專利名稱：bFGF在制備治療人類缺血性腦中風(fēng)藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)在制備治療缺血性腦中風(fēng)藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腦中風(fēng)又稱腦卒中或腦血管意外，是一組以腦部缺血或出血性損傷癥狀為主要臨床表現(xiàn)的疾病，主要分為出血性腦中風(fēng)(腦缺血及蛛網(wǎng)膜下腔出血)和缺血性腦中風(fēng)(腦梗塞及腦血栓形成)兩大類，其中以腦缺血性腦中風(fēng)最為常見。該疾病發(fā)病急，病死率高，是世界上最為主要的致死性疾病之一。據(jù)統(tǒng)計，我國每年新發(fā)完全性腦中風(fēng)120 150萬人，死亡80 100萬人，存活者中約75%致殘，5年復(fù)發(fā)率高達41 % ;而美國每年亦有50萬人發(fā)病，其中15萬人死亡。腦中風(fēng)的死亡率和年齡呈正相關(guān)，目前我國已進入老年化社會， 其發(fā)病率及對國人的影響將有進一步增加的趨勢，因此研究與開發(fā)治療腦中風(fēng)尤其是缺血性腦中風(fēng)的有效藥物是醫(yī)藥界的一個重要課題。目前對缺血性腦中風(fēng)尚缺乏有效治療措施，臨床上常見的治療方法有藥物治療、導(dǎo)管擦入、頸動脈內(nèi)膜切除等，其中藥物治療是最常見的治療方法，作用方式包括溶栓、擴血管或抗血小板聚集等。上述治療藥物的共同特點是針對性強、作用環(huán)節(jié)明確、但療效單一，難以克服缺血性腦中風(fēng)引起神經(jīng)細胞損傷的多種病理學(xué)效應(yīng)，且有不同程度的毒副作用。如溶栓藥物很難通過血腦屏障進入受損腦組織發(fā)揮作用，因而療效不肯定，且有引起再灌注損傷及出血的副作用；擴血管藥物可使正常鬧部位血管擴張，造成病變區(qū)血液流向正常腦組織，產(chǎn)生所謂“竊血”現(xiàn)象。因此尋找具有新的作用機理，且療效明確、毒副作用小的有效藥物是一項亟待探索的工作。喊性成纖維細胞生長因子(Basicfibroblast growth factor, bFGF)是由 155個氨基酸組成的18kD多肽，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖I所示，主要分布于垂體、腦和神經(jīng)組織及視網(wǎng)膜、腎上腺、胎盤等組織，可促進來源于中胚層和神經(jīng)外胚層的多種類型細胞增殖、分化，具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。它的主要生物學(xué)作用是促進細胞生長、增殖和分化。小分子量的bFGF定位于細胞質(zhì),大分子量的bFGF定位于細胞核和核糖體,并通過自分泌或旁分泌的方式運輸?shù)阶饔貌课话l(fā)揮生理作用。bFGF是重要的肽類神經(jīng)營養(yǎng)因子，對中樞神經(jīng)組織和周圍神經(jīng)神經(jīng)組織具有修復(fù)和保護作用。25mg/ml的bFGF可刺激有髓神經(jīng)纖維的生長而促進大鼠面神經(jīng)的生長。氧化應(yīng)激與中樞神經(jīng)疾病病理生理過程聯(lián)系密切，許多中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病如缺血再灌注損傷、帕金森病和衰老等都涉及到氧化損傷，病灶周圍都產(chǎn)生大量的活性氧自由基。H2O2是一種活性氧成分，它參與了許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機制，常用作神經(jīng)細胞氧化損傷的誘導(dǎo)劑。PC12細胞從可移植的大鼠嗜鉻細胞瘤克隆而來，具有交感神經(jīng)元的生理、生化特征。該細胞株具有相當(dāng)高的穩(wěn)定性和同質(zhì)性，分化程度高，被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)元相關(guān)的研究。FGF-2是一種很強的絲裂原，具有促進各種軟組織損傷修復(fù)的作用，能動促進組織損傷的修復(fù)。FGF-2保護神經(jīng)的作用是多方面的(I)保護神經(jīng)元；(2)促進軸突再生；⑶促進SC增殖；⑷促進血管發(fā)生，改善血供微環(huán)等。研究表明，中樞神經(jīng)受傷后，和周圍神經(jīng)一樣可以再生，但再生能比周圍神經(jīng)差，導(dǎo)致這種差異的原因不在于神經(jīng)元本身的差異，主要和合適的組織環(huán)境即神經(jīng)再生的微環(huán)境有關(guān)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供bFGF的新用途，即在制藥中得新用途。為達到上述目的，本發(fā)明涉及bFGF在制備治療人類缺血性腦中風(fēng)藥物中得應(yīng)用。腦缺血與神經(jīng)細胞凋亡有關(guān)，細胞凋亡又稱細胞程序性死亡，是指細胞在一定的生理或病理條件下，遵循自身的程序，自己結(jié)束其生命的過程。其受控于一系列基因順序表達而發(fā)現(xiàn)的主動的耗能的自殺性死亡，是維持機體細胞種類和數(shù)量動態(tài)平衡的重要機制，與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。目前已知的三條主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來控制細胞凋亡1、線粒體通路；2、死亡受體通路；3、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路機制是近年來發(fā)現(xiàn)的一條新的凋亡途徑，且很多動物實驗已被初步證明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路參與了脊髓損傷的繼發(fā)性病理機制。 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細胞中重要的細胞器，參與蛋白質(zhì)合成、折疊和寡聚化，還參與脂類代謝、類固醇代謝的合成以及Ca2+調(diào)節(jié)等。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)非常敏感，葡萄糖/營養(yǎng)素的缺乏、蛋白質(zhì)糖基化的抑制、二硫鍵形成的障礙、蛋白質(zhì)運轉(zhuǎn)異常、Ca2+耗竭等刺激均可導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能失調(diào)，即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)蛋白質(zhì)不能正確折疊而被大量滯留，導(dǎo)致未折疊蛋白反應(yīng),激發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體、細胞核之間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo),抑制蛋白質(zhì)合成并啟動內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，一定程度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可增強內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激能力，促進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能恢復(fù)。但是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激持續(xù)存在或過強時將誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性蛋白細胞凋亡，造成組織損傷。脊髓損傷時，發(fā)生的缺血缺氧、酸中毒、ATP耗竭、鈣超載以及大量自由基生成等均可誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而使其在腦缺血發(fā)生發(fā)展中具有重要意義。我們利用過氧化氫和腦缺血/再灌注模型鼠，分別在體外和體內(nèi)水平上復(fù)制的氧化應(yīng)激誘導(dǎo)神經(jīng)細胞損傷中，能夠檢測到持續(xù)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激變化及相關(guān)的細胞凋亡過程，而bFGF給藥則能夠在一定程度上抑制這一過程，這也是首次證實了 bFGF的神經(jīng)保護作用并不是僅僅局限于神經(jīng)營養(yǎng)和神經(jīng)再生功能之中，也與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有著密切的聯(lián)系。對于治療人類缺血性腦中風(fēng)來說，bFGF的給藥方式可以是肌肉注射給藥，劑量為4000U/d, IOd為一療程，連用20d。按照腦卒中病人臨床神經(jīng)功能缺損評分標(biāo)準(zhǔn)，bFGF治療組為11. 1±6. 02，對照組為14. 4±8. 61，bFGF組明顯優(yōu)于對照組，總有效率達到92%，在臨床上表現(xiàn)為神經(jīng)系統(tǒng)癥狀逐漸消失，感覺和運動功能逐漸恢復(fù)。總之，bFGF能顯著的減少腦缺血缺氧造成的神經(jīng)元損傷，其機制可能與減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的腦神經(jīng)元凋亡有關(guān)，bFGF是一種對于人體相對安全的蛋白生物藥，未發(fā)現(xiàn)藥物不良反應(yīng)。因此，本研究結(jié)果可望在將來為臨床治療缺血性腦中風(fēng)提供一種新的藥物。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明作進一步描述bFGF在制備治療人類缺血性腦中風(fēng)藥物中的應(yīng)用，藥物的形式可以是粉針劑、水齊U、脂質(zhì)體等。bFGF對缺血性腦中風(fēng)有治療作用，小劑量的bFGF可以抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)引起的神經(jīng)元凋亡，從而對缺血性腦中風(fēng)產(chǎn)生治療作用。實施例一
I、動物實驗取健康雄性B6小鼠，體重22_25g，SPF級。該小鼠由溫州醫(yī)學(xué)院實驗中心提供，將小鼠隨即分成三組，分別為正常對照組、模型組、bFGF治療組。治療組小鼠按bFGF 20 u g/只劑量鼻腔給藥Ih后進行雙側(cè)頸動脈結(jié)扎性腦缺血模型(BCCA)，缺血24h和72h后分別進行自發(fā)性行為學(xué)分析，染色，免疫組化及Western blot分析。并且與模型組進行對比，從而得到結(jié)果。2.小鼠鼻腔注射給藥將三組小鼠分別用4%濃度的水合氯醛，以0.01ml/g劑量腹腔麻醉，然后將其背部朝下固定在木板上，將細導(dǎo)管由小鼠嘴部插入到氣管，然后將通過計算將20 yg/只的bFGF分別分次用微型注射器加到小鼠鼻孔中。而氣管導(dǎo)管能起到防止藥物直接進入肺部的作用。對照組按照同樣的方法給予相同量的PBS。3.雙側(cè)頸動脈結(jié)扎全腦缺血模型(BCCA)的建立將小鼠背部固定，頸正中切口，分離兩側(cè)頸總動脈,用動脈夾同時結(jié)扎兩側(cè)頸總動脈持續(xù)20min，去動脈夾，縫合皮膚。手術(shù)過程中保持小鼠體溫37°C，直到小鼠從麻醉中蘇醒。4.自發(fā)行為學(xué)分析將各組小鼠分別在腦缺血模型后I天和3天進行自發(fā)行為學(xué)分析，將小鼠放入一個(40X40X40cm)的箱子中，攝像機自動記錄小鼠在一個小時內(nèi)的運動軌跡,行為。并自動計算出其在一個小時內(nèi)的運動總路程，平均速度等指標(biāo)。通過比較給藥組和無給藥組總路程的變化，來闡明bFGF對小鼠行為能力的改善情況。 5. HE及免疫組化分析6. Western blot分析海馬組織相應(yīng)蛋白變化7.數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)均以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差(Mean土SD)表示，統(tǒng)計分析采用單因素方差分析，P < 0. 05為統(tǒng)計學(xué)差異有顯著性。8.結(jié)論圖I為雙側(cè)頸動脈結(jié)扎性腦缺血小鼠注射bFGF后自發(fā)性行為的比較圖。圖中BCCA模型后小鼠行為能力顯著性下降，而給予bFGF后能顯著改善小鼠行為能力。圖2為bFGF給藥后腦切片海馬區(qū)域HE和CHOP，caspase-1免疫組化的比較，HE染色顯示bFGF能改善腦缺血造成的神經(jīng)細胞的凋亡，而免疫組化顯示，bFGF能顯著抑制腦缺血引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，降低CHOP, caspase-12的表達，增加p-AKT,p_ERK的表達。圖3通過Western blot進一步驗證bFGF能顯著抑制腦缺血引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，降低CHOP, caspase-12的表達并增加p-AKT，p-ERK的表達。使用bFGF的腦缺血小鼠和未使用bFGF的腦缺血小鼠比較，bFGF能顯著改善小鼠的行為能力，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，減少腦缺血帶來的不良影響。9.結(jié)論bFGF可顯著改善小鼠的行為能力，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，對缺血性腦中風(fēng)具有一定的防治作用。實施例二 I. PCl2細胞H202氧化損傷實驗PC12細胞(大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜珞細胞瘤神經(jīng)細胞株)用含10%小牛血清的DMEM液培養(yǎng)，接種于96孔板中，在37°C、95% O2和5% CO2條件下培養(yǎng)至細胞鋪滿單層。實驗一、分為5組，分別為正常組，H2O2濃度40、80、120、160 ii M作用12h。另設(shè)實驗二分為5組，在120 u M H2O2 條件下依次加入 0、20、40、80、160ng/ml bFGF 作用 12h。2. MTT法測定活細胞數(shù)MTT全稱為3-(4，5_二甲基噻唑-2)-2，5-二甲苯四氮唑溴鹽，商品名噻唑藍。將上述各組細胞分別加入總濃度為0. 5mg/ml的MTT反應(yīng)4h，吸去上清液(注意避免吸走甲瓚結(jié)晶)，每孔加入150M DMS0，待孔內(nèi)顆粒完全溶解后，用酶標(biāo)儀測定570nm處的光密度。3.流式細胞儀檢測細胞凋亡率PC12細胞消化后，以2X105Cells/ml，3ml/孔接種與6孔板，細胞貼壁后分為5組a組為陰性對照組，不做任何處理山組120 ii M H202作用細胞12h ;(組40ng/ml bFGF作用細胞24h，d組40ng/ml bFGF 2h后再加入120 u MH202作用細胞12h，按照AnnexinV-FITC凋亡檢測試劑盒說明書處理細胞，流式細胞儀測定細胞凋亡率。 4ffestern blot 檢測蛋白表達取對數(shù)生長期的PC12細胞，饑餓同步化24h。細胞分為空白對照組、bFGF組、H202組、bFGF+H202組，處理濃度、時間和順序分別為40ng/mL bFGF作用2h，120 u MH202處理12h。收集細胞，按全蛋白提取試劑盒操作步驟提取細胞蛋白并用BCA法測定蛋白濃度。調(diào)整各樣本蛋白濃度一致，進行10% SDS-PAGE凝膠電泳，經(jīng)PVDF膜轉(zhuǎn)移，5%脫脂奶粉封閉后，分別加 CHOP，Caspase-12，p-AKT，AKT，ERKl/2 和 p-ERKl/2 (I 200)多克隆抗體過夜，PBS洗滌，再相對應(yīng)得二抗IgG-HRP (I 2000)結(jié)合，再次洗滌，加化學(xué)熒光試劑，X光曝光，凝膠圖像分析儀進行光密度掃描與分析。5.數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)均以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差(Mean土SD)表示，統(tǒng)計分析采用單因素方差分析，P< 0. 05為統(tǒng)計學(xué)差異有顯著性。6.實驗結(jié)果和結(jié)論附圖4為PC12細胞經(jīng)H2O2處理應(yīng)用bFGF后經(jīng)MTT法及流式測定細胞后的對比圖；從圖中可知bFGF可提高PC12細胞的存活率，對細胞起到抗凋亡作用。圖5為PC12為細胞經(jīng) H2O2 處理應(yīng)用 bFGF 后 CHOP, caspase-12, p-ERK, p-AKT 等 western blot 檢測蛋白的變化，結(jié)果顯示bFGF能顯著抑制腦缺血引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，降低CHOP，caspase-12的表達，增加P-ERK，p-AKT的表達。而加入p-AKT和p-ERK抑制劑以后，bFGF的抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激作用減低，說明bFGF抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激要通過AKT和ERK介導(dǎo)的信號通路。數(shù)據(jù)均以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差表示，統(tǒng)計分析采用單因素方差分析，P < 0. 05為統(tǒng)計學(xué)差異有顯著性。在PC12細胞H2O2氧化損傷模型中，bFGF能夠增加PC12細胞的存活率并抑制PC12細胞的凋亡，并且抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。上述實施例只為說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思特點，其目的在于讓熟悉此領(lǐng)域的人士能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)此實施,并不能以此限制本發(fā)明的保護范圍。凡根據(jù)本發(fā)明精神實質(zhì)所做的等效變化或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。


圖I為雙側(cè)頸動脈結(jié)扎性腦缺血(BCCA)小鼠注射bFGF后自發(fā)性行為變化；圖2為bFGF給藥后腦切片海馬區(qū)域HE和CHOP，caspase-1免疫組化的比較；
圖3為bFGF給藥后動物CHOP，Caspase-12, P-Erk, P-Akt等蛋白表達；
圖4為bFGF處理的H2O2損傷的PC12細胞增殖率及凋亡率；
圖5為bFGF處理的H202損傷的PC12細胞caspase-12，p-ERK, p-AKT蛋白表達。
權(quán)利要求
1.本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)在制備治療人類腦中風(fēng)藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)在制備治療人類腦中風(fēng)藥物中的應(yīng)用。bFGF在制備治療人類缺血性腦中風(fēng)藥物中的應(yīng)用，藥物的形式可以是粉針劑、水劑、脂質(zhì)體等。bFGF對缺血性腦中風(fēng)有治療作用，小劑量的bFGF可以抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)引起的神經(jīng)元凋亡，從而對缺血性腦中風(fēng)產(chǎn)生治療作用。
文檔編號A61P25/00GK102755636SQ201110372049
公開日2012年10月31日 申請日期2011年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月18日
發(fā)明者張宏宇, 李校堃, 王周光, 王曉杰, 肖健, 虞希沖 申請人:溫州醫(yī)學(xué)院