專利名稱：刺激宿主抗病毒攻擊的防御機(jī)制的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過口粘膜給藥刺激宿主哺乳動(dòng)物體內(nèi)的宿主防御機(jī)制對(duì)抗引起病理學(xué)條件反射的方法。具體地說，本發(fā)明可應(yīng)用于治療自身免疫病、分支桿菌病、神經(jīng)退化性疾病、寄生蟲病和病毒病的方法。
本發(fā)明的背景技術(shù)α干擾素(IFN-α)廣泛用于治療各種各樣的疾病，包括白血病、淋巴瘤、與愛滋病相關(guān)的卡波西氏肉瘤和肝炎(Gutterman,J.U.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1994 91:1198-1205)。β干擾素(IFN-β)已被批準(zhǔn)臨床用于治療復(fù)發(fā)-緩解性多發(fā)性硬化癥及乙肝病毒的慢性感染。α干擾素和β干擾素都是Ⅰ型干擾素。雖然通常有許多途徑可用于Ⅰ型干擾素給藥，包括靜脈內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、局部和損傷部位內(nèi)注射，但是口腔途徑尚未使用，因?yàn)槿藗冋J(rèn)為干擾素是一種因蛋白水解酶失活的蛋白質(zhì)，并且在胃腸道內(nèi)不能以其天然形式吸收。確實(shí)有許多研究未能在口服給藥后在血液中檢測到干擾素(Cantell and Pyhala,J.Gen.Virol.,1973 20:99-104；Wills等人，J.IFN Res.,1984 4:399-409；Gilson等人，J.IFN Res.,1985 5:403-408)。
已顯示干擾素誘導(dǎo)劑能夠保護(hù)小鼠抵御波黑瘧原蟲(Plasmo-dium berghei)瘧疾的實(shí)驗(yàn)性感染，并且這種保護(hù)作用對(duì)子孢子引起的感染比對(duì)寄生蟲的血液形式引起的感染有效得多(Jahiel等人，Science.1986,16:1802；Nature,1968,220:710；Amer.J.Trop.Med.Hyg.,1969,18:823)。經(jīng)腹腔內(nèi)或靜脈內(nèi)途徑注射了在感染新域病病毒的小鼠的混合血清中的干擾素的小鼠受到保護(hù)使之避免子孢子誘發(fā)的波黑瘧原蟲瘧疾。然而，來自兔血清的干擾素是無效的。在寄生蟲發(fā)育的原紅細(xì)胞階段(即在接種子孢子前3小時(shí)或接種后不超過40小時(shí)[Jahiel等人，Nature1970,227:1350-1351])注射干擾素可獲得保護(hù)作用。
迄今已有許多關(guān)于在治療各種病毒性疾病特別是在治療流感中作為鼻噴霧劑或口服液體配方給藥的小劑量干擾素的效力的軼事性報(bào)道。但在大多數(shù)報(bào)道中，所使用的干擾素制劑都是比較粗制的。用較高劑量鼻內(nèi)干擾素治療鼻病毒感染的安慰劑對(duì)照試驗(yàn)顯示治療是有效的，但副作用的發(fā)病率相當(dāng)高(Hayden等人，J.Infect Dis.,1983,148:914-921)。同樣，雖然有許多包括隨機(jī)雙盲臨床試驗(yàn)的研究(Douglas等人，New Engl.J.Med.,1986,314:65-80；Hayden等人，NeωEngl.J.Med.,1986,314:71-75)已經(jīng)證明通過鼻飼給藥投用高劑量重組干擾素α2在抗鼻病毒感染中的效力，但這些研究并沒有提供有關(guān)全身作用的證據(jù)。
最近有一系列專利說明書描述了使用低劑量口服給藥的異種來源的干擾素治療家畜的感染性鼻氣管炎(“運(yùn)輸熱”)和貓白血病，以及在治療其他病癥、增強(qiáng)疫苗的效力、改善食物利用的效率、以及預(yù)防牛泰勒氏梨漿蟲病中的用途。分別參閱美國專利No.4,462,985、澳大利亞專利No.608519、澳大利專利No.583332和美國專利No.5,215,741。在這些說明書中，所使用的干擾素都是按Cantell的方法制備的、加在磷酸鹽緩沖鹽水中以每磅體重0.01至5IU的劑量給藥的人α干擾素。雖然這些說明書中都提出如此低劑量的經(jīng)口咽粘膜并優(yōu)選以適合與口粘膜長時(shí)間接觸的方式給藥的干擾素對(duì)各種病癥可能是有效的，但除了運(yùn)輸熱、貓白血病、犬細(xì)小病毒感染和泰勒氏梨漿蟲以外的病癥的實(shí)驗(yàn)證據(jù)大都是軼事性的。
已經(jīng)有人對(duì)近年來有關(guān)通過口或口咽粘膜給藥的非常低劑量干擾素的效果的研究結(jié)果進(jìn)行了綜述(Bocci,Clin.Pharmacokinet.,1991,21:411-417；Critic.Reu.Therap.Drug Carrier Systems.1992,9:91-133；Cummins and Georgiades,Archiuum.Immun.Therap.Exp.,1993,41:169-172)。已有人提出這種類型的治療對(duì)于治療HIV感染是特別有用的，并且至少可以改善愛滋病患者的生存質(zhì)量(Kaiser等人，AIDS,1992,6:563-569；Koech等人，Mol.Biol.Ther.,1990,2:91-95)。然而，其他一些報(bào)告指出這些治療并沒有提供臨床益處。也已有人報(bào)告了使用包含低劑量干擾素的含片治療乙型肝炎的階段Ⅰ的研究結(jié)果(Zeilinska等人，Archiv.Immunol.Therap.Exp.,1993.41:241-252)。
相反，Brigham和Women′s Hospital的國際專利申請(qǐng)WO95/27499指出按充分認(rèn)定的動(dòng)物模型如果在誘導(dǎo)抗原之前借助胃管法給藥的β干擾素至少可以部分地抑制如Ⅰ型糖尿病、多發(fā)性硬化癥及自身免疫性關(guān)節(jié)炎等自身免疫病的發(fā)展。借助這種途經(jīng)或腹腔內(nèi)途徑與胃內(nèi)“旁觀者”抗原結(jié)合給藥的β干擾素在誘導(dǎo)耐受性方面甚至更有效。這意味著β干擾素在提高口服耐受性的誘導(dǎo)作用中是有效的，而不是在誘導(dǎo)體液或細(xì)胞對(duì)外源性抗原的反應(yīng)方面有效。
本發(fā)明概述本發(fā)明提供一種借助干擾素經(jīng)口粘膜給藥刺激哺乳動(dòng)物宿主防御機(jī)制的方法。一個(gè)方面，可以將本發(fā)明看作是一種經(jīng)口粘膜接觸將免疫調(diào)節(jié)量的干擾素提供給哺乳動(dòng)物刺激哺乳動(dòng)物體內(nèi)免疫反應(yīng)的方法。
本發(fā)明提供一種借助口粘膜接觸將治療有效量的干擾素提供給哺乳動(dòng)物治療哺乳動(dòng)物的自身免疫病、分支桿菌病、神經(jīng)退化性疾病、寄生蟲病和病毒性疾病的方法。干擾素的給藥量小于經(jīng)胃腸道外給藥時(shí)誘發(fā)病理學(xué)反應(yīng)的量。本發(fā)明提供治療諸如關(guān)節(jié)炎、Ⅰ型糖尿病、狼瘡和多發(fā)性硬化癥之類的自身免疫病、諸如麻風(fēng)和結(jié)核病之類的分支桿菌病、諸如海綿狀腦炎和Crelltzfeldt-Jakob病之類的神經(jīng)退化性疾病、瘧疾之類的寄生蟲病、以及諸如宮頸癌、生殖器皰疹、乙型和丙型肝炎、HIV、HPV、HSV-1和HSV-2之類的毒病的方法。
口粘膜給藥可包括以單次量完成有效劑量干擾素的給藥，也可以在足以引發(fā)相當(dāng)于單次量的宿主防御刺激作用的時(shí)間里以多次較小劑量完成有效劑量的給藥。類似地，有效劑量的干擾素還可以在足以引發(fā)相當(dāng)于單次量的宿主防御刺激作用的時(shí)間里連續(xù)給藥。
實(shí)踐中，每天給藥從大約1500IU、優(yōu)選從500IU，到大約20×106IU的干擾素，更優(yōu)選的是從每天大約1×104IU到大約1×106IU的干擾素，條件是選定的劑量經(jīng)胃腸道外給藥時(shí)不誘發(fā)病理學(xué)反應(yīng)，即少于經(jīng)胃腸道外給藥時(shí)誘發(fā)病理學(xué)反應(yīng)的量。這些劑量范圍通常是指人體中的同源干擾素-α。用特定的干擾素為患者治病的醫(yī)生將能夠很容易地依據(jù)本發(fā)明識(shí)別適當(dāng)?shù)闹委焺┝糠秶?br> 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供適于經(jīng)口粘膜給藥的藥物組合物，該藥物組合物包括至少一種治療有效量的干擾素。該組合物可以作為溶液、片劑、錠劑、凝膠、糖漿、軟膏或作為經(jīng)口粘膜的控釋給藥系統(tǒng)來提供。組合物還可以非必選地包含緩沖劑、穩(wěn)定性、增稠劑、吸收增強(qiáng)劑和增粘劑等。
在一個(gè)實(shí)施方案中，該藥物組合物是以單位劑量形式提供的，其中含有從大約1500IU、優(yōu)選從大約5000IU到大約20×106IU的干擾素，更優(yōu)選的是從大約1×104IU到大約20×106IU的干擾素，最優(yōu)選的是從大約1×104IU大約1×106IU的干擾素。
在實(shí)踐中，該方法可以作為單獨(dú)的治療手段，也可以作為其他治療的輔助療法，還可以使用白介素-2、-12或-15之類的其它細(xì)胞因子，或使用IFN誘導(dǎo)劑。
在實(shí)踐中，該方法使用Ⅰ型或Ⅱ干擾素，選自IFN-α、β、-γ、-ω和共有IFN，優(yōu)選的是采用重組的IFN-α。
本發(fā)明的詳細(xì)敘述現(xiàn)在將僅僅參照下述定義和實(shí)施例詳細(xì)介紹本發(fā)明。文中提到的所有專利和出版物均被并入，以供參考。定義文中所述“干擾素”是指包括那些通常用α、β、γ和ω命名的干擾素在內(nèi)的Ⅰ型或Ⅱ干擾素，以及它們的混合物，包括共有序列。干擾素可從各種商業(yè)來源得到，并且已被批準(zhǔn)用于治療多種病癥。干擾素可以來自天然的來源，但優(yōu)選的是重組產(chǎn)品。就本發(fā)明的目的而言，術(shù)語“干擾素”還包括具有干擾素活性的多肽或其片段，以及在諸如美國專利No.5,582824、5,593,667和5,594,107中揭示的，例如為了在不影響其生物學(xué)活性性質(zhì)的條件下提高穩(wěn)定性而引入了順序變體的嵌合或突變形式的干擾素。
雖然人們將會(huì)清楚地理解本發(fā)明可應(yīng)用于任何刺激宿主防御機(jī)制(即免疫刺激作用)將帶來益處的病癥，但優(yōu)選的是所述病癥是自身免疫病或病毒感染或寄生蟲感染。人們還應(yīng)當(dāng)理解就本發(fā)明的目的而言干擾素可以單獨(dú)使用也可以與另一種藥劑或治療方法結(jié)合使用。
干擾素可以非必選地與干擾素合成和釋放的誘導(dǎo)劑同時(shí)給藥。誘導(dǎo)劑可以與干擾素一起給藥，也可以分別給藥。各種各樣的干擾素誘導(dǎo)劑是已知的，例如象poly I:C之類的多核苷酸；優(yōu)選的是使用低分子量的、可口服給藥的誘導(dǎo)劑。適用的誘導(dǎo)劑在本領(lǐng)域中是已知的，例如雙二乙氨乙基芴酮Tilorone(美國專利No.3,592,819；Albrecht等人，J.Med,Chem.,1974 17:1150-1156)和喹諾酮衍生物Imiguimod(Savage等人，Brit.J.Cancer,1996 74:1482-1486)。
本發(fā)明的方法和組合物可以非必選地與一種或多種其他療法結(jié)合、治療特定的病癥，并且值班醫(yī)生或獸醫(yī)將能夠很容易地選擇適合該條件的其它療法。
病毒引起的病癥可以是急性或暴發(fā)性感染，如鼻病毒、流感、水痘皰疹、帶狀皰疹、登革熱，或包括但不只限于麻診病毒腦炎、Marray Valley腦炎、日本乙型腦炎、森林腦炎和Herpes腦炎在內(nèi)的病毒性腦炎；如Ebola病毒、Marburg病毒、粒沙熱引起的出血熱；Hanta病毒感染，以及由動(dòng)物傳播給人的其他病毒如馬麻疹病毒感染。其中有許多感染目前還沒有治療辦法和/或可利用的設(shè)苗，并且支持性治療可能是不夠的。另外，病毒引起的病癥可能是慢性感染的結(jié)果，例如乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎或其他病毒性肝炎，以及CMV、HIV、HPV、以及HSV-I&Ⅱ染。目前乙型肝炎和丙型肝炎都是用干擾素經(jīng)胃腸道外給藥治療的；對(duì)于已發(fā)展成愛滋病的HIV感染的長期干擾素治療正在臨床試用之中。
在第二個(gè)實(shí)施方案中，待治療的疾病是瘧病，并且再次如上所述的那樣實(shí)施Ⅰ型和Ⅱ型干擾素的給藥。瘧病的病原生物體可以是三日瘧原蟲(Plasmokium malariae)、間日瘧原蟲(Plasmo-diumvivas)、惡性瘧原蟲(Plasmodium falcoparum)、或卵形瘧原蟲(Plasmodium orale)。特別期待的是，本發(fā)明的方法將阻止瘧疾惡化成腦型瘧疾。
在第三個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種治療諸如HIV感染、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)類及多發(fā)性硬化癥之類的自身免疫機(jī)能障礙(無論是恢復(fù)-緩解型的還是慢性進(jìn)行性的)或治療愛滋病之類免疫缺陷的方法，該方法包括上述的干擾素給藥步驟。
另外，本發(fā)明的方法和劑量形式可以與其他治療聯(lián)合使用。例如，對(duì)于皰疹病毒感染可以用阿若洛韋(acyclovir)或更昔洛(ganciclovir)。對(duì)于HIV感染，可以使用疊氮胸苷(阿西夫定)或一種或多種其他HIV反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，和/或HIV蛋白酶抑制劑。
在制備本發(fā)明的藥物組合物時(shí)可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的各種用于IFN的載體和賦形劑。在Remington:The Science andPractice of Pharmacy(19th ed.,Mack Publishing Co.,Easton,PA,1995)及其較早的版本中教導(dǎo)了有代表性的配制技術(shù)。IFN配方可以包括穩(wěn)定性增強(qiáng)劑(如美國專利No.4,496,537所介紹的甘氨酸或丙氨酸)和/或的一種或多種載體(如載體蛋白質(zhì))。例如，為了給人治病，通常使用藥品級(jí)人血清白蛋白，并且可非必選地使用磷酸鹽緩沖鹽水作為稀釋劑。在IFN的賦形劑是人血清白蛋白時(shí)，人血清白蛋白可以來源于人血清，也可以是重組源的。在正常情況下所用的血清白蛋白是同源的。
IFN可以借助任何使IFN與受體的口粘膜腔接觸的方式給藥。因此，人們將清楚地理解，本發(fā)明不限于任何具體類型的配方。本說明書介紹深入口粘膜腔的IFN給藥；這可以通過液體、固體、氣溶膠、以及滴鼻劑或噴霧劑來實(shí)現(xiàn)。因此，本發(fā)明包括但不只限于液體、氣霧劑、糖漿、錠劑、含片和噴霧劑配方。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能理解制劑的粒度對(duì)氣溶膠或噴霧劑的配制可能至關(guān)重要，并且知道適合用于調(diào)整粒度的方法。
一方面，以每日一次的劑量實(shí)施干擾素給藥。另一方面，干擾素也可以在一段時(shí)間內(nèi)以多次低劑量方式給藥，以使總效果相當(dāng)于單次高劑量的給藥。實(shí)現(xiàn)這種給藥方式的一種途徑是借助附著在或植入到口粘膜腔中并為在一段時(shí)間內(nèi)持續(xù)地或受控地釋放相當(dāng)于單次高劑量干擾素設(shè)計(jì)的裝置提供的。
有代表性的適合口粘膜給藥的干擾素配方包括下列制劑(所有百分比均為重量百分比)片劑右旋糖BP45％；白明膠BP30％；小麥淀粉BP11％；羧甲纖維素鈉BP5％；卵白蛋白BPC4％；亮氨酸USP3％；丙二醇BP2％；和1×106IU的IFN-α2。片劑可以原樣使用并讓它在口中緩慢地溶解，也可以溶解在水中并且在需要時(shí)含在嘴里與口粘膜保持接觸。
干擾素軟膏可以象在美國專利No.4,615,184中介紹的那樣由甘油45％、羧甲纖維素鈉2％、檸檬酸鹽緩沖液(PH4.5)25％、加至100％的蒸餾水，以及l(fā)×106IU的IFN-α2制備。干擾素軟膏可以粘附在口頰粘膜上。
同樣，含漱液或糖漿可以借助在市售的嗽口液或止咳糖漿中添加所需量的干擾素來制備。
在上文提到的特定劑量范圍內(nèi)，在任何個(gè)別病例中最佳治療方案取決于所涉及病癥的性質(zhì)、疾病的階段、前期治療、正在繼續(xù)的其他治療、該哺乳動(dòng)物的一般健康狀況、治療對(duì)象對(duì)干擾素的敏感性等因素，因此將任憑醫(yī)生或獸醫(yī)考慮所有這些情況自行處理。療程長短當(dāng)然將隨被治療的病情變化，例如，急性病毒感染(如Ebola病毒感染)的治療可能將涉及不同于治療慢性病癥(如肝炎)的療程。
本文所揭示的有效劑量是經(jīng)胃腸道外途徑給藥時(shí)在哺乳動(dòng)物體內(nèi)不產(chǎn)生病理學(xué)反應(yīng)的劑量。病理學(xué)反應(yīng)可以是急性的、慢性的或累積性的，并可以由血液化學(xué)，例如白細(xì)胞減少、骨髓抑制或其他組織學(xué)參數(shù)的變化體現(xiàn)出來。本文所用術(shù)語“病理學(xué)反應(yīng)”包括發(fā)燒、不適、或類似流感的癥狀之類的不良的副反應(yīng)；血管反應(yīng)(如靜脈炎)；以及在注射部位的局部炎癥。從個(gè)體對(duì)干擾素敏感性的差異來看，這些反應(yīng)在病人群體中有很大不同。一種鑒別經(jīng)口粘膜治療時(shí)可接受的低劑量干擾素的簡單試驗(yàn)是依據(jù)病人的年齡、體重、癥狀、病程等因素給病人注射公認(rèn)可接受的劑量，并確定注射是否產(chǎn)生在此定義的病理學(xué)反應(yīng)，在注射部位的局部刺激作用是最容易判斷的標(biāo)準(zhǔn)。如果沒有不良反應(yīng)，相同的劑量就可以經(jīng)口粘膜給藥。如果有不良反應(yīng)，則應(yīng)以較低劑量重復(fù)實(shí)驗(yàn)，直至找到無病理學(xué)反應(yīng)的劑量為止。
對(duì)于許多病人來說，預(yù)期經(jīng)口粘膜給藥的劑量將與按現(xiàn)已批準(zhǔn)的胃腸道外給藥議定書已知允許使用的有效劑量差不多是一樣的。因此，就具體的病例而言，可接受的干擾素低劑量可以從每天大約1500IU，優(yōu)選5000IU至大約20×106IU。更優(yōu)選的劑量是從每天大約1×104IU至大約20×106IU干擾素，最優(yōu)選從每天從大約1×104IU到大約1×106IU干擾素，條件是該劑量在經(jīng)胃腸道外給藥時(shí)不誘發(fā)病理學(xué)反應(yīng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，總劑量可以在同樣時(shí)間里以多次低劑量方式給藥，甚至可以從附著在或植入到口粘膜的控釋裝置以連續(xù)或脈動(dòng)方式給藥。干擾素和干擾素配方小鼠IFN-α/β小鼠IFNα/β(Mu IFN-α/β)是由新城疫病毒(NDV)誘導(dǎo)的C243-3細(xì)胞的培養(yǎng)基制備的，并且象以前介紹的那樣(Tovey等人，Proc.Soc.Exp.Biol.and Med；1974 146:809-815)純化。在這項(xiàng)研究中使用的制劑具有4×106國際單位(IU)/ml的滴度并且具有5×107IU/mg蛋白質(zhì)的比活性，這是象以前介紹的那樣(Tovey等人，Proc.Soc.Exp.Biol.and Med；1974 146:809-815)在受皰疹性口腔炎病毒(VSV)攻擊的小鼠929細(xì)胞上檢測的結(jié)果。該制劑比照美國國立衛(wèi)生研究所(NIH)的小鼠IFNα/β國際基準(zhǔn)制劑(G-002-9004-5411)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。
人IFN-α1-8重組的人IFN-α1-8(Hu IFN-α1-8；BDBB批號(hào)CGP35269,Ciba-Geigy,Basel,Switzerland)象以前介紹的那樣(Meister等人；J.Gen,Virol；1986 67:1633-1643)制備并純化的。在研究中使用的制劑象以前介紹的那樣(Tovey等人；Nature,1977 267:455-457)在受VSV攻擊的同源的人WISH細(xì)胞上具有70×106IU/ml的滴度，而在異源的鼠L929細(xì)胞上具有1×106IU/ml的滴度。該制劑比照NIH人IFN-α國際基準(zhǔn)制劑(G-023-901-527)和小鼠IFNα/β標(biāo)準(zhǔn)(G-002-9004-5411)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。該IFN制劑的比活性為2×108IU/mg蛋白質(zhì)。
重組小鼠干擾素-α重組小鼠干擾素-α購自Life Technologies公司。在這項(xiàng)研究中使用的制劑(批號(hào)HKK404)在受VSV攻擊的小鼠L929細(xì)胞上檢測時(shí)具有具有6×106IU/ml的滴度和6×108IU/mg蛋白質(zhì)的比活性(Tovey等人；Proc.Soc.Exp Biol Med.,1974 146:406-415)。
重組小鼠干擾素-β重組小鼠干擾素-β購自R&D Systems公司。在這項(xiàng)研究中使用的制劑(批號(hào)1976-01S)在受VSV攻擊的小鼠L929細(xì)胞上檢測時(shí)具有具有3.2×104IU/ml的滴度和8×106IU/mg蛋白質(zhì)的比活性(Tovey等人；Proc.Soc.Exp Biol Med.,1974 146:406-415)。
重組小鼠干擾素-γ重組小鼠干擾素-γ購自R&D Systems公司。本研究所用的制劑(2580-03SA)在受VSV攻擊的L929細(xì)胞上檢測時(shí)具有2×105IU/ml的滴度和1×107IU/mg蛋白質(zhì)的比活性(Tovey等人；Proc.Soc.Exp Biol Med；1974 146:406-415)。
所有的干擾素制劑同時(shí)以相同的檢定法滴定，并比照美國國立衛(wèi)生研究所(NIH)的小鼠干擾素α/β國際基準(zhǔn)制劑(G-002-9004-5411)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。
小鼠干擾素α/β和重組小鼠干擾素兩者均在給藥前用FerimmuneTM賦形劑重新配制。賦形劑干擾素制劑用含有牛血清蛋白質(zhì)(BSA)的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)稀釋。將牛血清血蛋白成分V(RIA級(jí)，無免疫球蛋白；藥品批號(hào)A7888；Sigma,VSA)以100μg/ml的最終濃度溶解在PBS中(pH7.4)并過濾除菌(0.2μ,Millex-GV,Millipore,USA)。
在本文中介紹的實(shí)驗(yàn)中，使用專有賦形劑稀釋干擾素制劑。所用的賦形劑(Ferimmune harma,Pacific)是以片劑形式供應(yīng)的，其組成如下<
>**在無水基礎(chǔ)上計(jì)算的***推導(dǎo)自右旋糖(葡萄糖)BP(無水的) 44.64％葡萄糖BP(作為葡聚糖40注射劑) 0.03％將一片溶解于1.5ml磷酸鹽緩沖鹽水中，以16,000g離心15分鐘，然后無菌過濾(0.2μ,Millex-GV,Millipore,USA)，并在使用前在4℃下貯存。每天在使用前制備賦形劑。干擾素遞送系統(tǒng)初步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明用P20 Eppendorf微量移液管將5μl結(jié)晶紫施加到正常成年小鼠的每個(gè)鼻孔中，這將導(dǎo)致染料幾乎立即分布到口咽腔的整個(gè)表面上。在施加染料后約30分鐘，口咽腔的染色仍很明顯。采用同樣方式施加帶125I-標(biāo)記的重組干擾素α1-8，獲得基本上相似的結(jié)果。所以，這種給藥方法被用在所有的后續(xù)實(shí)驗(yàn)中。
就本說明書中介紹的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?，人們將?huì)清楚地理解，有關(guān)IFN給藥途徑的表述“口粘膜”或“口咽”或“鼻內(nèi)/口”或“鼻內(nèi)加口”或“in/or”都是指深入鼻腔的IFN制劑給藥，以使它迅速分布到口粘膜腔內(nèi)，即受體動(dòng)物的口和咽部內(nèi)，以便與該腔的粘膜襯接觸。EMCV(腦心肌炎病毒)分批批號(hào)095001截止日期1997年12月制備使用以前描述的方法(Gresser I.Bourali C,Thomas MT,FalcoffE.重復(fù)接種干擾素制劑對(duì)感染腦心肌炎病毒的小鼠的影響，Pro Soc Exp.Biol Med.,1968年2月，127:491-6)在小鼠L929的細(xì)胞上增殖EMCV毒株JH。
特征這項(xiàng)研究所用的病毒原液在小鼠L929細(xì)胞上的滴度為5×108.62TCID50。
貯存在-70℃貯存EMCV原液。在病毒滴定的第1天斷電，被迫暫時(shí)轉(zhuǎn)移到溫度近似相同的備用庫。材料始終保持凍結(jié)狀態(tài)。在病毒滴定的第8天，將-70℃的冰箱溫度升至-60℃。即將使用前制備稀釋的EMCV，并存放在冰上或動(dòng)物室冰箱內(nèi)備用。動(dòng)物在這項(xiàng)研究中所用的小鼠是從無特異病原體的群體(IFFACREDO,France)獲得的。這些小鼠按照EEC標(biāo)準(zhǔn)圈養(yǎng)在無特異病原體的動(dòng)物試驗(yàn)室內(nèi)(位于Institut Federatif CNRS,Villejuif)。干擾素的生物檢定按照常規(guī)方法檢定干擾素。簡單地說，樣品(20μl)用80μl包含2％熱滅活的胎牛血清(FCS)(Gibco,France)的Eagle氏極限基本培養(yǎng)基MEM(Gibco,rance)稀釋，并且用多道移液管(Finnpipette,Labsystem,50-300ml)添加到微量滴定板(Falcon，批號(hào)3072)的每個(gè)孔中。將WISH或L929細(xì)胞(2×104細(xì)胞/孔)添加到包含2％FCS的100μlMEN中并在含5％CO2的空氣氣氛(Forma3029CO2孵箱)中在37℃下孵化過夜。然后用裝有10倍物鏡的Olympus IM GLDW倒置顯然微鏡檢查細(xì)胞的毒性征象。然后，從1∶10稀釋開始以包含2％FCS的總體積為200μl的Eagle氏MEM對(duì)未呈現(xiàn)可檢出毒性的樣品進(jìn)行連續(xù)的加倍稀釋，其方法是用多道移液管將100μl稀釋材料歸入每孔包含100μl新鮮的含2％FCS的Eagle氏MEM的微板上。同時(shí)還制備NIH人IFN-α的參考標(biāo)準(zhǔn)(G-023-901-527)或NIH Mu IFN-α/β的參考標(biāo)準(zhǔn)(G-002-9004-5411)的適當(dāng)?shù)倪B續(xù)加倍稀釋液。然后，在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境中用100ml包含2％FCS的Eagle氏MEM將WISH或L929細(xì)胞(2×104細(xì)胞/孔)添加到每塊板上，并在含有5％CO2的空氣環(huán)境中在37℃下保溫過夜。然后檢查細(xì)胞單層的毒性征象并且沒有任何顯著的毒性，將培養(yǎng)物抽吸出來并用200μl含有2％FCS和100TCID50的VSV(WISH細(xì)胞為2×10-4VSV23，或L929細(xì)胞為10-5VSV23)的Eagle氏MEM替代。然后，將這些板在包含5％CO2的空氣氣氛中在37℃下保溫過夜。然后，用Olympus IM VL WD倒置顯微鏡檢查細(xì)胞單層有無特異病毒的細(xì)胞病變作用。干擾素的滴度是由給出50％抗特異病毒細(xì)胞病變效應(yīng)的稀釋度的倒數(shù)確定的，并且以國際參考單位/毫升(IU/ml)表示。實(shí)施例1經(jīng)口腔粘膜給藥的干擾素的抗病毒感染作用使小鼠腹腔內(nèi)感染腦心肌炎病毒(EMCV)將引起以累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)和腦炎為特征的迅速惡化的致死性疾病(Rueckart,R.R.,Virology,Fields ed.,705-738,1985,Raven Press,New York)。無論是預(yù)防性給藥，還是在靶器官內(nèi)已發(fā)生病毒復(fù)制后給藥，干擾素-α都顯示出在阻止小鼠感染致死性IMCV病毒時(shí)是有效的(Finter,N.B.,Front of 13:01.,1973,2:135-147)。因此，在這些研究中，我們確定經(jīng)口粘膜給藥的低劑量天然或重組IFN對(duì)注射了致死量EMCV的小鼠的存活率的影響，即采用非常嚴(yán)格的抗病毒活性試驗(yàn)。
象以前介紹的那樣(Gresser等人，Proc.Soc.Exp.Biol.AndMed.,1968,127:491-496)在小鼠L929細(xì)胞上增殖腦心肌炎病毒株(JH)。在這項(xiàng)研究(EMC-α)中使用的病毒原液在小鼠L929細(xì)胞上有5×108.62TCID50的滴度。
用200或2000IU的MuIFN-α/β或HuIFN-α1-8經(jīng)in/or途徑治療小鼠延長了感染致死量EMCV(300LD50)的小鼠的平均存活時(shí)間。在所有的6次實(shí)驗(yàn)中(表1和表2)，Hu IFN-α/β1-8與Mu IFN-α/β同樣有效。
在本研究所進(jìn)行的9次實(shí)驗(yàn)中有6次表明經(jīng)in/or途徑給藥的IFN后導(dǎo)致有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的延長平均存活時(shí)間。此外，在所有實(shí)驗(yàn)中，總趨勢是有效的。
在本研究所進(jìn)行的8次經(jīng)ip途徑給藥的實(shí)驗(yàn)中有7次表明經(jīng)ip途徑給藥(每次注射200μl)導(dǎo)致平均存活時(shí)間顯著增加(表1和表2)。
直接比較表1和表2中經(jīng)ip和in/or給藥的數(shù)據(jù)可以看出，ip途徑似乎更有效(7/16例)，或者沒有顯著差異(9/16例)。
我們的初步數(shù)據(jù)意味著與每天一次IFN給藥(表1和表2)相比，經(jīng)任何一種途徑每天兩次IFN給藥似乎在預(yù)防小鼠感染方面沒有顯著提高的治療效果(表3)。
表1干擾素對(duì)感染ECMV的小鼠存活率的影響
相對(duì)于受EMCV攻擊的第0天，在第-2、-1、0、+1、+2和+3天每天一次的干擾素或賦形劑給藥。
表2結(jié)合IFN-α進(jìn)行的預(yù)防和治療對(duì)注射了375LD50EMCV的Swiss小鼠存活率的影響
相對(duì)于受EMCV攻擊的第0天，在第-2、-1、0、+1和+2天每天兩次干擾素給藥。
表3干擾素劑量對(duì)感染ECMV后存活率的影
相對(duì)于受EMCV攻擊的第0天，在第0、+1、+2、+3和+4天每天兩次干擾素給藥。實(shí)施例2預(yù)防和治療EMCV口服感染的相對(duì)效率在EMCV感染當(dāng)天開始IFN治療并于感染后持續(xù)4天，或在病毒感染前4天開始IFN治療并于感染當(dāng)天停止用藥，用200或2000IU Hu IFN-α1-8經(jīng)ip或in/or途徑治療的小鼠的平均存活時(shí)間相差不大(表3)。
在借助對(duì)數(shù)秩X2檢驗(yàn)(Mantel,1966)時(shí)，我們的結(jié)果表明，經(jīng)口粘膜途徑給藥的低劑量IFN在統(tǒng)計(jì)意義上顯著延長了感染致死量EMCV的小鼠的存活時(shí)間。實(shí)施例3口粘膜給藥的干擾素抗水泡性口炎病毒的效果以10μl體積的100LD50水泡性口炎病毒(VSV)鼻內(nèi)感染來自無特異病原體的繁衍種群的數(shù)組6周令小鼠，每組10只(Tovey等人，Proc Soc Exp Biol Med.,1974,146:406-415)。在感染病毒七小時(shí)后，將留下的小鼠或不作治療，或用給定劑量的鼠干擾素-α/β加在10μl體積的Ferimmune賦形劑中經(jīng)鼻內(nèi)/口途徑治療給小鼠進(jìn)行治療，每天1次，治療4天，或只用10μl賦形劑進(jìn)行治療(對(duì)照組)。
用鼠α/β干擾素治療成年小鼠致使感染致死量VSV的動(dòng)物存活率顯著增加。因此，在所有未經(jīng)治療的或只用賦形劑進(jìn)行治療的(對(duì)照組)感染上病毒的動(dòng)物均于第10天死亡的條件下，有30％經(jīng)10,000IU IFN-α/β治療的動(dòng)物在感染致死量VSV后存活了21天。臨床觀察表明大多數(shù)經(jīng)干擾素治療在第21天活著的動(dòng)物將繼續(xù)活下去。實(shí)施例4口粘膜給藥的干擾素對(duì)細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)式的影響已知IFN-α在蛋白質(zhì)與其細(xì)胞表面受體結(jié)合后誘導(dǎo)許多細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)式。有人認(rèn)為這些蛋白質(zhì)提供有用的IFN作用標(biāo)志。
我們評(píng)價(jià)了通過in/or途徑給藥的IFN對(duì)三種受IFN誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)(即Ⅰ類MHC抗原、LY 6A/E抗原和2’-5’-寡腺苷酸合成酶)表達(dá)式的影響。
在經(jīng)腹腔給藥僅20IU Mu IFN-α就在外圍血液單核細(xì)胞和粒細(xì)胞上顯著增加H-2-Kd抗原表達(dá)式的條件下，經(jīng)in/or途徑用高達(dá)20,000IU的Mu IFN-α治療DBA/2小鼠(H-2Kd)并不顯著地增加外圍血液淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞或粒細(xì)胞上的H-2-Kd表達(dá)式。單核細(xì)胞上的表達(dá)式確實(shí)略微受到抑制。
同樣，通過in/or途徑用高達(dá)20.000IU的Mu IFN-α治療小鼠對(duì)Ly6A/E抗原的表達(dá)式?jīng)]有顯著的影響，而該抗原表達(dá)式在經(jīng)胃腸道外途徑用Ⅰ型IFN治療后在各種淋巴樣細(xì)胞的表面上被顯著增強(qiáng)(Damout等人,J.Immunol.,1986,137:201-210)。通過in/or途徑用200或20,000IU的Mu IFN-α或Hu IFN-α1-8獲得相似的結(jié)果。
用少至20IU的Mu IFN-α經(jīng)腹腔注射治療Swiss鼠或DBA/2小鼠導(dǎo)致在外圍血液單核細(xì)胞和脾細(xì)胞兩種細(xì)胞中2′-5′-寡腺苷酸合成酶的活性顯著增加。相反，在同一實(shí)驗(yàn)中通過in/or途徑用高達(dá)20,000IU的Mu IFN-d進(jìn)行治療的小鼠沒有顯著地增加2′-5′-寡腺苷酸合成酶活性的表達(dá)式。另外，在開始IFN治療后長達(dá)10天的時(shí)間里在任何受檢驗(yàn)的時(shí)刻，經(jīng)in/or途徑用200或20,000IU的MuIFN-α或MU IFN-α1-8進(jìn)行的治療對(duì)2′-5′-寡腺苷酸合成酶的活性都沒有顯著影響。實(shí)施例5口粘膜給藥后干擾素的生物利用率為了檢驗(yàn)IFN的生物利用率和藥物動(dòng)力學(xué)，用125I標(biāo)出最高比放射性的單次高劑量的重組IFN-α來治療藥物-血液體積比對(duì)這種研究最有利的小鼠。
將70×106IU Hu IFN-α1-8的純制劑重新溶解在1.4ml的PBS中，并且象Mogensen等人介紹的那樣(Int.T.Cancer,1981,28:575-582)采用Hunter和Greenwood介紹的改良氯胺T法(Nature,1962,194:495-496)進(jìn)行碘處理。
125I標(biāo)記的Hu IFN-α1-8(批號(hào)CGP35269-1)在受VSV攻擊的人體WISH細(xì)胞上檢測時(shí)呈現(xiàn)2×107IU/ml的生物學(xué)活性，而在受VSV攻擊的小鼠L929細(xì)胞上檢測時(shí)呈現(xiàn)1×106IU/ml的生物學(xué)活性。
6至7周令的雌性Swiss鼠用相當(dāng)于1×106鼠IU的2×107IU125I Hu IFN-α1-8(1.0369×107cpm/小鼠)經(jīng)iv、ip注射或經(jīng)in/or途徑治療。在指定的時(shí)間點(diǎn)，每組殺死3只鼠，收集血液并確定體積。分離并收集動(dòng)物的腎、肝、肺、脾和胃/食管，打上印跡，并稱重，精確到±0.1μg。利用γ-計(jì)數(shù)器分別確定每個(gè)樣品的放射性。然后，借助離心(800g×10分鐘，4℃)分離全血，收獲血清，記數(shù)并在-80℃下冷凍。然后，如上所述利用標(biāo)準(zhǔn)的生物檢定法在人體WISH細(xì)胞和小鼠L929細(xì)胞上檢測血清的IFN/含量。然后，借助親和層析法分離存在于血清樣品中的放射性物質(zhì)，并借助SDS-PAGE法進(jìn)行分析。
在每只鼠靜脈注射1.0369×107cpm帶125I標(biāo)記的Hu IFN-α1-8之后5分鐘，在動(dòng)物的外圍血液中檢測到非常高水平的放射性(＞2×106cpm/ml)。在第15分鐘和30分鐘，存在于全血中的放射性逐步降低。腹腔注射1.0369×107cpm的125I HU IFN-α1-8之后5分鐘，在動(dòng)物的外圍血液中檢測到的放射性的水平大約比靜脈注射后檢測到的低20倍。在注射后第15和30分鐘的放射性水平逐步增加。在經(jīng)in/or途徑完成125I IFN-α1-8給藥后第5、10或15分鐘在動(dòng)物血液中檢測到的放射性水平顯著低于在腹腔注射相同劑量帶放射標(biāo)記的IFN之后的給定時(shí)刻經(jīng)定時(shí)間檢測到的放射性水平。就所有三種給藥途徑而言，經(jīng)in/or完成帶125I標(biāo)記的IFN-α1-8給藥后，在血清中檢測到的放射性水平比在全血中檢測到的高。與同樣體積的血清相比，每毫升全血中檢測到的放射性水平較低反映出在去掉全血中細(xì)胞成分之后計(jì)數(shù)的血清實(shí)際體積較大。
如上所述，采用標(biāo)準(zhǔn)生物檢定法檢測來自這項(xiàng)研究中所有小鼠的血清樣品以確定存在帶生物活性的IFN，結(jié)果表明在所有試驗(yàn)的時(shí)間點(diǎn)上，靜脈或腹腔注射125I Mu IFN-α1-8的所有動(dòng)物的血清中都有易于檢測的帶生物活性的IFN。反之，在經(jīng)in/or途徑進(jìn)行IFN給藥后在任何試驗(yàn)的時(shí)間點(diǎn)在所有動(dòng)物的血清中都沒有檢測到帶生物活性的IFN，盡管在這些動(dòng)物的血清中有較高水平的放射性存在。
為了確定在經(jīng)125I Mu IFN-α1-8治療的動(dòng)物血清中檢測到的放射性物質(zhì)是否確實(shí)代表天然IFN，樣品用蛋白質(zhì)A-G瓊脂糖進(jìn)行免疫沉淀，以便將存在于樣品中的免疫球蛋白沉淀出來，用親和純化的多克隆抗干擾素-α的抗體處理后再次進(jìn)行免疫沉淀。然后，對(duì)樣品進(jìn)行上述的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析。
對(duì)靜脈或腹腔注射125I MU IFN-α1-8后血清中放射性物質(zhì)進(jìn)行的SDS-PAGE分析揭示出一條均勻的遷移帶，其中電泳遷移率與未注射125I MU IFN-α1-8的完全一致。估計(jì)該物質(zhì)的表現(xiàn)分子量約為20000道爾頓，它與天然的Hu IFN-α1-8的分子量完全相符。完全相符。反之，來自經(jīng)in/or用125I Mu IFN-α1-8治療的小鼠的血清樣品無一包含任何表觀分子量與天然IFN的分子量相似的物質(zhì)，既使在每個(gè)凝膠上加入完全相同量的放射性物質(zhì)。
帶放射標(biāo)記物質(zhì)的組織分布揭示在靜脈注射125I Mu IFN-α1-8后5分鐘，動(dòng)物的腎臟中有非常高水平的放射性，在肝、肺和脾臟中也有高水平的放射性。隨后發(fā)現(xiàn)存在于這四個(gè)器官中的放射性水平在15和30分鐘逐漸降低。相反，在15和30分鐘時(shí)，胃中的放射性水平逐漸增高，達(dá)到與靜脈注射后30分鐘時(shí)動(dòng)物血清中存在的放射性差不多的水平。
借助腹腔注射完成125I Mu IFN-α1-8給藥導(dǎo)致在15分鐘內(nèi)受檢的所有組織中放射性均達(dá)到峰值水平，接下來在第30分鐘降低。類似地，經(jīng)in/or途徑完成125I Hu IFN-α1-8給藥導(dǎo)致在15分鐘后被研究的所有組織中的放射性均達(dá)到峰值水平，30分鐘時(shí)存在的放射性水平有些下降。經(jīng)in/or途徑完成125I Hu IFN-α1-8給藥后存在于胃/食管中的放射性水平比在任何其他器官中檢測到的水平高一個(gè)數(shù)量級(jí)，而且顯著高于借助靜脈或腹腔途徑完成同樣劑量的帶放射標(biāo)記的Hu IFN-α1-8給藥后存在于這些組織中的放射性水平。實(shí)驗(yàn)例6鼻內(nèi)/口內(nèi)給藥后干擾素的藥物動(dòng)力學(xué)為了準(zhǔn)確地測定Hu IFN-α1-8的藥物動(dòng)力學(xué)，以每只小鼠1.0369×107cpm的劑量用125I HU IFN-α1-8經(jīng)iv、ip或in/or途徑給小鼠治療，并在24小時(shí)期間內(nèi)的一系列時(shí)間點(diǎn)測定在全血和血清中存在的放射性水平。
靜脈注射后存在于小鼠血液中的125I標(biāo)記的Hu IFN-α1-8的藥物動(dòng)力學(xué)曲線十分接近對(duì)數(shù)清除曲線。這個(gè)結(jié)果與以前利用密切相關(guān)的分子(即重組人αA/D(Bgl))進(jìn)行的小鼠研究(Bohoslawed等人；J.IFN Res.,1986,6:207-213)的結(jié)果相符。根據(jù)濃度時(shí)間曲線下的面積計(jì)算出的生物可利用物質(zhì)的量也與人αA/D的那個(gè)量相似。靜脈注射125I HU IFN-α1-8后觀察雙相對(duì)程清除曲線(其為通過腎臟清除的物質(zhì)的特征)，結(jié)果與實(shí)施例6的結(jié)果一致。腹腔注射后，帶125I標(biāo)記的IFN-α1-8的藥物動(dòng)力學(xué)與以前報(bào)導(dǎo)的肌肉注射IFN的結(jié)果十分相似。
在經(jīng)靜脈或腹腔注射帶125I標(biāo)記的IFN-α1-8后，在所有動(dòng)物的血清中都存在易于檢測的帶生物活性的IFN。雖然在帶125I標(biāo)記的IFN-α1-8經(jīng)in/or給藥后在動(dòng)物血清中不能檢測到抗病毒活性，但是在這些動(dòng)物中仍然觀察到有統(tǒng)計(jì)意義的抗致死量EMCV感染的保護(hù)作用(表4)。
表4用125I-IFN-α進(jìn)行單一治療對(duì)注射了EMCV的swiss小鼠存活率的影響
討論我們用明確定義的急性病毒感染的臨床前模型所獲得的結(jié)果提供了明確的證據(jù)支持采用低劑量經(jīng)口粘膜給藥的IFN治療人全身性病毒急性感染的“原理驗(yàn)證”，并且表明在這個(gè)模型中多種IFN-α子型的天然混合物和單一重組的IFN-α異型(如Mu IFN-α)兩者都發(fā)揮有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的抗病毒活性。天然的Mu IFN-α/β和HuIFN-α1-8經(jīng)口粘膜給藥時(shí)似乎是同等有效的。重組Mu IFN-β和Mu IFN-γ也顯示有相似的抗病毒活性。
將給定類型和劑量的IFN經(jīng)口粘膜途徑給藥時(shí)所得到保護(hù)程度與全身給藥(腹腔注射)后獲得的結(jié)果相比較，比較結(jié)果表明在某些病例中IFN經(jīng)胃腸道外給藥在某種程度上比經(jīng)口粘膜給藥更有效，而在其他病例中則不然。
生物標(biāo)志試驗(yàn)研究的結(jié)果非常清楚地表明三種受試的生物標(biāo)志(Ⅰ類MHC抗原、Ly6A/E抗原、和2′-5′-寡腺苷酸合成酶活性)都沒有充分地反映出經(jīng)口粘膜途徑給藥的IFN-α所呈現(xiàn)的非常顯著的抗病毒活性。
繼腹腔內(nèi)(ip)注射少至僅20IU的IFN-α之后開始的所有試驗(yàn)中觀察到三種IFN誘導(dǎo)的全部蛋白質(zhì)的表達(dá)式中都有非常顯著的增加，而多達(dá)20,000IU的IFN-α經(jīng)口粘膜途徑給藥后卻沒有任何可測量的效果，兩者之間的反差是顯著的。
雖然我們不能排除在較早的或中間的時(shí)間點(diǎn)上有可能觀察到對(duì)一種或另一種生物標(biāo)志的影響，但是，這種情況似乎是不可能的，因?yàn)镮FN影響這些蛋白質(zhì)的基因代碼的轉(zhuǎn)錄，因此人們在IFN治療后只有經(jīng)過很長的時(shí)間才可能看到對(duì)這些生物標(biāo)志的影響。
另外，雖然我們不能排除在用IFN-α經(jīng)in/or途徑治療后觀察到對(duì)許多其他受IFN誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)之一的系統(tǒng)影響的可能性，但這似乎不可能，因?yàn)檫@將意味著差動(dòng)調(diào)節(jié)某些IFN誘導(dǎo)的基因的表達(dá)式。然而，完全有可能在IFN-α經(jīng)in/or途徑給藥后在局部(例如在鼻淋巴細(xì)胞中)觀察到對(duì)IFN生物標(biāo)志的影響。
與對(duì)所研究的生物標(biāo)志沒有可檢測的影響相符，即使在用高達(dá)20,000IU的IFN-α治療的動(dòng)物中也沒有觀察到對(duì)任何在IFN經(jīng)口粘膜給藥治療期間所監(jiān)測的血液學(xué)或血液化學(xué)參數(shù)的一致影響。
藥物動(dòng)力學(xué)-生物活性研究的結(jié)果很清楚地表明采用比以前所用方法敏感一個(gè)數(shù)量級(jí)的檢測方法，在外圍血液中沒有可檢出的IFN循環(huán)的條件下，單次量的帶放射性標(biāo)記的Hu IFN-α1-8經(jīng)口粘膜給藥后可獲得統(tǒng)計(jì)學(xué)上有意義的抗病毒效果。與這些結(jié)果相一致，經(jīng)口粘膜給藥的IFN發(fā)揮抗病毒活性的程度似乎遵循經(jīng)典的劑量-反應(yīng)關(guān)系。
在帶125I標(biāo)記的IFN-α1-8經(jīng)in/or給藥之后在動(dòng)物的全血和血清中都發(fā)現(xiàn)容易檢測到的帶放射性標(biāo)記的物質(zhì)。這些結(jié)果與以前研究的結(jié)果(即在口服大量的未帶標(biāo)記的IFN后在動(dòng)物的血清中仍未檢測出IFN)恰好相反。但是，經(jīng)in/or給藥后在全血和血清中檢測出的放射性物質(zhì)是無生物活性的。此外，SDS-PAGE分析的結(jié)果表明這種物質(zhì)是低分子量的，并且很可能反映繼IFN在胃和小腸中消化之后對(duì)降解產(chǎn)物的吸收作用。在in/or給藥后帶放射性標(biāo)記的物質(zhì)的組織分布的分析結(jié)果表明胃中的放射性水平明顯地高于受檢驗(yàn)的任何其他器官。我們的結(jié)果十分清楚地表明即使繼in/or給藥后帶生物活性的IFN不被吸收，這種療法仍能在體內(nèi)發(fā)揮有統(tǒng)計(jì)意義的抗病毒活性。
雖然不希望使觀察到的有益作用受任何現(xiàn)有的機(jī)理的束縛，但我們的結(jié)果意味著經(jīng)口粘膜給藥的IFN借助目前尚不明確的新機(jī)制發(fā)揮其抗病毒作用，這種機(jī)制不包括外源給藥的IFN的直接作用，或內(nèi)源性IFN的誘導(dǎo)作用。缺乏可檢水平的循環(huán)IFN或缺乏可檢水平的三種受檢生物標(biāo)志都支持這一觀點(diǎn)。似乎這種機(jī)制至少可以部分地借助刺激鼻咽腔和口腔周圍豐富的淋巴樣組織發(fā)揮作用。因?yàn)槲覀円炎C明經(jīng)口粘膜給藥的IFN在效力上至少與全身給藥的IFN相差無幾，所以我們的試驗(yàn)結(jié)果強(qiáng)有力的支持在治療病毒急性感染時(shí)經(jīng)口粘膜途徑實(shí)施IFN給藥。這對(duì)于IFN的臨床應(yīng)用可能有重要意義。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以明確看出，雖然為了清晰和便于理解已對(duì)本發(fā)明作了相當(dāng)詳盡的描述，但是不脫離說明書中公開的本發(fā)明的精神和范圍可以對(duì)本文描述的實(shí)施方案和方法作出各種修飾和改動(dòng)。
權(quán)利要求
1．一種刺激哺乳動(dòng)物體內(nèi)宿主防御機(jī)制的方法，該方法包括經(jīng)口粘膜接觸將有效量的干擾素提供給哺乳動(dòng)物，所述量從大約5000IU至大約20×106IU，條件是所述量當(dāng)經(jīng)胃腸道外投用時(shí)在哺乳動(dòng)物體不誘發(fā)病理學(xué)反應(yīng)。
2．一種治療哺乳動(dòng)物體內(nèi)自身免疫、分支桿菌、神經(jīng)退化、寄生蟲或病毒感染等病癥的方法，該方法包括將治療有效量的干擾素經(jīng)口粘膜接觸提供給哺乳動(dòng)物，其中所述量是從大約1500IU到大約20×106IU，條件是所述量經(jīng)胃腸道外給藥時(shí)不在哺乳動(dòng)物體內(nèi)誘發(fā)病理學(xué)反應(yīng)。
3．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中干擾素的有效劑量是以單次量給藥的。
4．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中干擾素的有效劑量是在足以誘發(fā)相當(dāng)于單次量的病理學(xué)反應(yīng)的時(shí)間里以多次較小劑量給藥的。
5．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中干擾素的有效劑量是在不誘發(fā)病理學(xué)反應(yīng)的條件下在足以引起相當(dāng)于單次量的反應(yīng)的時(shí)間里連續(xù)給藥的。
6．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中干擾素的總劑量是從大約5000IU至大約20×106IU的干擾素。
7．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中干擾素的劑量是從大約1×104IU到大約20×106IU干擾素。
8．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中干擾素的劑量是從大約1×104IU到大約1×106IU干擾素。
9．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其進(jìn)一步包括其他細(xì)胞因子或干擾素誘導(dǎo)劑的給藥。
10．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中干擾素包括Ⅰ型干擾素。
11．根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中干擾素選自IFN-α、IFN-β、IFN-ω、共有IFN、以及它們的混合物。
12．根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中IFN-α包括重組IFN-α。
13．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中干擾素包括Ⅱ型干擾素。
14．根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中Ⅱ型干擾素包括γ-IFN。
15．一種治療哺乳動(dòng)物的關(guān)節(jié)炎、糖尿病、狼瘡、多發(fā)性硬化、麻風(fēng)、結(jié)核、腦炎、Creutzfeldt-Jakob綜合癥、瘧疾、宮頸癌、生殖器皰疹、乙型和丙型肝炎、HIV、HPV、HSV-1及HSV-2感染的方法，該方法包括通過口腔口粘膜接觸將治療有效量的干擾素提供給哺乳動(dòng)物，其中所述量是大約1500IU到大約20×106IU，條件是所述量在經(jīng)胃腸道外給藥時(shí)不在哺乳動(dòng)物體內(nèi)誘發(fā)病理學(xué)反應(yīng)。
16．根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中干擾素的有效劑量是以單次量給藥的。
17．根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中干擾素的有效劑量是在不誘發(fā)病理反應(yīng)的條件下在足以引起相當(dāng)于單次量的治療反應(yīng)的時(shí)間里以多次較小劑量給藥的。
18．根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中干擾素的劑量是在不誘發(fā)病理反應(yīng)的條件下在足以引起相當(dāng)于單次量的治療反應(yīng)的時(shí)間里連續(xù)給藥的。
19．根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中干擾素的總劑量是從大約500IU至大約20×106IU的干擾素。
20．根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中干擾素的劑量是從大約1×104IU到大約20×106IU的干擾素。
21．根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中干擾素的劑量是從大約1×104IU到大約1×106IU的干擾素。
22．根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，該方法進(jìn)一步包括聯(lián)合治療。
23．根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，該方法進(jìn)一步包括其他細(xì)胞因子或干擾素誘導(dǎo)劑的給藥。
24．根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中干擾素包括Ⅰ型干擾素。
25．根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中干擾素選自IFN-α、IFN-β、IFN-ω、共有IFN，和它們的混合物。
26．根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中IFN-α包括重組IFN-α。
27．根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中干擾素包括Ⅱ型擾素。
28．根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中干擾素包括γ干擾素。
29．干擾素在制備經(jīng)口腔粘膜接觸刺激哺乳動(dòng)物的宿主防御機(jī)制的藥物中的應(yīng)用，該藥物包含治療有效量的干擾素，其中所述量從大約1500IU到大約20×106IU，條件是所述量經(jīng)胃腸道外給藥時(shí)不在哺乳動(dòng)物體內(nèi)誘發(fā)病理學(xué)反應(yīng)。
30．根據(jù)權(quán)利要求29所述的應(yīng)用，其中宿主防御機(jī)制抵御病毒、自身免疫、分支桿菌、神經(jīng)退化或寄生蟲引起的條件反射。
31．根據(jù)權(quán)利要求29或30所述的應(yīng)用，其中藥物包含單次量的干擾素。
32．根據(jù)權(quán)利要求29或30所述的應(yīng)用，其中藥物包含足以引起相當(dāng)于單次量的刺激作用的多份較小劑量的干擾素。
33．根據(jù)權(quán)利要求29至32中任何一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中藥物在足以引發(fā)相當(dāng)于使用單一劑的刺激作用的時(shí)間里提供無毒劑量的連續(xù)給藥。
34．根據(jù)權(quán)利要求29至33中任何一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中藥物包含另一種細(xì)胞因子或干擾素誘導(dǎo)劑。
35．根據(jù)權(quán)利要求29至34中任何一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中藥物適合大約5000IU到大約20×106IU的干擾素的給藥。
36．根據(jù)利用要求35所述的應(yīng)用，其中藥物適合大約1×104IU到20×106IU的干擾素的給藥。
37．根據(jù)利用要求36所述的應(yīng)用，其中藥物適合1×104IU到1×106IU的干擾素的給藥。
38．根據(jù)權(quán)利要求29至37中任何一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中藥物包括另一種適于同時(shí)、分別或后續(xù)治療的治療劑。
39．根據(jù)權(quán)利要求38所述的應(yīng)用，其中治療劑是另一種抗病毒制劑。
40．根據(jù)權(quán)利要求29至39中任何一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中干擾素是Ⅰ型干擾素。
41．根據(jù)權(quán)利要求40所述的應(yīng)用，其中干擾素選自IFN-α、IFN-β、IFN-ω、共有IFN，以及它們的混合物。
42．根據(jù)權(quán)利要求41所述的應(yīng)用，其中干擾素是IFN-α。
43．根據(jù)權(quán)利要求29至39中任何一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中干擾素是Ⅱ型干擾素。
44．根據(jù)權(quán)利要求43所述的應(yīng)用，其中Ⅱ型干擾素是IFN-γ。
45．根據(jù)權(quán)利要求40或43所述的應(yīng)用，其中干擾素是重組物質(zhì)。
46．根據(jù)權(quán)利要求29至45中任何一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中宿主防御機(jī)制抵御關(guān)節(jié)炎、糖尿病、狼瘡、多發(fā)性硬化、麻風(fēng)、結(jié)核、腦炎、Creutzfeldt-Jakob綜合癥、瘧疾、宮頸癌、生殖器皰疹、乙型和丙型肝炎、HIV、HPV、HSV-1及HSV-2。
47．刺激哺乳動(dòng)物體內(nèi)宿主防御機(jī)制的干擾素組合物，該組合物包括適合口腔粘膜接觸的治療有效量的干擾素，所述量是從大約1500IU到大約20×106IU，條件是所述量經(jīng)胃腸道外給藥時(shí)不在哺乳動(dòng)物體內(nèi)引發(fā)病理學(xué)反應(yīng)。
48．根據(jù)權(quán)利要求47所述的組合物，該組合物以單位劑量形式包含5000IU到大約20×106IU的干擾素和醫(yī)藥上可接受的載體。
49．根據(jù)權(quán)利要求48所述的組合物，該組合物包含大約1×104IU到大約20×106IU的干擾素。
50．根據(jù)權(quán)利要求49所述的組合物，該組合物包含大約1×104IU到大約1×106IU的干擾素。
51．根據(jù)權(quán)利要求47所述的組合物，其中宿主防御機(jī)制抵御病毒、自身免疫、分支桿菌、神經(jīng)退化或寄生蟲引起的條件反射。
52．根據(jù)權(quán)利要求51所述的組合物，該組合物包含單次量的干擾素。
53．根據(jù)權(quán)利要求51所述的組合物，該組合物包含足以引發(fā)相當(dāng)于單次量的刺激作用的多份較小劑量的干擾素。
54．根據(jù)權(quán)利要求47至53中任何一項(xiàng)所述的組合物，該組合物在足以引發(fā)相當(dāng)于單次量的抗病毒反應(yīng)的時(shí)間里提供無毒劑量的連續(xù)給藥。
55．根據(jù)權(quán)利要求47至54中任何一項(xiàng)所述的組合物，該組合物包括另一種細(xì)胞因子或干擾素誘導(dǎo)劑。
56．根據(jù)權(quán)利要求47至55中任何一項(xiàng)所述的組合物，該組合物包括另一種適于同時(shí)、分別或后續(xù)治療的治療劑。
57．根據(jù)權(quán)利要求56所述的組合物，其中治療劑是另一種抗病毒制劑。
58．根據(jù)權(quán)利要求47至57中任何一項(xiàng)所述的組合物，其中干擾素是Ⅰ型干擾素。
59．根據(jù)權(quán)利要求58所述的組合物，其中干擾素選自IFN-α、IFN-β、IFN-ω、共有IFN，以及它們的混合物。
60．根據(jù)權(quán)利要求59所述的組合物，其中干擾素是IFN-α。
61．根據(jù)權(quán)利要求47至57中任何一項(xiàng)所述的組合物，其中干擾素是Ⅱ型干擾素。
62．根據(jù)權(quán)利要求61所述的組合物，其中Ⅱ型干擾素是IFN-γ。
63．根據(jù)權(quán)利要求58或61所述的組合物，其中干擾素是重組物質(zhì)。
64．根據(jù)權(quán)利要求47至63中任何一項(xiàng)所述的組合物，其中宿主防御機(jī)制抵御關(guān)節(jié)炎、糖尿病、狼瘡、多發(fā)性硬化、麻風(fēng)、結(jié)核、腦炎、Creutzfeldt-Jakob綜合癥、瘧疾、宮頸癌、生殖器皰疹、乙型和丙型肝炎、HIV、HPV、HSV-1及HSV-2。
全文摘要
一種刺激哺乳動(dòng)物體內(nèi)宿主防御機(jī)制的方法,該方法經(jīng)口腔粘膜接觸將有效量的干擾素提供給哺乳動(dòng)物。干擾素的給藥量小于經(jīng)胃腸道外給藥時(shí)誘發(fā)病理學(xué)反應(yīng)的量。
文檔編號(hào)A61K31/00GK1218409SQ97194504
公開日1999年6月2日 申請(qǐng)日期1997年5月5日 優(yōu)先權(quán)日1996年5月9日
發(fā)明者邁克爾·格拉德·托文 申請(qǐng)人:太平洋制藥控股公司