(dá)增加500倍。基因轉(zhuǎn)移載體的選擇是基因治療的另一個關(guān)鍵性問題。目前基因轉(zhuǎn)移載體主要分為病毒載體和非病毒載體兩大類。病毒載體系統(tǒng)是迄今為止最有效的基因轉(zhuǎn)移方法，但是由于目的基因容量小、靶向特異性差，以及自身的免疫原性，尤其是生物安全性問題，使其臨床運用受到嚴(yán)格控制；傳統(tǒng)的非病毒載體系統(tǒng)盡管避免了重大的安全隱患，但其轉(zhuǎn)染效率一直不如病毒載體系統(tǒng)，難以獲得有意義的基因表達(dá)。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法和電穿孔轉(zhuǎn)染法是目前最為常用的非病毒載體轉(zhuǎn)染方法，脂質(zhì)體法有較高的轉(zhuǎn)染效率，但在體內(nèi)會迅速被血清清除，并且對細(xì)胞毒性較大，因此在很大程度上限制了其使用(吳海霞，張維銘，李曉眠.基因轉(zhuǎn)染技術(shù)的發(fā)展與現(xiàn)狀[J].國際生物醫(yī)學(xué)工程雜志，2007, 30(6) :376. 4-7納米載體優(yōu)勢)。電穿孔法轉(zhuǎn)染效率很高，適合瞬時表達(dá)和穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，但該方法只適用于體外細(xì)胞或組織轉(zhuǎn)染，不適宜于體內(nèi)轉(zhuǎn)染，而且對細(xì)胞損傷大，電擊后會有大量細(xì)胞死亡。納米技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展為解決基因轉(zhuǎn)移載體問題提供了新的思路，以納米顆粒為基因轉(zhuǎn)移載體的研究引起了廣泛關(guān)注。以納米顆粒為基因轉(zhuǎn)移載體就是將DNA、 RNA等基因治療分子包裹在納米顆粒中或吸附在其表面，在細(xì)胞攝粒作用下進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)釋放基因治療分子。與傳統(tǒng)載體相比，納米載體在介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移方面具有以下幾個優(yōu) 勢(Panyamj Jayanth, Labhasetwarj Vinod et al. Biodegradable nanoparticlesfor drug and gene delivery to cells and tissue [J]. Advanced Drug Delivery Reviews, 2003，55(3):329-347) (Bhakta G，Mitra S, Maitra A, et al. DNA encapsulated magnesium and manganous phosphate nanoparticles: potential non-viral vectors for gene delivery [J], Biomaterials, 2005，26 (14) : 2157-2163):無免疫原性，可多次反復(fù)注射；無遺傳毒性與細(xì)胞毒性，不會導(dǎo)致細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和細(xì)胞死亡；允許基因緩慢釋放，有效地延長作用時間，并維持有效的產(chǎn)物濃度，提高轉(zhuǎn)染效率和轉(zhuǎn)染產(chǎn)物的生物利用度；可介導(dǎo)外源基因在宿主細(xì)胞染色體DNA中的整合，從而獲得轉(zhuǎn)基因的長期、穩(wěn)定表達(dá)。因此，納米載體既綜合了病毒載體與傳統(tǒng)非病毒載體的優(yōu)勢，又避免了兩者的缺陷，成為極具應(yīng)用前景的新型載體系統(tǒng)，尤其是磁性納米基因轉(zhuǎn)移載體，它除了具有一般納米顆粒的特性以外，還具有超順磁性，可在外加磁場的作用下進(jìn)行高效磁轉(zhuǎn)染和定向移動，從而進(jìn)行靶向基因治療。但納米顆粒(尤其是磁性納米粒子)普遍存在著軟團聚現(xiàn)象，而且顆粒越小越易團聚，裸材料并不能將基因轉(zhuǎn)入到細(xì)胞內(nèi)，只有經(jīng)過表面修飾后才能發(fā)揮其基因載體功能，并且修飾后磁性粒子的分散性、表面功能基團等直接影響著磁性粒子的進(jìn)一步應(yīng)用。PEI是一種常用的粉體材料表面改性劑，為電空間穩(wěn)定機理型分散劑，在水相中能同時具有靜電排斥和空間位阻效應(yīng)，其單體(-CH-CH2-NH2-)中每三個原子含一個氨基，富含陽離子，有較強的結(jié)合DNA和粘附細(xì)胞的能力。在前期的研究中，本實驗室采用化學(xué)共沉淀法成功制備了納米級溫敏錳鋅鐵氧體納米磁粒，并以PEI進(jìn)行表面修飾，有效地改善了磁性粒子間團聚現(xiàn)象，用其介導(dǎo)PCMV-EGFP轉(zhuǎn)染猴腎細(xì)胞C0S-7獲得了較高的基因轉(zhuǎn)染效率。但是， 經(jīng)PEI修飾的錳鋅鐵氧體納米磁粒能否用于肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)染，與其它特定基因是否具有良好的結(jié)合和釋放能力，這些都不得而知，有待進(jìn)一步的研究。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服在轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞時脂質(zhì)體法和電穿孔法的不足，本發(fā)明提供了一種納米磁粒復(fù)合系統(tǒng)的制備方法，通過本發(fā)明得到的納米磁粒復(fù)合系統(tǒng)用于轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞，能有效解決了現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題。本發(fā)明所說的納米磁粒復(fù)合系統(tǒng)，是由質(zhì)粒pHRE-Egr-1-EGFP與 PEI-Mn0.5Zn0.5Fe204納米磁粒按1 :40質(zhì)量比混合構(gòu)成的復(fù)合物。其中所說的質(zhì)粒pHRE-Egr-1-EGFP，是將乏氧誘導(dǎo)元件HRE和具有放射敏感性的啟動子Egr-I相藕聯(lián)，形成乏氧輻射雙敏感啟動子HRE/Egrl，連接于報告基因EGFP上游。 pHRE-Egr-I-EGFP 質(zhì)粒(即 pCDNA3. l_5HRE_Egrl-EGFP)結(jié)構(gòu)示意圖見圖 7。上述所說的復(fù)合納米系統(tǒng)pHRE-Egr-1-EGFP/PEI-MZF _ NPs，是通過下述方法得到
(1)質(zhì)粒pHRE-Egr-I-EGFP的制備將Egrl啟動子置于pIRES載體上，其前有一 CMV 增強子片段，用以增強Egrl啟動子表達(dá)效率。以CMVE-Egrlp序列為模板設(shè)計引物，PCR擴增CMVE+Egrlp片段?；厥誄MVE-Egrlp片段，以Mlul+Nhel為亞克隆位點，將其亞克隆至 ρ⑶NA3. I-EGFP上，構(gòu)建ρ⑶NA3. I-Egrl-EGFP質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化后，挑取若干個克隆，提取質(zhì)粒， 進(jìn)行PCR鑒定。根據(jù)PCR電泳結(jié)果，選擇正確的ρ⑶ΝΑ3. I-Egrl-EGFP進(jìn)行測序比對。按參考文獻(xiàn)合成5HRE 為了便于后續(xù)實驗的進(jìn)行，在合成5HRE片段時，兩側(cè)各加了若干個酶切位點，將其插入PUC57載體(購自長沙贏潤生物有限公司)上，獲得PUC57-5HRE，其構(gòu)建圖譜見圖13 (基因名稱:5HRE ；基因長度:185bp ；載體名稱:pUC57 ；克隆位點=EcoRI,HindIlD0 將合成產(chǎn)物酶切鑒定、基因測序。將PUC57-5HRE和pCDNA3. I-Egrlp-EGFP分別用MluI酶切連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5 α中，挑取克隆進(jìn)行BglII酶切鑒定。選擇正確的克隆進(jìn)行測序，將測序序列與欲獲得的5HRE序列進(jìn)行比對。(2^EI-Mna5Zna5Fii2O4納米磁粒的制備按Mn =Zn =Fe的摩爾比為0. 5:0. 5:2稱取原料MnSO4 .H2CKZnSO4 WH2CKFeSO4 ·7Η20，混合后倒入高速研磨杯磨成粉狀，按η(M) η(0Η_ )=1 2. 4(M代表所有金屬離子)稱取所需NaOH的量，加適量水溶解，將粉末倒入其中并混勻，不斷攪拌成糊狀，室溫放置1 后，80°C干燥，得到粉末狀前驅(qū)體，放入馬弗爐中400°C 焙燒lh，自然冷卻后熱蒸餾水浸洗，過濾，用BaCl2檢測濾液中無白色沉淀后，無水乙醇淋洗一遍，60°C烘干，即得Mna5SiaPe2O4納米磁粒；稱取一定量的Μ%5&ια5狗204納米磁粒溶于去離子水中，配制成4% (質(zhì)量百分比)的磁流體，超聲分散后高速離心棄上清；沉淀重懸于PBS緩沖液中，超聲分散后按照PEI與MZF-Ws質(zhì)量比為1 :5的量緩慢加入PEI，充分混勻，恒溫?fù)u床24h使反應(yīng)充分。用磁分離法將磁性粒子從溶液中分離，經(jīng)蒸餾水、甲醇等反復(fù)洗滌，真空干燥后即獲得表面修飾過的Mna5SiaPe2O4納米磁粒(PEI_MZF_NPs)。(3 )復(fù)合物制備按PEI-MZF-NPs與pHRE_Egr I-EGFP質(zhì)量比為40 1，將質(zhì)粒 pHRE-EgrI-EGFP和PEI_MZF_NPs分別用無血清培養(yǎng)基稀釋，室溫放置5分鐘后，將二者混和到一起并混勻，置室溫下孵育30分鐘，即獲得pHRE-Egrl-EGFP/PEI-MZF-NPs復(fù)合物。本發(fā)明以PEI-MZF -NPs 為載體，構(gòu)建了 pHRE-Egr-l-EGFP/PEI-MZF -NPs 復(fù)合系統(tǒng)，在DNA結(jié)合、保護及釋放實驗中均顯示，PEI-MZF-NPs不僅可以與pHRE-Egr-I-EGFP 高效結(jié)合，保護pHRE-Egr-1-EGFP免于核酸酶降解，并能夠在合適的條件下有效釋放 pHRE-Egr-1-EGFP。PEI-MZF-NPs之所以能保護DNA免受DNase I消化，可能是由于復(fù)合納米材料發(fā)揮了空間位阻的作用，即同時阻止DNase I及Mg2+與DNA的接觸，最終影響DNase I的消化活性。在對肝癌Bel-7402細(xì)胞體外轉(zhuǎn)染的實驗中顯示，細(xì)胞毒性甚微，并獲得了較高的轉(zhuǎn)染效率，顯示了比電穿孔轉(zhuǎn)染法和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法明顯的優(yōu)越性，而且納米磁粒轉(zhuǎn)染后在乏氧輻射共同誘導(dǎo)下的基因表達(dá)效率明顯高于單獨輻射誘導(dǎo)組，表明pHRE-Egr-Ι乏氧輻射雙敏感啟動子能夠誘導(dǎo)并提高缺氧環(huán)境下的下游基因表達(dá)水平，PEI-Mna5Zna5Fe2O4 納米磁粒可以作為一種新型的基因運載體，將pHRE-Egr-1-EGFP安全有效地轉(zhuǎn)染Bel-7402 細(xì)胞，為我們后續(xù)的介導(dǎo)自殺基因進(jìn)行實體瘤輻射基因治療的研究提供了有力的理論和實驗依據(jù)。本發(fā)明中將5HRE插入Egrl啟動子前，構(gòu)建乏氧輻射雙敏感啟動子，再與報告基因 EGFP藕連，構(gòu)建了 pHRE-Egr-1-EGFP質(zhì)粒，利用乏氧、輻射共同誘導(dǎo)和增強報告基因在腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。其中放射線即可作為啟動目的基因轉(zhuǎn)錄的開關(guān)，在空間上和時間上調(diào)控基因的表達(dá)，由于輻射的劑量、范圍、次數(shù)是可以人為控制的，所以有可能做到控制基因在一定范圍、適當(dāng)?shù)臅r間、甚至需要的水平表達(dá)，這不僅在一定程度上實現(xiàn)了基因表達(dá)的可調(diào)控性目標(biāo)，而且能提高實體瘤缺氧微環(huán)境中的細(xì)胞基因表達(dá)水平。


圖1是pCDNA3. I-Egrl-EGFP酶切鑒定電泳圖譜(泳道1 :Marker IV (從上至下各條帶大小為:7Κ,5. 5Κ，3· 5K,2K,lK，500bp ；泳道 2 :pCDNA3. I-Egrl-EGFP 二 ；泳道 3 :pCDNA3. I-Egrl-EGFP ；泳道 4 :pCDNA3. 1-Egrl-EGFP )。圖 2 是.PCDNA3. I-Egrl-EGFP 測序比對(Sequence 0 =Egrl 啟動子序列(CMVE 序列未列入)fequence 1 :pCDNA3. 1-Egrl-EGFP測序.abl反向互補序列；比對軟件=Dnassit 2. 0)。圖 3 是 pUC57-5HRE 酶切鑒定(泳道 3 :pUC57_5HRE ；泳道 2 :pUC57_5HRE 經(jīng) NdeI 和 HindIII 酶切；泳道 1 :DL3000)。圖 4 是pUC57_5HRE測序比對 Sequence 0 :5HRE 欲得序列 Jequence 1 :5HRE. abl 反向互補序列；比對軟件=Dnassit 2. 0)。圖 5 是 pCDNA3. l-5HRE-Egrl_EGFP 酶切鑒定(泳道 3 :pCDNA3. l-5HRE_Egr Ip-EGFP ； 泳道 2 :pCDNA3. 1-5HRE-Egrlp-EGFP 經(jīng) BglII 酶切；泳道 1 :KB Ladder)。圖 6 是pCDNA3. l-5HRE-Egrl_EGFP測序比對(Sequence 0 預(yù)期插入的 5HRE序列； Sequence 1 :pCDNA3. l-5HRE_Egrlp-EGFP 測序· abl 序列；比對軟件=Dnassit 2. 0)。圖 7 是 pCDNA3. l_5HRE_Egrl-EGFP 質(zhì)粒圖譜。圖8是不同質(zhì)量比(PEI-MZF-NPs :DNA)的PEI-MZF-NPs-DNA復(fù)合物凝膠電泳泳動抑制實驗(泳道1為Mark ；泳道2為0 :1 ；泳道3為5 :1 ；泳道4為10 :1 ；泳道5為20 :1 ； 泳道6為40 1 ；泳道7為80 :1)。圖9是PEI-MZF-NPs-DNA復(fù)合物的DNase-Ι消化保護實驗(泳道1為Mark ；泳道2 為消化IOmin ；泳道3為消化20min ；泳道4為消化30min ；泳道5為40min ；泳道6為60min ； 泳道7為裸質(zhì)粒未加DNase-I ；泳道8為裸質(zhì)粒加DNase-I消化IOmin ；泳道9為裸質(zhì)粒加 DNase-I消化20min ；泳道10為裸質(zhì)粒加DNase-I消化30min ；泳道10為裸質(zhì)粒加DNase-I 消化40 min ；泳道11為裸質(zhì)粒加DNase-I消化60 min)。圖10 PEI-MZF-NPs-DNA復(fù)合物的DNA釋放實驗(泳道1為Mark ；泳道2為釋放Ih ； 泳道3為消化4h ；泳道4為釋放他；泳道5為釋放12h ；泳道6為釋放24h ；泳道7為釋放 48h ；泳道8為釋放3天；泳道9為釋放4天；泳道10為釋放5天)。圖11納米磁粒、電穿孔、脂質(zhì)體三種方法轉(zhuǎn)染Bel-7402細(xì)胞，在乏氧輻射雙重誘導(dǎo)或單獨輻射誘導(dǎo)后熒光顯微鏡照片(A、納米磁粒轉(zhuǎn)染乏氧輻射誘導(dǎo)組；B、電穿孔轉(zhuǎn)染乏氧輻射誘導(dǎo)組；C、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染乏氧輻射誘導(dǎo)組；D、納米磁粒轉(zhuǎn)染輻射誘導(dǎo)組)。圖12納米磁粒、電穿孔、脂質(zhì)體三種方法轉(zhuǎn)染Bel-7402細(xì)胞，在乏氧輻射雙重誘導(dǎo)或單獨輻射誘導(dǎo)后流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率和熒光強度結(jié)果(A、納米磁粒轉(zhuǎn)染乏氧輻射誘導(dǎo)組；B、電穿孔轉(zhuǎn)染乏氧輻射誘導(dǎo)組；C、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染乏氧輻射誘導(dǎo)組；D、納米磁粒轉(zhuǎn)染輻射誘導(dǎo)組)。圖13是5HRE插入pUC57載體上構(gòu)建pUC57_5HRE的示意圖。
具體實施例方式1材料與方法
1.1 主要試劑脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000 (Invitrogen公司)；聚乙烯亞胺(polyethylenimine, PEI)為 Sigma ；瓊脂糖為 MRI ； DNaseI 為 Amercso ；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清為Gibco ；噻唑藍(lán)(MTT，AMRESC0) ；二甲基亞砜(DMSO，Sigma公司)。 ρ⑶NA3. I-EGFP購自長沙贏潤生物科技有限公司。1.2 HRE-Egrl啟動子調(diào)控下的EGFP真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 1. 2. 1 PCR擴增Egrl啟動子片段
將Egrl啟動子置于pIRES載體(購于長沙贏潤生物科技有限公司)上，其前有一 CMV增強子片段，用以增強Egrl啟動子表達(dá)效率。CMVE-Egrlp 序列如 SEQ ID NO :1 所示，(l_664bp 為 CMVE 序列；665_673bp 為 SgfI 酶切位點；678-1117bp為小鼠Egrl啟動子序列)，以CMVE-Egrlp序列為模板設(shè)計引物。引物對
Egrl-f 5'-CCG CTCGAG CG ACGCGT GATCTTCAATATTGGCCATTAGC-3' (SEQ ID NO 2) -—MluI :CG ACGCGT -—XhoI :CCG CTCGAG
Egrl-r 5' -CCG CTCGAG CTA GCTAGC CCAAGTTCTGCGCGCTGGGAT-3，(SEQ ID NO :3) -—NheI :CTA GCTAGC -—XhoI :CCG CTCGAG
Product 片度段長度=1117+17+18=1152bp, GC%=52. 3，Ta=55. 8 PCR 擴增 CMVE+Egrlp 片段。圖1為PCR擴增后電泳圖譜，可知pCDNA3. I-Egrl-EGFP 、 pCDNA3. I-Egrl-EGFP S 是正確克隆。1. 2. 2 將 Egrlp 片段亞克隆至 pCDNA3. I-EGFP 上
回收第一步中的CMVE-Egrlp片段，以Mlul+Nhel為亞克隆位點，將其亞克隆至 PCDNA3. I-EGFP上，構(gòu)建pCDNA3. I-Egrl-EGFP質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化后，挑取若干個克隆，提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR鑒定。引物對
Egrl-f 5'-CCG CTCGAG CG ACGCGT GATCTTCAATATTGGCCATTAGC-3' (SEQ ID NO 2) Egrl-r 5' -CCG CTCGAG CTA GCTAGC CCAAGTTCTGCGCGCTGGGAT-3' (SEQ ID NO :3) Product 片度長度=1152bp, GC%=52. 3，Ta=55. 8 根據(jù)PCR電泳結(jié)果，選擇正確的ρ⑶NA3. I-Egrl-EGFP送去測序。圖2為pCDNA3. I-Egrl-EGFP測序圖譜，將其序列與Egrl模板序列比對，可知Egrl 序列完全正確，表明ρ⑶NA3. I-Egrl-EGFP構(gòu)建成功。1. 2. 3 合成 5HRE 片段
5HRE合成參考文獻(xiàn)鄭愛青，宋現(xiàn)讓，于金明，等.嵌合性啟動子HRE. CArG的構(gòu)建及對肝癌細(xì)胞乏氧和射線應(yīng)答的調(diào)控.中國腫瘤生物治療雜志，2005，12(1):69-71。為了便于后續(xù)實驗的進(jìn)行，在合成5HRE片段時，兩側(cè)各加了若干個酶切位點(MluI、NheI、BglII、 HindIII)，最終合成的5HRE片段序列如SEQ ID N0:4所示。將5HRE片段插入pUC57載體 (購自長沙贏潤生物科技有限公司)上，獲得PUC57-5HRE，其構(gòu)建圖譜見圖13 (基因名稱 5HRE ；基因長度185bp ；載體名稱pUC57 ；克隆位點EC0RI、HindIII)。將合成產(chǎn)物酶切鑒定、基因測序。圖3為pUC57-5HRE酶切鑒定圖譜，空pUC57載體上，NdeI和HindIII之間的片段長度為290bp左右，如果5HRE片段成功插入，則NdeI和HindIII之間的片段長度為480bp 左右，由圖3酶切結(jié)果可知pUC57-5HRE克隆正確。1. 2. 4 pCDNA3. l-5HRE_Egrlp-EGFP 構(gòu)建
將pUC57-5HRE和pCDNA3. I-Egrlp-EGFP分別用MluI酶切連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至 DH5a中，挑取克隆進(jìn)行BglII酶切鑒定。選擇正確的克隆進(jìn)行測序，將測序序列與欲獲得的5HRE序列進(jìn)行比對。圖4為5HRE測序圖譜，可知基因序列正確。圖 5 為 pCDNA3. l_5HRE_Egrl-EGFP 酶切鑒定圖譜，原始的 pCDNA3. I-Egrlp-EGFP 上，只有一個BglII酶切位點，當(dāng)5HRE片段成功插入后，會帶入一個BglII酶切位點，兩個BglII酶切位點之間的片段長度約為380bp，由圖5可知5HRE已成功插入。圖6為 ρ⑶NA3. 1-5HRE-EgrI-EGFP測序比對圖譜，可知基因序列完全正確。由以上結(jié)果可知，pCDNA3. l-5HRE_Egrl-EGFP構(gòu)建成功，圖7為 pCDNA3. 1-5HRE-EgrI-EGFP 質(zhì)粒圖譜。1. 3 Mn0.5Zn0.5Fe204 納米磁粒(MZF-NPs)的制備與修飾 1. 3 . 1制備
采用化學(xué)共沉淀法制備MZF-NPs，其步驟按一定的化學(xué)配比(Mn =Zn =Fe的摩爾比為 0. 5:0. 5:2)稱取原料MnSO4 · H2O, ZnSO4 · 7H20, FeSO4 · 7H20，混合后倒入高速研磨杯磨成粉狀，按n(M) η(0Η_)=1 2. 4 (M代表所有金屬離子)稱取所需NaOH的量，加適量水溶解， 將粉末倒入其中并混勻，不斷攪拌成糊狀，室溫放置1 后，80°C干燥，得到粉末狀前驅(qū)體， 放入馬弗爐中400°C焙燒lh，自然冷卻后熱蒸餾水浸洗，過濾，用BaCl2檢測濾液中無白色沉淀后，無水乙醇淋洗一遍，60 0C烘干即獲得MZF-NPs。1. 3 . 2 表面修飾
稱取一定量的MZF-NPs溶于去離子水中，配制成4% (質(zhì)量百分比)的磁流體，超聲分散后高速離心棄上清；沉淀重懸于PBS緩沖液中，超聲分散后按照PEI與MZF-NPs質(zhì)量比為1 5的量緩慢加入PEI充分混勻，恒溫?fù)u床24h使反應(yīng)充分。用磁分離法將磁性粒子從溶液中分離，經(jīng)蒸餾水、甲醇等反復(fù)洗滌，真空干燥后即獲得表面修飾過的Mna5Sici.Pe2O4納米磁粒 (PEI-MZF-NPs)。1. 4 PEI-MZF-NPs 與質(zhì)粒 pHRE-Egr-l-EGFP 結(jié)合實驗
將 PEI-MZF-NPs 與質(zhì)粒 pHRE-Egr-I-EGFP 分別按質(zhì)量比 0 :1、5 :1、10 :1、20 :1、40 :1、 80 1混合(終體積500 μ 1，其中DNA的濃度恒定為0. 01 μ g/ μ 1)，室溫靜置30分鐘，以反應(yīng)充分形成復(fù)合物，分別取10 μ 1復(fù)合物瓊脂糖凝膠電泳檢測納米磁粒與DNA結(jié)合情況。選出PEI-MZF-NPs與質(zhì)粒pHRE-Egr-l-EGFP結(jié)合最適比例。圖8為PEI-MZF-NPs與DNA結(jié)合能力測試的瓊脂糖凝膠電泳圖譜，按1 :0、1 :5、1 10加入質(zhì)粒，泳道上可見清晰的DNA條帶；1 40泳道和大于1 :40的泳道已無明顯DNA條帶,表明PEI-MZF-NPs與質(zhì)粒pHRE-Egr-l-EGFP質(zhì)量比從1 :40開始，PEI-MZF-NPs可以結(jié)合體系中的所有質(zhì)粒。1. 5 PEI-MZF-NPs-DNA 的 DNase-Ι 消化保護實驗
將質(zhì)粒 pHRE-Egr-I-EGFP 與 PEI-MZF-NPs 按 1 :40 質(zhì)量比混合于 Tris Buffer (含有 60mM MgCl2)中，室溫靜置30分鐘，加入DNase I，37°C水浴，分別在消化10、20、40、60 min時，終止液 GOOmmol /L NaCI, IOOmmol/L EDTA)終止反應(yīng)。用 SDS 將 PEI-MZF-NPs 結(jié)合的質(zhì)粒pHRE-Egr-1-EGFP洗脫下來，苯酚、氯仿抽提，無水乙醇沉淀，75%的乙醇洗滌，溶于適量的雙蒸水中，取產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳，觀察復(fù)合物抵抗DNA酶解的能力。將裸質(zhì)粒 pHRE-Egr-I-EGFP用相同方法處理，作為對照。PEI修飾的錳鋅鐵氧體納米材料DNA復(fù)合物經(jīng)DnaseI消化10_60分鐘，質(zhì)粒仍能保持穩(wěn)定，電泳條帶亮度沒有明顯改變，而裸DNA中加入DNaseI消化后，隨著消化時間的延長，可見質(zhì)粒降解程度逐步增加，40分鐘后幾乎全部被消化，泳道上已看不到條帶，提示 PEI-MZF-NPs可以有效地保護DNA免受DNaseI的消化(見圖9)。1. 6 PEI-MZF-NPs-DNA復(fù)合物中DNA釋放能力檢測
將質(zhì)粒pHRE-Egr-I-EGFP與PEI_MZF_NPs按1 :40質(zhì)量比混合，形成復(fù)合物。TE溶解， 37恒溫?fù)u床振蕩，分別于1、4、8、12、24 h、2天、3天、4天，15000r/min離心，取上清液瓊脂糖凝膠電泳，以了解復(fù)合物DNA釋放能力，每一次離心后均重新補足TE繼續(xù)振蕩。圖 10 反應(yīng) DNA- PEI-MZF-NPs 復(fù)合物體外 DNA 釋放情況在 lh、4h、8h、12h、ld、2d、 3d內(nèi)，DNA的釋放量逐漸增多，表現(xiàn)為電泳條帶亮度逐漸增加，到第3天釋放量達(dá)最大，第3 天、第4天已無明顯區(qū)別。提示PEI- MZF-NPs除了可以與DNA高效結(jié)合，保護DNA免于降解，還能夠在合適的條件下有效釋放DNA。1. 7 PEI-MZF-NPs轉(zhuǎn)染效率、乏氧-輻射誘導(dǎo)表達(dá)情況的評價 1. 7. 1細(xì)胞培養(yǎng)
Bel-7402細(xì)胞接種于含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，在37°C、飽和濕度、5%C02 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2-3天傳代一次，實驗時取對數(shù)生長期細(xì)胞。1. 7. 2轉(zhuǎn)染效率、乏氧-輻射誘導(dǎo)表達(dá)情況的評價
以PEI-MZF-NPs對Bel-7402細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，并與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、電穿孔介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法比較，對其轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行評價。PEI-PEI-MZF-NPs轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染之前，預(yù)先將質(zhì)粒DNA和PEI-NPs分別用無血清培養(yǎng)基稀釋，二者混勻后置室溫下孵育30分鐘，獲得DNA-PEI-PEI-MZF-NPs復(fù)合物 (PEI-MZF-NPs與DNA質(zhì)量比為40 :1)。將Bel-7402細(xì)胞接種于6-孔板中，每孔5X IO5個細(xì)胞，孵育約18小時后(細(xì)胞有80%融合)，棄去原培養(yǎng)液，PBS洗細(xì)胞2次，再用DMEM無血清培養(yǎng)基洗1次，然后加入含有DNA-PEI-MZF-NPs的無血清DMEM培養(yǎng)基(每孔3 μ gDNA， PEI-MZF-NPs與DNA質(zhì)量比為40 :1)，置于孵箱中孵育證，用新鮮的含有血清的全培養(yǎng)基替換無血清的培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育至48 h。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染之前，預(yù)先將質(zhì)粒DNA和脂質(zhì)體(LipofectamineTM2000) 分別用無血清培養(yǎng)基稀釋，二者混勻后置室溫下孵育30分鐘，獲得DNA-脂質(zhì)體 (LipofectamineTM2000)復(fù)合物。轉(zhuǎn)染前細(xì)胞處理同DNA-PEI-MZF-NPs組，將含有DNA-脂質(zhì)體的無血清DMEM培養(yǎng)基加入培養(yǎng)孔(每孔3 μ gDNA，脂質(zhì)體與DNA質(zhì)量比為5 :3)，置于孵箱中孵育證，用新鮮的含有血清的全培養(yǎng)基替換無血清的培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育至48h。電穿孔轉(zhuǎn)染胰酶消化細(xì)胞后，用全培養(yǎng)基終止胰酶反應(yīng)，收集細(xì)胞離心(轉(zhuǎn)數(shù)為 IOOOg 5分鐘)。去上清，用1. 25%E緩沖液(含1. 25%DMS0的無血清培養(yǎng)基)洗細(xì)胞兩次。用 E緩沖液稀釋細(xì)胞，使細(xì)胞濃度為5X106/ml，取細(xì)胞懸液400ul (即細(xì)胞數(shù)為2X 106/ml) 放入無菌的EP管中，然后加入!BugDNA質(zhì)粒，混勻后轉(zhuǎn)入4mm的電極杯中。選擇電極參數(shù)為250v/950uf,電極杯厚度為4mm，把裝有細(xì)胞和DNA的電極杯放入電轉(zhuǎn)染盒中，電擊后室溫放置10分鐘，轉(zhuǎn)入全培養(yǎng)基培養(yǎng)。置于孵箱中孵育Mh，換新鮮培養(yǎng)液液以棄去死細(xì)胞，繼續(xù)孵育至48h。將上述三種方法轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以直線加速器4Gy的X射線照光(6兆電子伏)后，置于37°C乏氧環(huán)境下(0. 1% O2,5% CO2A2平衡氣)密封培養(yǎng)Mh，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞熒光蛋白的表達(dá)情況，流式細(xì)胞儀定量檢測分析熒光強度和轉(zhuǎn)染效率。PEI-PEI-MZF-NPs轉(zhuǎn)染法同時設(shè)單獨輻射誘導(dǎo)組作為對照，以未經(jīng)轉(zhuǎn)染常規(guī)培養(yǎng)的細(xì)胞為陰性對照)。圖11為熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞均可見有綠色熒光，其中電穿孔組發(fā)出綠色熒光的細(xì)胞較多較亮，PEI-MZF-Ws組略次之，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組最低(見圖11)，未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞未見綠色熒光。流式細(xì)胞儀檢測(圖12)納米磁粒組、電穿孔組、脂質(zhì)體組的轉(zhuǎn)染效率分別為 64. 65%,67. 60%,45. 77%，平均熒光強度分別為193. 89,215. 12、132. 69單位，納米磁粒轉(zhuǎn)染法的轉(zhuǎn)染效率和平均熒光強度略低于電穿孔法，但明顯高于脂質(zhì)體法，而且納米磁粒轉(zhuǎn)染后在乏氧輻射共同誘導(dǎo)下的轉(zhuǎn)染效率和熒光強度均明顯高于單獨輻射誘導(dǎo)組的48. 94%和 169. 15單位，和熒光顯微鏡觀察結(jié)果基本一致。1. 7. 3 MTT 法檢測 DNA-PEI-MZF-NPs 細(xì)胞毒性
Bel-7402細(xì)胞分別經(jīng)上述三種方法轉(zhuǎn)染后，轉(zhuǎn)種到96孔板QX IO3/孔)，同時設(shè)未經(jīng)轉(zhuǎn)染的Bel-7402細(xì)胞為陰性對照，每組設(shè)6個復(fù)孔。置于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h， 每孔加MTT液20 μ 1(5啤/ml，PBS配制)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸盡上清液，加DMS0( 150 μ 1/ 每孔)，振蕩溶解10分鐘，用酶標(biāo)儀在493nm下測OD值。根據(jù)公式“細(xì)胞的存活率(％ )= 各實驗組OD值/陰性對照組OD值X 100%"計算細(xì)胞存活率。表1為MTT實驗結(jié)果，可以看出PEI-MZF-NPs轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞相對存活率明顯高于脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組和電穿孔轉(zhuǎn)染組。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組存活率最低，電穿孔轉(zhuǎn)染組略高于脂質(zhì)體組(見表)，表明電穿孔轉(zhuǎn)染法和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法對Bel-7402細(xì)胞均有一定的細(xì)胞毒性，而 PEI-MZF-NPs轉(zhuǎn)染法的細(xì)胞毒性較小。表1. PEI-MZF-NPS、電穿孔、脂質(zhì)體三種轉(zhuǎn)染方法細(xì)胞毒性(MTT)實驗結(jié)果( 士S，n=5)
權(quán)利要求
1. 一種納米磁粒復(fù)合系統(tǒng)的制備方法，包括下述步驟(1)質(zhì)粒PHRE-Egr-I-EGFP的制備將Egrl啟動子置于pIRES載體上，其前有一 CMV 增強子片段，用以增強Egrl啟動子表達(dá)效率，以CMVE-Egrlp序列為模板設(shè)計引物，PCR擴增CMVE+Egrlp片段，回收CMVE-Egrlp片段，以Mlul+Nhel為亞克隆位點，將其亞克隆至 pCDNA3. I-EGFP 上，構(gòu)建 pCDNA3. I-Egrl-EGFP 質(zhì)粒；轉(zhuǎn)化后，挑取若干個克隆，提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR鑒定；根據(jù)PCR電泳結(jié)果，選擇正確的 PCDNA3. I-Egrl-EGFP進(jìn)行測序比對；合成5HRE，并在在合成5HRE片段時，兩側(cè)各加若干個酶切位點，將其插入PUC57載體上，獲得pUC57-5HRE，將合成產(chǎn)物酶切鑒定、基因測序；將 PUC57-5HRE和pCDNA3. I-Egrlp-EGFP分別用MluI酶切連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5 α中， 挑取克隆進(jìn)行BglII酶切鑒定，選擇正確的克隆進(jìn)行測序，將測序序列與欲獲得的5HRE序列進(jìn)行比對；(2 ) PEI-Mn0.5Zn0.5Fe204納米磁粒的制備按Mn :Zn :Fe的摩爾比為0. 5 0. 5 2稱取原料MnSO4 · H2O, ZnSO4 · 7H20、FeSO4 · 7H20,混合后倒入高速研磨杯磨成粉狀，按 η(M) η(0Η_)=1 2. 4，其中M代表所有金屬離子，稱取所需NaOH的量，加適量水溶解， 將粉末倒入其中并混勻，不斷攪拌成糊狀，室溫放置1 后，80°C干燥，得到粉末狀前驅(qū)體，放入馬弗爐中400°C焙燒lh，自然冷卻后熱蒸餾水浸洗，過濾，用BaCl2檢測濾液中無白色沉淀后，無水乙醇淋洗一遍，60°C烘干，即得Mna5Sitl.Pe2O4納米磁粒；稱取一定量的 Mna5Zna5Fe2O4納米磁粒溶于去離子水中，配制成質(zhì)量百分比為4%的磁流體，超聲分散后高速離心棄上清；沉淀重懸于PBS緩沖液中，超聲分散后按照PEI與MZF-Ws質(zhì)量比為1 :5的量緩慢加入PEI，充分混勻，恒溫?fù)u床24h使反應(yīng)充分；用磁分離法將磁性粒子從溶液中分離，經(jīng)蒸餾水、甲醇等反復(fù)洗滌，真空干燥后即獲得表面修飾過的Mna5Zna5Fe2O4納米磁粒；(3)復(fù)合物制備按PEI-MZF-NPs與pEgrI-HSV-TK質(zhì)量比為40 :1，將質(zhì)粒 pEgrl-HSV-TK和PEI- MZF-NPs分別用無血清培養(yǎng)基稀釋，室溫放置5分鐘后，將二者混和到一起并混勻，置室溫下孵育30分鐘，即獲得pEgrl-HSV-TK/PEI- MZF-NPs復(fù)合物。
全文摘要
本發(fā)明是一種磁性納米復(fù)合系統(tǒng)的制備方法，該方法是分別制備質(zhì)粒pHRE-Egr-1-EGFP和PEI-Mn0.5Zn0.5Fe2O4納米磁粒，再按PEI-MZF-NPs與pEgr1-HSV-TK質(zhì)量比為401，將質(zhì)粒pEgr1-HSV-TK和PEI-MZF-NPs分別用無血清培養(yǎng)基稀釋，室溫放置5分鐘后，將二者混和到一起并混勻，置室溫下孵育30分鐘，即獲得pEgr1-HSV-TK/PEI-MZF-NPs復(fù)合物。本發(fā)明制得的復(fù)合物轉(zhuǎn)染肝癌Bel-7402細(xì)胞，獲得了較高的轉(zhuǎn)染效率，細(xì)胞毒性甚微，顯示了比電穿孔轉(zhuǎn)染法和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法明顯的優(yōu)越性。
文檔編號A61K48/00GK102225209SQ20111017348
公開日2011年10月26日 申請日期2011年6月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月26日
發(fā)明者張東生, 張佳, 林梅 申請人:東南大學(xué)