專利名稱：一種以γ-亞麻酸為主要成分的生物制劑、制備及應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物工程技術，特別提供了一種以γ-亞麻酸為主要成份的生物制劑，生產(chǎn)該制劑的菌種及生產(chǎn)該制劑的方法。
γ-亞麻酸(γ-Linolenic acid，簡稱GLA)作為人體必需脂肪酸，在機體內(nèi)具有重要的生理功能。GLA為一種18碳三烯酸，分子式為C1830O2系無色或淡黃色油狀液體。GLA是合成具有高度生理活性的前列腺素的前體，是組成人體各組織生物膜的結構材料，存在于人體多種組織中，在人體營養(yǎng)學和醫(yī)療方面具有重要作用。當人體攝取了過量的飽和脂肪酸或出現(xiàn)其他代謝紊亂時，正常脂肪酸代謝受阻，造成體內(nèi)前列腺索缺乏，導致各種疾病產(chǎn)生。此時若及時補充GLA，便可保證體內(nèi)前列腺素的正常代謝從而消除疾病，因此作為營養(yǎng)物質的GLA對于生命來說是極其重要的。此外，近年來大量的藥理和臨床研究表明，GLA具有重要的生理功能，如具有明顯的降血脂作用；抑制血小板聚集和血栓素A2的合成；具有明顯的抗脂質過氧化作用，具有抑制潰瘍及胃出血作用；增強胰島素作用等。隨著研究的深入GLA對癌癥、酒精中毒、炎癥、減肥等均具有一定的療效和改善作用。總之機體中若缺乏GLA，則會導致多種疾病的發(fā)生，由此預示GLA具有廣泛的醫(yī)療保健前景。
國際上開發(fā)GLA的應用研究，始于70年代月見草油的臨床應用。但由于資源、環(huán)境等因素的影響，月見草籽資源受到限制，應用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)GLA及其應用開發(fā)技術是國際上研究的新領域。1985年日本工業(yè)技術院化學研究所首先利用Mortierella(被孢霉)發(fā)酵法制取GLA獲得成功，后由日本出光石油化學公司實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，隨后英國Sturge公司利用Mucor(毛霉)發(fā)酵法生產(chǎn)GLA也獲得成功，由于菌體發(fā)酵產(chǎn)物中其它有效成份較少，上述兩家公司皆以提取菌體中純GLA為目的，工藝復雜，以其為原料開發(fā)的產(chǎn)品，僅具有GLA單一成分的功能。中國專利91106190.8公開了一種用已知的剌孢小克銀漢霉制備γ-亞麻酸為主的生物制劑的方法，用其生產(chǎn)出的生物制劑，γ-亞麻酸含量可達到油脂中8-15％，還含有多種有效成份，如氨基酸，多糖超氧化物岐化酶(SOD)和維生素等，但是除γ-亞麻酸外其他有效成份很不穩(wěn)定。并且所公開的方法尚處于實驗室階段，通過簡單放大不能達到工業(yè)生產(chǎn)的目的。另外，所用菌種產(chǎn)率較低，菌體干重在25-27克/升，最終產(chǎn)品成本較高。
本發(fā)明的目的在于提供一種以γ-亞麻酸為主要成份的生物制劑及其制備方法，可以實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，并且其產(chǎn)品有效成份含量穩(wěn)定，工藝簡單，成本較低。
本發(fā)明提供了一種以γ-亞麻酸為主要成份的生物制劑，其特征在于組成如下(重量百分比)粗蛋白 脂肪 全糖纖維素18.5-24.9 30-38 3.5-4.0 12.8-16.3可溶性非氮化物 水分24.0-30.2 3.2-4.5其主要有效成分穩(wěn)定在γ-亞麻酸 多糖 維生素 氨基酸2.4-5.3 2.5-3.5 0.025-0.030 6.20-8.15SOD酶800-920u/g上述生物制劑是本發(fā)明所提供菌種的代謝產(chǎn)物，本發(fā)明所提供菌種為剌孢小克銀漢霉Cunninghamella echinulata(Thaxter)，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號CGMCCNO.0232，是以中國科學院微生物研究所，菌保庫菌種AS3.154為原始菌種，分離其單孢子用微波處理，再將獲得的新培養(yǎng)物的原生質球經(jīng)紫外線誘變，搖瓶發(fā)酵篩選獲得的新變異菌株。該菌株在葡萄糖土豆培養(yǎng)基上，菌落生長速度較快，25-35℃培養(yǎng)2-3天，直徑可達2-3cm，初期為白色棉毛狀，逐淅變灰黃色或駝黃色。菌絲體發(fā)達多分枝，幼令無橫隔，直徑15-20微米。分生孢子梗直立，分枝頂端膨大的汽囊表面著生小梗，小梗上形成園型或橢園型具有纖細刺的分生孢子，直徑10-15微米。該變異株較始發(fā)菌株菌絲體松散，生長速度快，形成孢子量多。并且經(jīng)發(fā)酵后菌粉產(chǎn)量高，可達28-32克/升，其他有效成分穩(wěn)定。
本發(fā)明所提供的生物制備工藝流程如下保存菌株→生產(chǎn)菌株→菌種擴大→種子罐→發(fā)酵罐→過濾→沖洗→脫水→干燥→檢驗。
菌種培養(yǎng)由凍干管或沙土管保存菌株移接至土豆汁瓊脂斜面上，于25-35℃培養(yǎng)5天，進行菌種活化，再將活化的斜面菌種移接至茄形瓶中進行擴大培養(yǎng)。
種液培養(yǎng)將斜面菌種制成孢子懸浮液，接種于種子罐中進行培養(yǎng)，種子培養(yǎng)基為葡萄糖或蔗糖2-4％，尿素0.1-0.5％，KH2PO40.01-0.05％，MgSO40.01-0.03％，VB10.0015％，PH5.5-6.5。種子罐培養(yǎng)溫度25-35℃；風量1∶0.1-1∶0.5V/V，罐壓0.04-0.06MPa；攪拌速度120-180rPm；培養(yǎng)時間24-40小時。
發(fā)酵培養(yǎng)將生長良好的種子液接入發(fā)酵罐中培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖或蔗糖4-10％，KH2PO40.01-0.05％，MgSO40.01-0.03％ CaCO30.01％ VB10.0015％，PH為5.5-6.5；接種量5-10％，培養(yǎng)條件同種子罐，培養(yǎng)時間4-5天；菌體收集培養(yǎng)結束后，用三足式離心機離心收集菌體，經(jīng)水洗脫水后，用振動式干燥機進行菌體干燥，使其含水量達到3.2-4.5％，經(jīng)檢驗合格后，冷芷備用。
毒理學、藥理學及臨床療效結果急性毒性實驗結果表明，本發(fā)明100g/kg經(jīng)口給與小鼠，未見明顯毒性，本發(fā)明的最大耐受量＞100g/Kg(含GLA3.33g)相當于臨床用量的666倍。
長期毒性實驗結果表明，本發(fā)明按10g/Kg/日給大鼠灌服，7.5g/Kg/日經(jīng)口投于狗，連續(xù)飼服6個月，未見動物出現(xiàn)外觀、體重、血象、血液生化學指標及臟器組織的毒性變化。
致畸敏感期毒性試驗表明，本發(fā)明口服50mg/Kg和150mg/Kg(含GLA量)于胚鼠器官形成期連續(xù)給藥10天，無論是大劑量還是小劑量，對胎鼠的體重、身長、尾長、死胎、吸收胎、存活胎、窩重與對照組比較，無明顯差異，胎鼠在外觀、內(nèi)臟、骨骼檢查均未見畸形，表明本品對小鼠的胚胎發(fā)育無影響。
致突變作用結果表明，通過Ames試驗，染色體畸變試驗、微核試驗的檢測證明本發(fā)明的至突變作用為陰性。
藥效學試驗本發(fā)明27mg/kg(以GLA量計，下同)經(jīng)口給予大鼠，11.5mg/Kg經(jīng)口給予家兔，對高脂飼料喂養(yǎng)所致的脂代謝紊亂有預防保護作用，其降低甘油三脂作用明顯強于32mg/Kg月見草油。
本發(fā)明11.5mg/Kg治療給藥對實驗性高脂血癥家兔有降低膽固醇和甘油三酯，升高高密度脂蛋白作用，其降低膽固醇作用明顯強于月見草油。
本發(fā)明11.5mg/Kg經(jīng)口給予家兔，可抑制高脂飼料所至的TC、TG升高，防止HDL下降，降低肝臟脂質沉著，降低肝系數(shù)，減輕兔主動脈粥樣硬化斑塊的程度，其中肝臟TG含量明顯低于月見草油組(P＜0.05)，主動泳粥樣硬化斑塊抑制率明顯高于月見草油。
臨床療效觀察結果以本發(fā)明為主要原料制成的調(diào)脂抗栓丸，其初步臨床療效觀察表明，對血液流變性，改善血液粘稠度(血漿粘度，全血粘度，紅細胞變形性等)具有明顯的治療作用。具有明顯調(diào)節(jié)脂蛋白作用，對降低總膽固醇、甘油三酯有顯著作用，對提高抗動脈硬化因子的高密度脂蛋日—膽固醇及其亞組分都有明顯的效果。另外對癥候的改善如目眩、頭痛、無力、頭暈、等都有很好的作用。
本發(fā)明生物制劑的特點是不僅含有GLA而且還含有微生物多糖、SOD酶、氨基酸(18種必需氨基酸)，維生素(VB1；VB2；VcVPP；VE等)多種營養(yǎng)成分和生物活性物質。
眾所周知，多糖和糖結合物在生物學和實際應用中的作用，日益引起重視，微生物多糖是一類具有生物活性的物質，一般認為多糖對機體的免疫功能有促進作用；對機體的損傷具有修復和保護作用；具有抗炎作用；抑瘤作用等功能。SOD酶具有清除自由基功能。因此本生物制劑綜合多種營養(yǎng)和生理活性物質的功能，在藥效學實驗及臨床觀察中，其作用均優(yōu)于僅含GLA的月見草油，這正是本發(fā)明的創(chuàng)新之外。此外由于采用生物工程技術，故本發(fā)明具有原材料廣泛易得，工藝流程簡單，成本低廉，適于大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點。以本發(fā)明生物制劑為原料的功能食品，保健藥品及治療藥物的新產(chǎn)品正推向市場。下面通過實施例詳敘本發(fā)明。
實施例1微生物菌體搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)方法搖瓶種子與發(fā)酵培養(yǎng)基配方同發(fā)酵工藝中所述培養(yǎng)基。搖瓶裝量100ml/500將斜面菌種加入無菌水制成孢子懸浮流，接種于種子培養(yǎng)基中，往復式搖床振蕩培養(yǎng)，轉數(shù)120次/分，溫度28-30℃，時間40小時。種液菌絲體生長旺盛，菌球細小均勻，無污染。將其以10％接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件同種子液，時間120小時，將菌體過濾、水洗、于燥得菌粉，用石油醚提取法獲得GLA的油脂。菌體重30g/l，油脂含量32％，GLA4.16％，多糖3.0％，氨基酸8％，維生素0.03％；SOD酶850u/g。
實施例2，3001罐發(fā)酵培養(yǎng)方法斜面、種子液、發(fā)酵液培養(yǎng)基配方同實實例1，種子罐投料量601/1001。以孢子懸浮液接種于種子罐中其工藝條件為溫度28-30℃，罐壓0.05Mpa，風量1∶0.5V/V，攪拌速度180轉/分，種令32小時，接種量10％。將生長良好之種液接入300ml發(fā)酵罐中，投料量2001/3001，接種量10％，培養(yǎng)條件同種子罐。發(fā)酵時間115小時，經(jīng)菌體收集、水洗、干燥，獲干菌體6.6Kg；油脂含量35％；GLA3.63％；多糖3.0％，氨基酸7.3％，維生素0.025％，SOD酶835u/g。
實施例3.5001發(fā)酵罐制備方法培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件同實施例2，發(fā)酵罐投料量為3001/5001發(fā)酵時間113小時，獲于菌體8.8Kg；油脂含量35.3％；GLA含量3.05％；多糖3.2％；氨基酸7.9％；維生素0.028％；SOD酶890U/g實施例4.1200L發(fā)酵罐培養(yǎng)方法培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件同實施例2，發(fā)酵罐投料量900L/1200L。發(fā)酵時間為90小時。獲得于菌體23.5Kg；油脂含量31.5％；GLA含量4.41％；多糖3.3％；氨基酸7.5％；維生素0.026％；SOD875U/g。
實施例5.生物制劑的開發(fā)應用將經(jīng)發(fā)酵獲得的干菌體，粉碎過80目篩得到本制劑，以其為主要原料與蜂蜜等配合調(diào)制成預防與治療心腦血管疾病的藥物劑型；經(jīng)毒理學、藥理學及臨床療效觀察表明，無毒性、無致畸、致突變等不良作用，藥理學功能及臨床療效結果與前述發(fā)明內(nèi)容相一致，保健功能作用與治療效果均明顯優(yōu)于月見草油。
綜上所述，本發(fā)明提供了包括生產(chǎn)菌株、發(fā)酵工藝、毒理學、藥理學、臨床療效觀察結果以及產(chǎn)品開發(fā)應用等一系列產(chǎn)GLA微生物菌體制備及應用技術。本發(fā)明具有原材料廣泛易得，工藝流程簡單，成本低廉，適于大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點。其提供的生物制劑不僅含有GLA而且還含有微生物多糖、SOD酶、多種氨基酸和維生素等營養(yǎng)成分及生物活性物質。以其為主要原料調(diào)制成預防、改善、治療高血壓高血脂、動脈粥樣硬化等心腦血管疾病的治療藥物和保健食品。經(jīng)毒理學、藥理學及臨床療效觀察證明，無毒、無致畸，致突變等不良作用，療效顯著，明顯優(yōu)于月見草油及被孢霉，毛霉發(fā)酵制取的單純GLA，具有廣闊的開發(fā)應用前景。
權利要求
1.一種以γ-亞麻酸為主要成份的生物制劑，其特征在于組成如下(重量百分比)粗蛋白 脂肪 全糖纖維素18.5-24.930-38 3.5-4.0 12.8-16.3可溶性非氮化物 水分24.0-30.23.2-4.5其主要有效成分穩(wěn)定在γ-亞麻酸 多糖 維生素 氨基酸2.4-5.32.5-3.5 0.025-0.030 6.20-8.15SOD酶800-920u/g
2.一種生產(chǎn)權利要求1所述生物制劑的菌種，剌孢小克銀漢霉Cunnighamella echinulata(Thaxter)，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號CGMCCNO.0232.
3.一種權利要求1所述生物制劑的制備方法，其特征在于用權利要求2所述菌種制備過程如下----菌種培養(yǎng)由凍干管或沙土管保存菌株移接至土豆汁涼脂斜面上，于25-35℃培養(yǎng)2-7天，進行菌種活化，再將活化之斜面菌種移接至茄形瓶中進行擴大培養(yǎng)----種液培養(yǎng)將斜面菌種制成孢子懸浮液，接種于種子罐中進行培養(yǎng)，種子培養(yǎng)基為葡萄糖或蔗糖2-4％，尿素0.1-0.5％，KH2PO40.01-0.05％，MgSO40.01-0.03％ VB10.0010-0.0020％，PH為5.5-6.5；種子罐培養(yǎng)溫度25-35℃，風量1∶0.1-0.5V/V；罐壓0.04-0.06MPa，攪拌速度120-180rPm，培養(yǎng)時間24-40小時；----發(fā)酵培養(yǎng)將生長良好的種子液接入發(fā)酵罐中培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖或蔗糖4-10％，尿素0.1-0.5％，KH2PO40.01-0.05％，MgSO40.01-0.03％ CaCO30.07-0.13％ VB10.0010-0.0020％，PH為5.5-65；接種量5-10％，培養(yǎng)條件同種子罐，培養(yǎng)時間4-5天；----菌體收集，水洗，干燥，使其水分含量達到3.2-4.5％。
4.權利要求1所述生物制劑可用于制造治療心腦血管疾病藥物或保健品及功能食品。
全文摘要
一種以γ-亞麻酸為主要成分的生物制劑，其特征在于組成如下(重量百分比)粗蛋白18.5-24.9；脂肪30-38；全糖3.5-4.0；纖維素12.8-16.3；可溶性非氮化物24.0-30.2；水分3.2-4.5；其主要有效成分穩(wěn)定在γ-亞麻酸2.4-5.3；多糖2.5-3.5；維生素0.025-0.030；氨基酸6.20-8.15；SOD酶800-920u/g。本發(fā)明具有原材料廣泛易得，工藝流程簡單，成本低廉，適于大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點。
文檔編號A61K38/43GK1134840SQ95119429
公開日1996年11月6日 申請日期1995年12月28日 優(yōu)先權日1995年9月4日
發(fā)明者趙振英, 周連甲, 馬清祿 申請人:中國科學院沈陽應用生態(tài)研究所