專利名稱：用表達自殺基因的間充質干細胞進行細胞介導癌癥基因治療的制作方法
技術領域：
本發(fā)明總體上涉及癌癥治療領域，以及細胞分離和基因改變的領域。更具體地，其涉及使用諸如胸苷激酶之類自殺基因轉染的干細胞治療癌癥。
背景技術：
癌癥是當今世界面臨的最大的健康挑戰(zhàn)之一，每年有超過1000萬個的新癌癥病例。據來自美國癌癥協(xié)會的信息，2007年報道的癌癥新病例超過140萬。據來自美國國家衛(wèi)生研究院的信息，在美國治療癌癥患者每年的直接費用約780億美元。在中國，癌癥是導致死亡和疾病的頭號原因。據來自MS Global Insights的信息，受人口老齡化、更好醫(yī)療條件以及還有很多年專利保護期的進一步的創(chuàng)新產品的引入等因素的驅動，到2012年，中國的癌癥治療市場價值將超過400億美元。全球對抗癌癥的斗爭在繼續(xù)，需要更多的方式來治療不能用當前可用的抗癌藥物治療的病例。在觀察發(fā)育成纖維細胞集落形成細胞(CFU-F)的細胞群時，最先識別出成人間充質干細胞(MSC)。從那時起，這些細胞的治療用途和臨床應用已被建議用于組織工程、基因治療、器官移植和組織損傷。參見P M等，Open Orthop J.2011 ；5 (Suppl 2):253_60。以干細胞為基礎的癌癥治療已由M.Cihova等在MolPharmaceutics 2011,8,1480-7中進行了概括評述。已發(fā)現(xiàn)MSCs深入(home)到腫瘤微環(huán)境中(Mishra PJet al.，Cancer Res 2008 ；68:4331-9 ；Hall B et al.，Handbook of ExperimentalPharmacology2007 ； (180):263-83)。它們被用來作為載體在體內提供臨床相關的各種抗癌藥物，包括細胞因子(Elzaouk L et al., Exp Dermato 2006 ; 15:865-74)、干擾素(Nakamizo A et al., Cancer Res 2005 ；65:3307-18 ；Studeny M et al., J Nat CancerInst 2004;96:1593-603.)、前藥(Miletic H et al.，Mol Ther 2007 ；15:1373-81 ；Kucerova L et al.，Cancer Res 2007 ；67:6304-13.)或復制型腺病毒(Sonabend AM etal., Stem Cells 2008 ；26:831-41 ；Chan J et al., Stem Cells 2005 ；23:93-102.)。已在腫瘤轉移模型中使用轉基因祖細胞系對治療效果進行了探索(Aboody KS et al.，PLoSONE 2006 ；1:e23)。Myers TJ 等在 Expert Opin Biol Ther.2010Dec ；10(12): 1663-79 中對間充質干細胞和基因治療進行了評述。Gu C等已用老鼠實驗腦膜膠質瘤模型對遺傳工程化間充質干細胞的治療效果進行了測試，參見Cancer Lett.2010May 28 ；291 (2):256_62。Bak XY等建議將桿狀病毒轉導的骨髓MSC用于系統(tǒng)性的癌癥治療，參見Cancer Gene Ther.20100ct17(10):721-9。Amano S等建議將遺傳工程化的骨髓衍生的間充質干細胞用于膠質瘤基因治療，參見Int J Oncol.2009Dec ；35(6): 1265-70。利用工程化間充質干細胞的靶向腫瘤基質已被建議用于減少胰腺癌的增 長，參見Zischek C et al., Ann Surg.2009Nov ；250(5):747-53.Erratum in:Ann Surg.2010Jan ；251 (I):187。根據 Matuskova M et al., CancerLett.2010Apr I ；290(1):58_67，表達HSV-TK的間充質干細胞已被認為能對人腦膠質瘤細胞施加旁觀者效應。Uchibori R等已建議將產生逆轉錄病毒載體的間充質干細胞用于革巴向自殺腫瘤基因治療，參見J Gene Med.2009 May ；11 (5):373_81。Dai LJ等在CancerLett.201 IJun I ；305(1):8-20中對在癌癥治療中間充質干細胞的潛在影響進行了論述。美國專利公布號US 2011/250188A1涉及用于腫瘤治療的LCMV-GP-VSV的假型載體和腫瘤浸潤病毒產生細胞。美國專利US 2008/0241115A1涉及使用基因改造的間充質干細胞來表達用于治療癌癥的自殺基因。美國專利US 2010/0233200A1涉及編碼治療性多肽和用以清除轉導細胞的安全元件的載體。在其技術能 商業(yè)可行地用于人類治療之前，這樣的背景研究還需要進一步發(fā)展。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供一種使用表達自殺基因的間充質干細胞(MSC)的細胞介導的癌癥基因治療形式。本發(fā)明的MSC通過使用永生化的MSC系以及篩選具有免疫學特性的MSC以防止移植物抗宿主反應，可最優(yōu)化為即用型(off-the-shelf)產品。根據本發(fā)明的治療個體所罹患的腫瘤的方法，其通常包括下述步驟:a)向個體施予重組表達自殺基因的間充質干細胞(MSC)群；b)等待足夠時間使得至少一些所述間充質干細胞從它們在步驟a)中的施予部位遷移至所述腫瘤所處的部位或所述腫瘤所處部位的附近；以及然后c)給予所述個體有效量的前藥，藉此，由位于所述腫瘤部位或者其附近的所述間充質干細胞表達的所述自殺基因引起所述前藥轉換成殺死腫瘤細胞的藥物。作為即用型產品的用途，這些細胞可以被表征為“多向”。此術語是指細胞足夠無免疫原性，從而可以將其給予人群中各種基因型的個體而不必考慮組織配型。對于群體中的大多數(shù)，有效比例的間充質干細胞將遷移到腫瘤而不會被個體的免疫系統(tǒng)去除或者導致失效。多向性細胞可以包含在現(xiàn)成的醫(yī)藥產品中，而無需預先知道什么個體將接受治療，或個體各自的組織類型。通常，MSC來自已被永生化的細胞系，永生化是通過使用諸如慢病毒之類的載體用SV40大T抗原轉染進行的。優(yōu)選地，MSC是胚胎間充質干細胞或來自構成多形性免疫圖譜(profile)的源的細胞。典型的自殺基因是胸苷激酶(例如，來自HSV)，對于胸苷激酶，前藥是更昔洛韋(gancicloir)。其他自殺基因和前藥在本公開的后文列明。本發(fā)明的另一實施方式是用于藥物或用于制備藥物的產品。這些產品包括重組表達自殺基因的間充質干細胞系。優(yōu)選地，MSC是胚胎間充質干細胞或來自構成多形性免疫圖譜的另一個源的細胞。再者，MSC通常來自已被永生化的細胞系，永生化是通過使用諸如慢病毒之類的載體用SV40大T抗原轉染進行的?？梢允褂米詺⒒蜣D染細胞，與此同時進行永生化，或作為單獨的步驟進行。這種細胞系可用于制備治療癌癥的藥物組合物。該組合物將包括本發(fā)明的MSC群，以及生理相容的緩沖劑或其他賦形劑。本發(fā)明還提供了一種用于治療個體腫瘤的藥劑盒(kit)。該藥劑盒可包含本發(fā)明的藥物組合物以及相應的前藥，其中在該組合物的MSC中的自殺基因的表達導致前藥被轉換為對腫瘤細胞致命的藥物。根據本發(fā)明方法，這樣的藥物組合物和藥劑盒通常與使用指南一起包裝。根據下述的說明，本發(fā)明的其他實施方式將是明顯的。


圖1顯示人類胚胎BMSC的干細胞的特性。I㈧顯示單集落形成能力。I⑶顯示與人類成人的MSC相比，人類胚胎骨髓MSC的多向分化潛能。圖2顯示由流式細胞儀檢測到的人類胚胎骨髓衍生MSC的表面標記。圖3提供了在轉導BMSC編碼大和小T抗原的SV40的質粒(上)以及TK和GFP共表達質粒(下)的基因圖。圖4顯示了 MSC集落(上)、用免疫印跡(Western blot)測得的SV40的表達(中)和在4批轉導MSC中的SV40的表達(下)。圖5顯示了 MSC的GFP陽性集落(上)、挑選集落的基因表達(中)和SV40_TK_GFP表達的MSC形態(tài)。圖6(A)顯示本發(fā)明的基因轉導的MSC的示例性表面標記。 圖6 (B)顯示了 SV40-TK-GFP-過表達hfBMSC的表面標記。
圖7(A)顯示轉導后分選MSC的工作流程。
圖7(B)顯示了從分選的細胞群鑒定的單一集落(10X物鏡)。圖8顯示轉導后MSC的成骨和成脂分化能力。圖9顯示轉導后MSC的細胞增殖。圖10顯示在人類前列腺癌細胞的存在或缺乏的情況下hfBMSC的跨孔遷移能力的
研究結果。圖11顯示慢病毒轉導對BMSC朝向腫瘤遷移的影響。圖12顯示，在SV40-TK-GFP人類胚胎MSC共培養(yǎng)中的GCV對人前列腺癌細胞系(DU145)的體外細胞毒性。圖13顯示對轉導的MSC的MLR分析結果。圖14顯示本發(fā)明的MSC在體內的抗腫瘤效果。
具體實施例方式本發(fā)明提供用于治療癌癥的藥物組合物和治療方法。對間充質干細胞(MSC)進行工程化使其表達將前藥轉化成殺死腫瘤細胞的藥物的自殺基因。將MSC給予具有腫瘤的個體，MSC將由此遷移到腫瘤部位。然后給該個體施用前藥，通過MSC表達的自殺基因該前藥在腫瘤處或腫瘤附近轉化成致命的形式。腫瘤對個體健康的影響因而減少或消除。本發(fā)明相對于以前的間充質干細`胞(MSC)為基礎的治療方式提供了許多改進。這些改進可單獨或合并應用以生產即用型產品，使這些即用型產品具有良好特征的干細胞屬性、腫瘤趨向性、低免疫原性、能夠提供自殺基因至腫瘤微環(huán)境以及有適合成批生產的增殖能力。以前的MSC工作通常依靠新鮮分離的或培養(yǎng)的細胞，該些細胞然后被施用給個體，該個體與該細胞制劑是同源的或異源的。作為實際問題，本發(fā)明的MSC可永生化為具有公知表型的標準化的細胞源，從而可以成規(guī)模地用于商業(yè)用途。已發(fā)現(xiàn)，通過根據本發(fā)明將細胞永生化并可選地選擇該細胞，能夠建立具有持續(xù)增殖能力的混合或克隆細胞系，同時還保留深入到腫瘤細胞的能力從而可以將有效制劑遞送到靶標。還發(fā)現(xiàn)，獲得相對早期的MSC，在潛在的個體人群中可以獲得相對無免疫原性的細胞群以用于藥物。這些細胞因此可以給予具有廣范圍的不同組織類型的個體。這意味著，可以在不知道預期受體的情況下，在治療前制備這些細胞。具有此屬性的藥物組合物可稱作為即用型產品。干細胞的可能的源和表征用于本發(fā)明的MSC制劑的起始細胞群可能要從個體發(fā)生(ontogenetically)的原始源獲取。創(chuàng)造這項發(fā)明所做的實驗研究表明這種獲取方式提供了幾個優(yōu)勢。首先，細胞可以更好地適應組織培養(yǎng)，有更大的增殖能力，并可能更適合基因的改變和永生化。其次,個體發(fā)生(ontogenetically)的原始細胞一般有所需的跨廣泛組織類型的相對無免疫原性的屬性。除非MSC對于預期的受體是自體的，否則MSC給人類的用藥幾乎不可避免地會涉及細胞系和受體之間的組織類型的差異。通常情況下，組織移植會導致免疫初始(naiVe )個體的IV型移植物抗宿主反應，或導致具有預制抗體的個體的超急性排
斥反應。免疫反應可能在細胞與個體的目標腫瘤細胞進行反應之前就將所述細胞清除，或阻止隨后的相同細胞劑型的有效性。然而，可用作本發(fā)明的細胞系或藥物組合物的起始群的早期MSC可能在個體體內是免疫豁免的，或激起沉默(muted)應答。這在以下示例中進行證實，人類的MSC可以在動物模型的異種移植(xenograph)中使用，并仍然有效地將自殺基因遞送至腫瘤部位。示例性的起始MSC可從第二或第三孕期胚胎組織中獲得:特別是從骨髓中(例I)獲得。原理上，胚胎MSC也可以從胚胎間充質細胞、中胚層、臍帶血、胚胎組織勻漿或其他胚胎組織中獲得。人的多能間充質干細胞也可以從羊水分離(Tsai MS et al., HumReprod.2004Jun ；19(6):1450-6)。MSC可根據功能特性和表型標記進行表征。例如,它們可能是⑶34-ve,⑶44+ve,CD73+ve，和CD90+ve (例3)。美國專利US 2006/0166214A1提供了檢測間充質干細胞的標記系統(tǒng)和區(qū)分間充質干細 胞的方法。也請參見P M等在Open Orthop J.2011 ；5 (Suppl 2):253-6中對用于間充質干細胞的細胞表面標記的評述。MSC群也可由功能性特征進行表征，這些功能性特征如分化為成骨、成脂或軟骨組織的能力和/或深入到腫瘤細胞的能力。只要細胞有深入腫瘤和自殺基因表達的屬性,這些功能就不是絕對必要的。然而，表型標記可用于細胞制備以從其他細胞類型中篩選出所需的MSC。它們也可用于不同階段的質量控制，例如，在初始分離時、經過一段時間組織培養(yǎng)后、在永生化后、在轉導以表達自殺基因后以及在制備藥物廣品后。永生化一旦源MSC適應了組織培養(yǎng)，就可以對其進行處理以提高增殖能力和/或增殖率。有幾種方法可用于哺乳動物細胞在培養(yǎng)基中的永生化。病毒基因，包括猿猴病毒40(SV40)T抗原、EB病毒(EBV)、腺病毒Ela和Elb、和人類乳頭狀瘤病毒(HPV) E6和E7，可誘導不同類型的細胞永生化。在大多數(shù)情況下，病毒基因通過使誘導細胞進入復制性衰老狀態(tài)的抑癌基因(P53，Rb和其他)失活來實現(xiàn)永生化。實現(xiàn)細胞永生化的另一種方法是通過表達端粒酶逆轉錄酶蛋白(TERT)。這種蛋白在大多數(shù)體細胞中是不活躍的，但當hTERT外源性表達時，細胞能夠維持足以避免衰老的端粒長度。一些對端粒酶-永生化的細胞株的分析已證實，細胞保持了穩(wěn)定的基因型以及保留了關鍵的表型標記:見美國專利N0.7195911。
SV40T抗原已被證明是在培養(yǎng)基中轉化許多不同類型細胞的可信賴試劑。細胞可通過象慢病毒這樣的遞送載體轉染關鍵SV40基因而被永生化，而不是感染病毒SV40本身?？蛇x地，同樣的載體可用于同時遞送自殺基因(下文)，或者是象綠色熒光蛋白(GFP)這樣的標記基因。合適的載體是市售的。例如,Capital Biosciences提供的重組慢病毒載體，該載體含有SV40大和小T抗原，可表達用于基因特異性的細胞永生化的突變pLent1-SV40基因。MSC 一旦以這樣的方式處理后，就可測試它們的增殖能力，例如，使用標準的BrdU試驗(3例)。如果細胞的增殖特性不是最佳的，細胞群還可以接受幾輪的永生化。也可能通過同時轉染諸如SV40T抗原基因以及細胞標記物來對增殖能力提高的細胞進行富集。例如，標記物可以編碼在相同的載體中，通過IRES把它與SV40抗原分隔開來。如果標記物是化學發(fā)光的或象綠色熒光蛋白(GFP)這樣生物發(fā)光的，細胞可以通過熒光激活細胞分選來富集。另外，如果標記物是獨特的細胞表面抗原，被轉染的細胞可用特異性針對標記物的熒光抗體來富集。使用者可對細胞進行任意按需組合的多輪細胞永生化和富集。自殺基因轉導本發(fā)明的MSC經過基因改造以表達自殺基因?？捎萌魏魏线m的使自殺基因的表達由在祀組織或腫瘤細胞中具有活性的啟動子控制的載體?？蛇x擇在所有細胞具有活性的啟動子，如CMV啟動子。此外，也可以選擇啟動子使得自殺基因是組織特異性的。這意味著它只在目標特征的細胞中表達。例如，針對前列腺癌的藥劑可包括在PSA啟動子控制下的自殺基因。載體可以選擇性地包括諸如SV40T抗原的永生化成分，以使得永生化與自殺基因的轉導可一步完成。載體可以選擇性地包含熒光標記物或細胞表面標記物，以協(xié)助隨后富集表達自殺基因的被轉導細胞。

一旦自殺基因表達到足夠水平的細胞群已經建立，其療效可通過該細胞群和來自腫瘤細胞系(優(yōu)選與擬接受治療的人群的目標腫瘤的類型相同)的細胞群在體外結合的方法來測試。MSC有機會表達自殺基因以后，將前藥添加到培養(yǎng)基中，然后測定由此產生的對腫瘤細胞的毒性。按照本發(fā)明的治療方法，療效可用合適的動物模型(例7)進行活體測試。在本發(fā)明中的術語“自殺基因”是指表達能夠把特定的前藥轉換成對目標腫瘤細胞具有毒性的藥物的酶的基因。這種藥物可以對或可以不對把它傳遞到腫瘤部位的MSC有毒性。雖然來自于HSV的胸苷激酶(TK)已經作為本發(fā)明的自殺基因原型，還有其他選擇。根據靶細胞類型、預期的效果、和前藥的適用性，表I所示的基因藥物組合可以根據本發(fā)明進行測試和開發(fā)。(表改編自 W.A.Denny, J.Biomedicine Biotechnol 1:48-70,2003年)。
權利要求
1.治療個體所罹患的腫瘤的方法，其包括: a)向該個體施予重組表達自殺基因的間充質干細胞群； b)等待足夠時間使得至少一些所述間充質干細胞從它們在步驟a)中的施予部位遷移至所述腫瘤所處的部位或所述腫瘤所處部位的附近；以及然后 c)給予所述個體有效量的前藥，藉此，由位于所述腫瘤部位或者其附近的所述間充質干細胞表達的所述自殺基因引起所述前藥轉換成殺死腫瘤細胞的藥物。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述間充質干細胞群是多向性的。
3.根據權利要求1所述的方法，其中所述細胞已被永生化。
4.根據權利要求3所述的方法，其中通過轉染SV40大T抗原使所述細胞永生化。
5.根據權利要求1所述的方法，其中所述細胞是胚胎間充質干細胞。
6.根據權利要求1所述的方法，其中所述自殺基因是胸苷激酶。
7.根據權利要求6所述的方法，其中所述前藥是更昔洛韋。
8.多向性間充質干細胞系，其重組表達自殺基因。
9.根據權利要求8所述的細胞系，其中所述細胞已被永生化。
10.根據權利要求9所述的細胞系，其中所述細胞已通過轉染慢病毒永生化。
11.根據權利要 求8所述的細胞系，其中所述細胞是胚胎間充質干細胞。
12.根據權利要求8所述的細胞系，其中所述自殺基因是胸苷激酶。
13.用于治療癌癥的藥物組合物，其包括根據權利要求8所述的間充質干細胞系以及生理學上相容的緩沖液。
14.用于治療個體所罹患的腫瘤的藥劑盒，其包括: a)根據權利要求8所述的藥物組合物，以及 b)前藥，其中所述組合物的所述間充質干細胞中表達的所述自殺基因引起所述前藥轉換成殺死腫瘤細胞的藥物。
15.根據權利要求14所述的藥劑盒，其中所述自殺基因是胸苷激酶，所述前藥是更昔洛韋。
全文摘要
本發(fā)明提供一種使用表達自殺基因的間充質干細胞(MSC)的細胞介導的癌癥基因治療。向有腫瘤的個體施予該MSC，讓該MSC遷移到腫瘤部位，并且接著向所述個體施用前藥。該MSC在腫瘤部位對自殺基因的表達將所述前藥轉換成殺死腫瘤細胞的藥物。腫瘤對該個體健康的影響因而能夠減輕或者消除。本發(fā)明的MSC通過使用永生化的MSC系以及篩選具有免疫學特性的MSC以防止移植物抗宿主反應，可最優(yōu)化為即用型產品。
文檔編號A61P35/00GK103182089SQ20111045867
公開日2013年7月3日 申請日期2011年12月31日 優(yōu)先權日2011年12月30日
發(fā)明者李剛, 李郁偉, 劉寶盈 申請人:香港中文大學