專利名稱：制備鯊烯的改良方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明處于制造具有適于藥學(xué)應(yīng)用純度的鯊烯的領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
鯊魚(yú)肝油含有稱為鯊烯的支鏈不飽和萜類化合物(C3ciHki ; [ (CH3)2C[=CHCH2CH2C(CH3) ]2=CHCH2-]2 ；2, 6, 10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四碳己烯；CAS RN 7683-64-9)。已知鯊烯用于人類疫苗中的水包油乳液，例如用于佐劑化流感病毒疫苗的MF59乳液。鯊烯還用于其他藥物制品(如油膏、栓劑)和化妝品。目前鯊烯的來(lái)源主要是魚(yú)油，尤其是鯊魚(yú)肝油。使用提取自鯊魚(yú)肝油的鯊烯可產(chǎn) 生相關(guān)問(wèn)題，尤其是不能維持嚴(yán)格的制造標(biāo)準(zhǔn)時(shí)(如諾華公司(Novartis)生產(chǎn)MF59期間所用的那些)。例如，鯊魚(yú)可被對(duì)人也有感染性的病原體感染，或產(chǎn)生對(duì)人有害的物質(zhì)，且可能存在TSE或TSE樣鯊魚(yú)制劑[如參考文獻(xiàn)1-3]。此外，鯊魚(yú)可含有人類毒素如真鯊毒素(carchatoxin)。另外，S魚(yú)可含有人類對(duì)之過(guò)敏的蛋白。人類過(guò)敏的常見(jiàn)魚(yú)蛋白是在S魚(yú)中發(fā)現(xiàn)的小清蛋白。因此鯊烯的廉價(jià)低級(jí)別來(lái)源不適于人類藥學(xué)應(yīng)用。在鯊烯是部分免疫佐劑的情況中，其對(duì)人受體傷害的風(fēng)險(xiǎn)增加，這是由于根據(jù)定義，所述佐劑可誘導(dǎo)針對(duì)雜質(zhì)的強(qiáng)烈不利免疫應(yīng)答。找到制備適于藥學(xué)應(yīng)用的鯊烯的其他和改良過(guò)程是有用的，即所述鯊烯是滿足調(diào)節(jié)標(biāo)準(zhǔn)且不含可傷害人類的污染物、病原體、病毒、人毒素或蛋白的產(chǎn)品。本發(fā)明過(guò)程特定用于純化源自鯊魚(yú)肝油的鯊烯。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供從動(dòng)物源含鯊烯組合物中制備鯊烯的方法，所述方法包括步驟(a)在溫度T1進(jìn)行純化蒸餾；(b)在溫度T2進(jìn)行變性蒸餾；其中步驟(a)和(b)可以任一順序進(jìn)行；T1和T2足以使鯊烯沸騰；T2XT1 ;且T2 > 200° C。所述動(dòng)物來(lái)源通常是魚(yú)類來(lái)源，如鯊魚(yú)肝油(或其提取物)，即本發(fā)明提供從鯊魚(yú)肝油或從鯊魚(yú)肝油提取物中制備鯊烯的方法。本發(fā)明還提供從含鯊烯組合物中制備鯊烯的方法，所述方法包括步驟(a)在溫度T1進(jìn)行純化蒸餾；(b)在溫度T2進(jìn)行變性蒸餾；其中步驟(a)和(b)可以任一順序進(jìn)行；!\和丁2足以使鯊烯沸騰；1\〈140° (;且1'2>200° C。有用的所述含鯊烯組合物可為鯊魚(yú)肝油或其提取物。本發(fā)明還提供重蒸餾含至少99%鯊烯的組合物的方法，所述重蒸餾是在T2的溫度下進(jìn)行的變性蒸餾；其中T2 ^ 200。該重蒸餾可將組合物中的含水量降低到如〈O. 01%。本發(fā)明的方法可用于生產(chǎn)適于藥學(xué)應(yīng)用的產(chǎn)品。具體地，本發(fā)明方法可用于生產(chǎn)純化的鯊烯，其不含可傷害人類的污染物、病原體、病毒、人類毒素或蛋白，尤其是蛋白小清蛋白。本發(fā)明還提供制造水包油乳液的方法，包括用上述方法準(zhǔn)備的鯊烯制備乳液。本發(fā)明還提供制備疫苗組合物的方法，包括如上所述制備乳液，并將所述乳液與抗原混合。本發(fā)明還提供制備疫苗藥盒的方法，包括如上所述制備乳液并將乳液與抗原組分一起包裝到藥盒中作為藥盒組分。本發(fā)明還提供根據(jù)本發(fā)明方法制備的鯊烯。本發(fā)明還提供含本發(fā)明所述方法制備的鯊烯的水包油乳液。本發(fā)明還提供含本發(fā)明所述方法制備的鯊烯的疫苗。 本發(fā)明還提供本發(fā)明方法所述制備的鯊烯在疫苗中的應(yīng)用。純化蒸餾含鯊烯組合物可源自任何來(lái)源，如黑液皂化物撇渣；妥爾油皂；粗制妥爾油；妥爾油樹(shù)脂；甘蔗油；油和脂肪的提取、脫膠和精煉的殘余物；脂肪酸和酯類的蒸餾殘余物；植物油的脫臭餾出物；橄欖油；大豆油；米糠油；鯊魚(yú)肝油；牛脂；.咖啡油；魚(yú)油；鱈魚(yú)肝油；麥胚芽油；玉米胚芽油；棕櫚油；酸洛樹(shù)油(andiroba oil);和番爺殘余物的油。具體地，含鯊烯的化合物可源自鯊魚(yú)肝油。所述純化蒸餾從含鯊烯組合物中移除雜質(zhì)，產(chǎn)生純化組合物。含鯊烯組合物通常是液體。純化蒸餾前，含鯊烯組合物可含有雜質(zhì)如角鯊胺、烷基甘油、脂肪酸(如Ω-3-脂肪酸)、維生素A和D、姥鮫烷(pristine)、甘油三酸酯、甘油醚和脂肪醇。所述純化蒸餾在溫度T1進(jìn)行，其中T1足以使鯊烯沸騰，即T1可大于或等于鯊烯的沸點(diǎn)。760mm Hg (即I個(gè)大氣壓)時(shí)鯊烯的沸點(diǎn)為429-430° C。液體的沸點(diǎn)表示該化合物液相的蒸氣壓等于作用于該液體表面上的外部壓力的溫度。因此，鯊烯的沸點(diǎn)，也即T1的下限取決于施加于含鯊烯組合物的表面的外部壓力。該現(xiàn)象為本領(lǐng)域熟知，且技術(shù)人員能計(jì)算所用給定蒸餾壓力下觀察到的鯊烯沸點(diǎn)?；蛘?，技術(shù)人員能基于所需觀察到的鯊烯沸點(diǎn)來(lái)計(jì)算所需的蒸餾壓力。所述計(jì)算可用列線圖進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述純化蒸餾可在至少70° C的溫度進(jìn)行，如至少75° C或至少80° C。在另一實(shí)施方式中，所述純化蒸餾可在低于140° C的溫度進(jìn)行，如低于130° C、低于120° C、低于110° C、低于100° C、低于95° C、低于90° C或低于85° C。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述純化蒸餾可在接近真空下進(jìn)行。具體地，所述純化蒸餾可在至少O. 5 μ m Hg的壓力下進(jìn)行,如至少O. 75 μ m Hg或至少I μ m Hg。所述純化蒸懼可在低于5 μ m Hg的壓力下進(jìn)行，如低于2. 5 μ m Hg或低于2 μ m Hg。本發(fā)明的其他實(shí)施方式包括上述引用的最小和最大溫度以及最小和最大壓力的組合。所述純化蒸餾可產(chǎn)生含至少95%鯊烯的組合物，如至少96%鯊烯、至少97%鯊烯、至少98%鯊烯、至少99%鯊烯、至少99. 5%鯊烯、至少99. 8%鯊烯、至少99. 9%鯊烯或甚至100%鯊烯。本文所引全部百分比是重量百分比且可用氣相色譜(GC)測(cè)量。GC技術(shù)可通過(guò)將溶于己烷的鯊烯樣品注射到配有火焰離子檢測(cè)器(FID)的氣相色譜上來(lái)進(jìn)行。分析可在30m X 0. 32mm x 0. 50mm毛細(xì)管柱上進(jìn)行，維持于200° C持續(xù)2分鐘，然后以每分鐘提高12° C升到310° C，在此維持9分鐘。注射孔和FID分別維持于300° C和320° C。鯊烯峰值的鑒定用GC/MS (用質(zhì)量選擇檢測(cè)器的氣相色譜)建立。純度報(bào)告為鯊烯峰面積占色譜中所有峰面積之和的百分比。所述純化蒸餾可在所述變性蒸餾之前進(jìn)行，產(chǎn)生純化的組合物?；蛘?，所述純化蒸餾可在所述變性蒸餾之后進(jìn)行，產(chǎn)生變性的純化組合物。變性蒸餾鯊魚(yú)和因而源自鯊魚(yú)肝油的鯊烯可含有人類過(guò)敏的蛋白。人類可能過(guò)敏的常見(jiàn)魚(yú)蛋白是在鯊魚(yú)中發(fā)現(xiàn)的小清蛋白。此外，污染蛋白或材料可在例如純化蒸餾之后或作為鯊烯的降解產(chǎn)物而被引入鯊烯組合物中?？赡艿奈廴镜鞍谆虿牧习ū⒁胰?、甲醛和水。優(yōu)選地，變性蒸餾步驟使含鯊烯組合物變性和/或從中移除蛋白，尤其是小清蛋白和任何污染蛋白，從而提供變性的組合物。本發(fā)明方法的另一優(yōu)點(diǎn)是變性蒸餾可保證含鯊烯組合物中存在的任何潛在病毒失活和/或從純化的組合物中移除。因此所述變性組合物用于人·類應(yīng)用比非變性組合物安全。不希望被理論所限制，鯊烯的沸點(diǎn)取決于施加在含鯊烯組合物表面的外部壓力。然而，含鯊烯組合物中存在的任何蛋白會(huì)變性的溫度通常獨(dú)立于施加在含鯊烯組合物表面的外部壓力。因此，變性蒸餾可在特定溫度下進(jìn)行，而不考慮進(jìn)行蒸餾的壓力。具體地，所述變性蒸餾可在T2的溫度下進(jìn)行，其中T2可大于或等于200° C，如大于或等于205° C、大于或等于210° C、大于或等于215° C、大于或等于220° C、大于或等于230° C、大于或等于240° C、大于或等于250° C、大于或等于260° C。所述變性蒸餾可在低于500° C的溫度下進(jìn)行如低于480° C、低于450° C、低于420° C、低于 400° C、低于 350° C 或低于 300° C。變性蒸餾可在接近真空下進(jìn)行。具體地，所述變性蒸餾可在至少O. 5mm Hg的壓力下進(jìn)行，如至少O. 6mm Hg、至少O. 7mm Hg或至少O. 8mm Hg。所述變性蒸懼可在低于5mm Hg的壓力下進(jìn)行，如低于4mm Hg、低于3mm Hg、低于2mm Hg、低于I. 5mm Hg、低于Imm Hg或低于 O. 9mm Hg。本發(fā)明的其他實(shí)施方式包括上述引用的最小和最大溫度以及最小和最大壓力的組合。為了在該高溫下進(jìn)行變性蒸餾，優(yōu)選使用將含鯊烯組合物與熱表面接觸的設(shè)備。熱表面可維持在如上所定義的溫度T2，所述熱表面周圍的壓力可為上述定義的壓力以用于變性蒸餾。所述熱表面周圍的壓力可選擇成確保觀察到的鯊烯沸點(diǎn)是1~2或更小。隨著含鯊烯組合物與所述熱表面接觸，在所述熱表面周圍壓力下沸點(diǎn)低于T2的那些組合物成分(包括鯊烯)會(huì)蒸發(fā)。未蒸發(fā)組分如蛋白保持在熱表面上，且可變性并從鯊烯中分離。變性蒸餾前，含鯊烯組合物可包括85%_99. 9%的鯊烯，如95%_99. 5%的鯊烯、95%-99. 5%的鯊烯或97%-99. 5%的鯊烯。所述變性蒸餾可產(chǎn)生具有較高鯊烯百分比的鯊烯組合物。具體地，所述變性蒸餾可產(chǎn)生至少含95%鯊烯的變性組合物，如至少99%鯊烯、至少99. 5%鯊烯、至少99. 9%鯊烯或甚至100%鯊烯。變性蒸餾可產(chǎn)生含少于O. 5%蛋白的變性組合物，如少于O. 1%蛋白、少于O. 01%蛋白或0%蛋白。因此，本發(fā)明提供含少于O. 5%蛋白的鯊烯，如少于O. 1%蛋白、少于O. 01%蛋
白或0%蛋白。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述變性蒸餾可在所述純化蒸餾之后進(jìn)行，產(chǎn)生純化的變性組合物。T2 可大于 T1。具體地，T2-T1 可為 10。C-300。C，如 30。C-250。C、50。C-200。C或 80° C-150。Co溶劑為了避免在含鯊烯組合物中引入雜質(zhì)，這在所述鯊烯組合物旨在用于疫苗時(shí)尤其重要，所述純化和變性蒸餾可不添加溶劑而進(jìn)行。皂化 含鯊烯組合物可經(jīng)過(guò)皂化。皂化通常在上述蒸餾步驟(a)和(b)之前進(jìn)行。或者，皂化可在以任何順序進(jìn)行的蒸餾步驟(a)和(b)之間完成。或者，但不通常，皂化可在蒸餾步驟(a)和(b)之后進(jìn)行。皂化可破壞含鯊烯組合物中存在的蛋白。然而，皂化可能不移除所有存在的蛋白。含鯊烯組合物中殘留的任何殘余蛋白在皂化后可通過(guò)變性蒸餾步驟移除。皂化和變性蒸餾的組合具有優(yōu)勢(shì)，其增加了鯊烯不含有任何蛋白的可能性。皂化是酯類在堿性條件下水解形成醇和羧酸鹽。含鯊烯組合物的皂化期間，向所述組合物中加入堿(如NaOH或Κ0Η)可引起脂肪酸酯(如甘油三酯)轉(zhuǎn)變?yōu)樵?。皂化可具有?yōu)勢(shì)，因?yàn)槠淇稍黾釉砘a(chǎn)品沸點(diǎn)和未皂化產(chǎn)品沸點(diǎn)之間的差異，使通過(guò)蒸餾如純化和/或變性蒸餾的分離更有效?；蛘?，所述皂化產(chǎn)品可通過(guò)任何方法如離心移除。通過(guò)皂化移除脂肪酸酯可產(chǎn)生皂化的含鯊烯組合物，其相比未皂化的含鯊烯組合物可具有改良的純度(即更高的鯊烯％)。鯊烯鑒定本發(fā)明方法生產(chǎn)的鯊烯可具有低于4mg/ml的皂化值，如低于3mg/ml、低于2mg/ml或低于lmg/ml。該檢測(cè)表明鯊烯中存在的可皂化物質(zhì)的量。皂化值可如美國(guó)藥典(USP) <401>所述測(cè)定為氫氧化鈉的水解和中和等價(jià)物。用NaOH獲得的皂化值可通過(guò)將其乘以KOH和NaOH的分子量之比(I. 403)轉(zhuǎn)換為KOH值。本發(fā)明方法生產(chǎn)的鯊烯可具有小于或等于Img KOH/g的酸值，如小于或等于O. SmgKOH/g、小于或等于O. 6mg KOH/g、小于或等于O. 5mg KOH/g、小于或等于O. 4mg KOH/g、小于或等于0. 2mg K0H/g、小于或等于0. Img ΚΟΗ/g、小于或等于0. 05mg K0H/g、小于或等于
0.03mg KOH/g、小于或等于 0.02mgK0H/g 或小于或等于 0. Olmg ΚΟΗ/g。如 USP〈401> 所述，酸值可測(cè)定為鯊烯消耗的氫氧化鉀的中和等價(jià)物。水包油乳液一旦如上所述制備了含鯊烯組合物，其可用于制備下游產(chǎn)物如藥物、水包油乳液佐劑等。為了避免污染，優(yōu)選鯊烯在蒸餾處理后和制備下游產(chǎn)物前保持無(wú)菌。例如，若下游產(chǎn)物是乳液，則所述蒸餾和乳液設(shè)備可形成封閉系統(tǒng)以避免制備所述乳液形成前鯊烯的污染?；蛘呋虼送猓鲺徬┰谥苽湎掠萎a(chǎn)物前可保持在惰性氣體如氮?dú)庵?。發(fā)現(xiàn)水包油乳液特別適用于含佐劑的疫苗。本發(fā)明制備的乳液除了水性組分之夕卜，還包括鯊烯和至少一種表面活性劑。所述乳液可含額外的油。理想地，油與表面活性劑是可生物降解(可代謝)和生物相容性的?？墒褂悯徬┖蜕拥挠徒M合物。當(dāng)組合物包含生育酚時(shí)，可采用α、β、Υ、δ、ε或ξ生育酚中的任何一種，但優(yōu)選α-生育酚?？赏瑫r(shí)采用D-α-生育酚和DL-α-生育酚。優(yōu)選的α -生育酚是DL-α-生育酚。生育酚可取多種形式，例如不同的鹽和/或異構(gòu)體。鹽包括有機(jī)鹽,例如琥珀酸鹽、乙酸鹽、煙酸鹽等。如果采用生育酚的鹽,那么優(yōu)選的鹽是琥珀酸鹽?？墒褂冒ń酋徬┖蜕?如DL-α -生育酚)的油組合。油含量通常為2-20% (體積)。所述水性組分可為淡水(如I f. i.)或可包括其他組分如溶質(zhì)。例如，可包含鹽以形成緩沖液，例如檸檬酸或磷酸鹽，例如鈉鹽。常用緩沖液包括磷酸鹽緩沖劑；Tris緩沖劑；硼酸鹽緩沖劑；琥珀酸鹽緩沖劑；組氨酸緩沖劑；或檸檬酸鹽緩沖劑。包含的緩沖液一 般是5-20mM。表面活性劑優(yōu)選是可生物降解(可代謝)和生物相容性的?？赏ㄟ^(guò)’HLB’(親水/親脂平衡)對(duì)表面活性劑分類，其中1-10范圍內(nèi)的HLB表示該表面活性劑比起水更易溶于油，而10-20范圍內(nèi)的HLB表示比起油更易溶于水。乳液優(yōu)選包含至少一種HLB為至少10，例如至少15或優(yōu)選至少16的表面活性劑?？梢耘c本發(fā)明一起使用的表面活性劑包括但不限于聚氧乙烯去水山梨糖醇酯表面活性劑(通常稱為吐溫)，特別是聚山梨酯20和聚山梨酯80 ;以商品名D0WFAX 出售的環(huán)氧乙烷(EO)、環(huán)氧丙烷(PO)和/或環(huán)氧丁烷(BO)的共聚物，如直鏈ΕΡ/Ρ0嵌段共聚物；重復(fù)的乙氧基(氧-1，2-乙二基)數(shù)量不同的辛苯聚醇，特別感興趣的是辛苯聚醇9 (曲通(Triton) X-100，或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPALCA-630/NP-40);磷脂如磷脂酰膽堿(卵磷脂)；衍生自十二烷醇、十六烷醇、十八烷醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(稱為芐澤表面活性劑)，如三乙二醇單月桂基醚(芐澤30);聚氧乙烯-9-月桂醚以及去水山梨糖醇酯(通常稱為司盤(pán))，如去水山梨糖醇三油酸酯(司盤(pán)85)和去水山梨糖醇單月桂酸酯。乳液中包含的優(yōu)選表面活性劑是聚山梨酯80 (吐溫80 ;聚氧乙烯去水山梨糖醇單油酸酯)、司盤(pán)85 (去水山梨糖醇三油酸酯)、卵磷脂和曲通X100。所述乳液中可包括這些表面活性劑的混合物，如吐溫80/司盤(pán)85混合物或吐溫80/曲通-X 100混合物。聚氧乙烯脫水山梨糖醇酯如聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯(吐溫80)和辛苯聚醇如叔辛基苯氧基-聚乙氧基乙醇(曲通X-100)的組合也適用。另一種有用的組合包含月桂醇聚醚-9加聚氧乙烯去水山梨糖醇酯和/或辛苯聚醇。有用的混合物可包括HLB值為10-20的表面活性劑(如吐溫80，HLB為15. O)和HLB值為1_10的表面活性劑(如司盤(pán)85，HLB為1.8)。優(yōu)選的表面活性劑的含量(重量％)為聚氧乙烯去水山梨糖醇酯(如吐溫80)0. 01-2%;辛基-或壬基苯氧基聚氧乙醇(如曲通X-100或曲通系列的其它去污劑)0· 001-0. 1% ;聚氧乙烯醚(如月桂醇聚醚9)0. 1-20%。優(yōu)選含鯊烯的水包油乳液，所述乳液含有聚山梨酯80表面活性劑。所述水包油乳液可用包括下述步驟的方法制造(i)制備具有第一平均油滴尺寸的第一乳液，也稱作初步乳液或預(yù)乳液；(ii)微流化第一乳液形成具有比第一平均油滴尺寸小的第二平均油滴尺寸的第二乳液；和(iii)過(guò)濾第二乳液。所述第一乳液可通過(guò)均質(zhì)制備。乳液中的油滴直徑通常小于5 μ m,甚至可具有亞微米直徑，隨后通過(guò)微流化床方便地實(shí)現(xiàn)這種小尺寸以提供穩(wěn)定乳液。優(yōu)選尺寸小于220nm的液滴，因?yàn)槠淇蛇M(jìn)行過(guò)濾滅菌。用本發(fā)明所制備鯊烯生產(chǎn)的具體水包油乳液佐劑包括但不限于 鯊烯、聚山梨酯80 (吐溫80)和去水山梨糖醇三油酸酯(司盤(pán)85)的乳液。所述乳液的體積組成可以是約5%鯊烯、約O. 5%聚山梨酯80和約O. 5%司盤(pán)85。以重量計(jì)，這些比例為4. 3%鯊烯、O. 5%聚山梨酯80和O. 48%司盤(pán)85。這種佐劑稱為‘MF59’ [4-6]，參考文獻(xiàn)7的第10章和參考文獻(xiàn)8的第12章更詳細(xì)地描述了該佐劑。MF59乳液宜包含檸檬酸根離子，如IOmM檸檬酸鈉緩沖液。 鯊烯、生育酚(理想的是DL- α -生育酚)和聚山梨酯80的乳液。這些乳液可含有(以重量計(jì))2-10%鯊烯，2-10% α生育酚和O. 3-3%聚山梨酯80，例如4. 3%鯊烯、4. 7%生育酚、1. 9%聚山梨酯80。鯊烯生育酚的重量比優(yōu)選≤1 (例如O. 90)，因?yàn)檫@提供了更穩(wěn)定的乳液。鯊烯和聚山梨酯80的體積比可以約為5:2，或者重量比約為11:5?？赏ㄟ^(guò)以下方法制備一種這類乳液將聚山梨酯80溶解于PBS產(chǎn)生2%溶液，然后將90ml該溶液與5gDL-α-生育酚和5ml角鯊烯的混合物相混合，然后使該混合物微流體化。得到的乳液含有(如)平均直徑為100-250nm，優(yōu)選約180nm的亞微米油滴。該乳液也可含有3-脫-O-酰化單磷酰脂質(zhì)A(3d-MPL)。此種類型的另一種有用乳液可包含(每個(gè)人用劑量)0.5-10mg鯊烯、O. 5-1 Img生育酚和O. l-4mg聚山梨酯80 [9]。 鯊烯、生育酚和曲通去污劑(如曲通X-100)的乳液。該乳液也可包含3d-MPL。所述乳液可包含磷酸鹽緩沖液。 含有鯊烯、聚山梨酯(如聚山梨酯80)、曲通去污劑(如曲通X-100)和生育酚(如琥珀酸α-生育酚)的乳液。該乳液可包含這三種組分，其質(zhì)量比約為75:11:10(如.7501μ g/1111聚山梨酯80、1101μ g/1111曲通XlOO和100 μ g/ml琥珀酸α -生育酚)，且這些濃度應(yīng)包括抗原中這些組分的貢獻(xiàn)。該乳液也可包含3d-MPL。該乳液也可包含皂苷，如QS21。所述水相可包含磷酸鹽緩沖液?！ず絮徬?、水溶劑、聚氧乙烯烷基醚親水性非離子型表面活性劑(如聚氧乙烯
(12)十六十八醚)和疏水性非離子型表面活性劑(如去水山梨糖醇酯或二縮甘露醇酯，如去水山梨糖醇單油酸酯或‘司盤(pán)80’)的乳液。該乳液優(yōu)選為熱可逆的和/或其中至少90%油滴(以體積計(jì))的尺寸小于200nm[10]。該乳液也可含有以下一種或多種以下物質(zhì)糖醇；低溫保護(hù)劑(例如，糖，如十二烷基麥芽苷和/或蔗糖)；和/或烷基聚糖苷。該乳液可包含TLR4激動(dòng)劑[11]。這類乳液可凍干。 鯊烯、泊洛沙姆-105和Abil-Care的乳液[12]。含佐劑疫苗中這些組分的終濃度(重量)是5%鯊烯、4%泊洛沙姆-105 (普流羅尼克多元醇)和2%Abil-Care 85 (雙-PEG/PPG-16/16PEG/PPG16/16 二甲硅油；辛酸/癸酸甘油三酯)。如上以百分?jǐn)?shù)表示的這些乳液的組合物可通過(guò)稀釋或濃縮來(lái)改變(例如可以改變整數(shù)倍，如2或3倍，或改變部分，例如2/3或3/4)，其中其比例保持不變。例如，2倍濃縮的MF59可包含約10%鯊烯，約1%聚山梨酯80和約1%去水山梨糖醇三油酸酯?？上♂対饪s形式(例如用抗原溶液)，得到所需的乳液終濃度。
本發(fā)明的乳液理想地儲(chǔ)存在2° C_8° C。其不應(yīng)冷凍。理想上避直射光保存。具體地，本發(fā)明含鯊烯的乳液和疫苗應(yīng)當(dāng)受到保護(hù)以避免鯊烯的光化學(xué)分解。如果儲(chǔ)存本發(fā)明的乳液，那么優(yōu)選在惰性氣體例如氮?dú)饣驓鍤庵?。疫苗雖然可能將水包油乳液佐劑本身給予患者(如為單獨(dú)給予患者的抗原提供佐劑效應(yīng))，但更常見(jiàn)的是將佐劑與抗原混合后給予，從而形成免疫原性組合物例如疫苗?？梢栽谂R用前或者在疫苗生產(chǎn)過(guò)程中混合乳液和抗原，然后裝填。本發(fā)明的方法可用于這兩種情況。因此，本發(fā)明方法還可包括將含本發(fā)明所制備鯊烯的乳液與抗原組分混合的工藝步驟。或者，還可包括將佐劑與抗原組分一起包裝到藥盒中作為藥盒組分的步驟。因此，綜上所述，制備混合的疫苗時(shí)或制備包含易混合抗原和佐劑的藥盒時(shí)，可使用本發(fā)明。如果在生產(chǎn)過(guò)程中混合，那么所混合的散裝抗原和乳液的體積一般大于I升， 例如> 5升、> 10升、> 20升、^ 50升等。如果在使用時(shí)混合，那么所混合的體積一般小于I毫升，例如O. 6mK O. 5mK O. 4mK O. 3mK 0. 2ml等。在這兩種情況下，通?；旌系娜橐汉涂乖芤旱捏w積基本相等，即基本上為1:1(例如I. 1:1-1:1. 1，優(yōu)選
I.05:1-1:1.05,更優(yōu)選I. 025:1-1:1. 025)。然而，在一些實(shí)施方式中，可采用過(guò)量的乳液或過(guò)量的抗原[13]。當(dāng)一種組分的體積過(guò)量時(shí)，過(guò)量通常為至少I. 5:1，例如彡2: I、彡2.5:1,^ 3: U 4: U 5:1 等。抗原和佐劑作為藥盒中的單獨(dú)組分時(shí)，它們?cè)谒幒兄形锢砩舷嗷シ蛛x，這種分離可通過(guò)多種方式實(shí)現(xiàn)。例如，組分可以裝在不同的容器，如藥瓶中。需要時(shí)，可通過(guò)(例如)取出一個(gè)藥瓶的內(nèi)容物并將其加入另一個(gè)藥瓶，或者分別取出兩個(gè)藥瓶的內(nèi)容物并在第三個(gè)容器中將它們混合在一起，來(lái)混合兩個(gè)藥瓶的內(nèi)容物。在另一種配置中，一種藥盒組分在注射器中，另一種組分在容器如藥瓶中?？墒褂迷撟⑸淦?例如裝有針頭的注射器)將其內(nèi)含物注入藥瓶中混合，然后將該混合物抽回注射器中。然后，一般通過(guò)新的無(wú)菌針頭將該注射器中的混合內(nèi)容物給予患者。將一種組分包裝到注射器中無(wú)需用單獨(dú)注射器對(duì)患者給藥。在另一優(yōu)選配置中，這兩種藥盒組分在同一注射器中但分開(kāi)保存，例如雙室注射器，如參考文獻(xiàn)14-21等所述。操作注射器時(shí)(例如給予患者時(shí))，將這兩室中的內(nèi)容物混合。這種配置在使用時(shí)無(wú)需單獨(dú)的混合步驟。不同藥盒組件的內(nèi)容物通常均為液體形式。在一些配置中，組分(一般是抗原組分而非乳液組分)是干燥形式(例如凍干形式)，而另一組分是液體形式?？蓪⑦@兩種組分混合，以再次激活干燥組分，得到給予患者的液體組合物。凍干組分一般置于藥瓶中，而非注射器中。干燥組分可包含穩(wěn)定劑，例如乳糖、蔗糖或甘露醇，及其混合物，如乳糖/蔗糖混合物、蔗糖/甘露醇混合物等。一種可能的配置使用預(yù)填裝注射器中的液態(tài)乳液組分和藥瓶中的凍干抗原組分。如果疫苗還含有乳液和抗原以外的組分，那么這些其它組分可包含在這兩種藥盒組分之一中，或者可以是第三種藥盒組分的一部分。適用于本發(fā)明混合疫苗或單獨(dú)藥盒組分的容器包括藥瓶和一次性注射器。這些容器應(yīng)無(wú)菌。
組合物/組分裝在藥瓶中時(shí)，藥瓶?jī)?yōu)選由玻璃或塑料材料制成。在將組合物加入藥瓶之前，優(yōu)選對(duì)其進(jìn)行滅菌。為了避免膠乳過(guò)敏患者可能產(chǎn)生的問(wèn)題，藥瓶?jī)?yōu)選用無(wú)膠乳塞子密封，且優(yōu)選所有包裝材料均不含膠乳。在一個(gè)實(shí)施方式中，藥瓶具有丁基橡皮塞。藥瓶可包含單一劑量的疫苗/組分，或者可以包含一個(gè)以上劑量C多劑量’藥瓶)，如10個(gè)劑量。在一個(gè)實(shí)施方式中，藥瓶包含IOx O. 25ml劑量的乳液。優(yōu)選的藥瓶由無(wú)色玻璃制成。藥瓶可以有適合的帽(如魯爾(Luer)鎖)，以便將預(yù)填裝注射器插入該帽，可以將注射器的內(nèi)容物推入藥瓶(如在其中重建凍干物質(zhì))，可以將藥瓶的內(nèi)容物移回注射器中。從藥瓶中拔出注射器后，可連上針頭，將該組合物給予患者。該帽優(yōu)選位于封口或蓋子內(nèi)偵牝以便在封口或蓋子移除后才能接觸到該帽。將組合物/組分包裝到注射器中時(shí)，注射器通常不會(huì)連接有針頭，但可提供注射器單獨(dú)的針頭以組裝和使用。優(yōu)選安全性針頭。一般是I-英寸23號(hào)、I-英寸25號(hào)和5/8-英寸25號(hào)針頭?？商峁┯袆冸x標(biāo)簽的注射器，該標(biāo)簽上可打印上內(nèi)含物的批號(hào)、流感季節(jié)和過(guò)期日期，以幫助記錄保存。注射器的活塞優(yōu)選帶有防脫裝置，以防止活塞在吸出時(shí)偶然脫出。注射器可以有膠乳橡膠帽和/或活塞。一次性注射器含有單一劑量的疫苗。注射器通常帶有頂帽，以在連接針頭前密封頂端，所述頂帽優(yōu)選由丁基橡膠制成。如果注射器·和針頭分開(kāi)包裝，則針頭優(yōu)選裝有丁基橡膠護(hù)罩?？捎镁彌_液稀釋乳液，然后包裝入藥瓶或注射器。常用緩沖液包括磷酸鹽緩沖劑；Tris緩沖劑；硼酸鹽緩沖劑；琥珀酸鹽緩沖劑；組氨酸緩沖劑；或檸檬酸鹽緩沖劑。稀釋可降低佐劑組分的濃度，而維持其相對(duì)比例，例如提供“半強(qiáng)度”佐劑。容器可標(biāo)注顯示半劑量體積，以例如利于遞送給兒童。例如，含有O. 5ml劑量的注射器可有顯示O. 25ml體積的標(biāo)記。采用玻璃容器(如注射器或藥瓶)時(shí)，優(yōu)選采用由硼硅酸鹽玻璃，而非鈉鈣玻璃制成的容器。各種抗原均可用于水包油乳液，包括但不限于病毒抗原，如病毒表面蛋白；細(xì)菌抗原，如蛋白質(zhì)和/或糖抗原；真菌抗原；寄生蟲(chóng)抗原；和腫瘤抗原。本發(fā)明特別用于針對(duì)以下的疫苗流感病毒、HIV、鉤蟲(chóng)、乙肝病毒、單純皰疹病毒、狂犬病病毒、呼吸道合胞病毒、巨細(xì)胞病毒、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、衣原體、SARS冠狀病毒、水痘-帶狀皰疫病毒、肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)、腦膜炎奈瑟氏菌(NeisseriaMeningitidis)、結(jié)核分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis)、炭疽桿菌(Bacillusanthracis)、EB病毒、人乳頭瘤病毒等。例如·流感病毒抗原。所述抗原可以采取活病毒或者滅活病毒的形式。采用滅活病毒時(shí)，該疫苗可包含全病毒、裂解病毒顆?；蚣兓谋砻婵乖?包括血凝素，通常也包括神經(jīng)氨酸酶)。流感抗原也可以病毒體形式出現(xiàn)。所述抗原可具有選自下組的任何血凝素亞型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15 和 / 或 H16。疫苗可包括來(lái)自一種或多種(例如1、2、3、4或更多種)流感病毒株，包括甲型流感病毒和/或乙型流感病毒的抗原，例如單價(jià)A/H5N1或A/H1N1疫苗或三價(jià)A/H1N1+A/H3N2+B疫苗。流感病毒可以是重配毒株，并可通過(guò)逆向遺傳學(xué)技術(shù)獲得[如22-26]。因此，該病毒可包含來(lái)自A/PR/8/34病毒(一般是來(lái)自A/PR/8/34的6個(gè)節(jié)段，HA和N節(jié)段來(lái)自疫苗毒株，即6:2重配毒株)的一個(gè)或多個(gè)RNA節(jié)段?？梢栽陔u蛋(如含胚雞蛋)或細(xì)胞培養(yǎng)物上培養(yǎng)用作抗原來(lái)源的病毒。使用細(xì)胞培養(yǎng)物時(shí)，細(xì)胞底物一般是哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，如MDCK ；CHO ；293T ；BHK ；Vero ;MRC_5 ；PER. C6 ;WI_38 ;等。用于培養(yǎng)流感病毒的優(yōu)選哺乳動(dòng)物細(xì)胞系包括MDCK細(xì)胞[27-30]，衍生自馬達(dá)二氏(Madin Darby)犬腎;Vero細(xì)胞[31-33]，衍生自非洲綠猴腎；或PER. C6細(xì)胞[34]，衍生自人胚視網(wǎng)膜母細(xì)胞。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系上培養(yǎng)病毒時(shí)，該組合物宜不含雞蛋蛋白質(zhì)(如卵清蛋白和卵類粘蛋白)和雞DNA，從而降低變應(yīng)原性。通常參照血凝素(HA)含量(通常用SRID測(cè)定)標(biāo)準(zhǔn)化疫苗的單位劑量。現(xiàn)有的疫苗一般含有約15 μ gHA/毒株，但也可使用更低的劑量，特別是使用佐劑時(shí)。采用了分?jǐn)?shù)劑量如1/2 (即7. 5 μ gHA/毒株)、1/4和1/8 [35，36]，以及較高劑量(如3x或9x劑量[37，38])。因此，疫苗可包含每流感毒株O. 1-150 μ gHA，優(yōu)選O. 1-50 μ g，例如O. 1-20 μ g、0. 1-15 μ g、0. 1-10 μ g、0. 1-7. 5μ g、0-5y g等。具體劑量包括例如，每毒株約15、約10、約7. 5、約5、約3. 8、約 3. 75、約 L 9、約 I. 5 μ g 等。人免疫缺陷病毒，包括HIV-I和HIV-2。該抗原一般是包膜抗原。乙肝病毒表面抗原。該抗原優(yōu)選通過(guò)重組DNA方法獲得，例如在釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中表達(dá)后獲得。與天然病毒HBsAg不同，重組酵母表達(dá)的抗 原是非糖基化抗原。它可以是基本呈球形的顆粒形式(平均直徑約為20nm)，包括含有磷脂的脂質(zhì)基質(zhì)。不像天然HBsAg顆粒，酵母表達(dá)的顆?？赡馨字＜〈?。HBsAg可來(lái)自以下任何亞型aywl> ayw2> ayw3> ayw4> ayr、adw2> adw4> adrq-和 adrq+。鉤蟲(chóng),特別是犬中發(fā)現(xiàn)的鉤蟲(chóng)(犬鉤蟲(chóng)(Ancylostoma caninum))。這種抗原可以是重組Ac-MTP-I (蝦紅素樣金屬蛋白酶)和/或天冬氨酸血紅蛋白酶(Ac-APR-I)，它可以在桿狀病毒/昆蟲(chóng)細(xì)胞系統(tǒng)中表達(dá)為分泌蛋白[39,40]。單純皰疹病毒抗原(HSV)。用于本發(fā)明的優(yōu)選HSV抗原是膜糖蛋白gD。優(yōu)選使用HSV-2毒株的gD (，gD2’抗原)。該組合物可使用C-末端膜錨定區(qū)缺失的gD形式[41]，如包含天然蛋白的氨基酸1-306且C-末端加入天冬酰胺和谷胺酰胺的截短型gD。這種蛋白質(zhì)形式包括信號(hào)肽，所述信號(hào)肽被切割后產(chǎn)生成熟的283個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。缺失錨定物可將該蛋白制備成可溶形式。人乳頭瘤病毒抗原(HPV)。用于本發(fā)明的優(yōu)選HPV抗原是LI衣殼蛋白，該蛋白可組裝形成稱為病毒樣顆粒(VLP)的結(jié)構(gòu)。可通過(guò)在酵母細(xì)胞(例如釀酒酵母(S. cerevisiae))或昆蟲(chóng)細(xì)胞(例如夜蛾(Spodoptera)細(xì)胞，如草地貪夜蛾(S. frugiperda),或果蠅(Drosophila)細(xì)胞)中重組表達(dá)LI來(lái)產(chǎn)生VLP。在酵母細(xì)胞中，質(zhì)粒載體可攜帶LI基因；在昆蟲(chóng)細(xì)胞中，桿狀病毒載體可攜帶LI基因。更優(yōu)選地，該組合物包含來(lái)自HPV-16和HPV-18毒株的L1VLP。已證明這種二價(jià)組合非常有效[42]。除了 HPV-16和HPV-18毒株夕卜，也可能包含來(lái)自HPV-6和HPV-Il毒株的L1VLP。也可能采用致癌性HPV毒株。疫苗可包含 20-60 μ g/ml (如約 40 μ g/ml)的 L1/HPV 毒株。炭疽抗原。炭疽是由炭疽桿菌(Bacillus anthracis)引起的。合適的炭疽桿菌抗原包含A組分(致死因子(LF)和水腫因子(EF) )，二者共有稱為保護(hù)性抗原(PA)的共同B組分)。任選地，可使抗原脫毒。其它詳情可參見(jiàn)參考文獻(xiàn)[43-45]。 金黃色葡萄球菌(S. aureus)抗原。已知各種金黃色葡萄球菌抗原。合適的抗原包括莢膜糖(例如來(lái)自5型和/或8型菌株)和蛋白(例如IsdB，Hla,等)。莢膜糖抗原理想地與載體蛋白偶聯(lián)。
肺炎鏈球菌抗原。已知各種肺炎鏈球菌抗原。合適的抗原包括莢膜糖(例如來(lái)自血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F、和/或23F)和蛋白質(zhì)(例如肺炎球菌溶血素、脫毒的肺炎球菌溶血素、聚組氨酸三聚體蛋白D(PhtD)等)。莢膜糖抗原理想地與載體蛋白偶聯(lián)。癌抗原。已知各種腫瘤特異性抗原。本發(fā)明可使用引發(fā)針對(duì)肺癌、黑素瘤、乳腺癌、前列腺癌等的免疫治療性應(yīng)答的抗原?？乖芤和ǔＥc含鯊烯乳液，例如以1:1的體積比混合。該混合可以由疫苗生產(chǎn)商在裝填前進(jìn)行，或可在使用時(shí)由健康護(hù)理工作者進(jìn)行。藥物組合物用本發(fā)明方法制備的組合物是藥學(xué)上可接受的。它們可包含除了含鯊烯乳液和可任選抗原以外的組分。組合物可含有防腐劑，如硫柳汞或2-苯氧乙醇。然而，疫苗優(yōu)選應(yīng)基本不含(即小于5yg/ml)含萊物質(zhì),如不含硫柳萊[46.47]。更優(yōu)選無(wú)萊的疫苗和組分。組合物的pH通常為5. 0-8. 1，更常為6. 0-8.0，例如6. 5-7. 5。因此，本發(fā)明方法可包括在包裝前調(diào)整疫苗PH的步驟。該組合物優(yōu)選無(wú)菌。該組合物優(yōu)選無(wú)熱原，如每劑量含有<1EU(內(nèi)毒素單位，標(biāo)準(zhǔn)量度)，優(yōu)選每劑量〈O. IEU0該組合物優(yōu)選不含谷蛋白。該組合物可含有一次免疫的物質(zhì)，或者可含有多次免疫的物質(zhì)(即‘多劑量’藥盒)。多劑量配置優(yōu)選含有防腐劑。疫苗的給藥劑量體積一般為約O. 5ml，但可將一半劑量(即約O. 25ml)給予兒童。 治療方法和所述疫苗給予本發(fā)明提供用本發(fā)明方法制備的藥盒和組合物。根據(jù)本發(fā)明方法制備的組合物適合給予人類患者，本發(fā)明提供了在患者中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，包括將這種組合物給予患者的步驟。本發(fā)明也提供用作藥品的這些藥盒和組合物。本發(fā)明也提供以下應(yīng)用(i)抗原的水性制劑；和(ii)按照本發(fā)明制備的含鯊烯的水包油乳液在生產(chǎn)引起患者中免疫應(yīng)答的藥物中的應(yīng)用。這些方法和應(yīng)用引起的免疫應(yīng)答通常包括抗體應(yīng)答，優(yōu)選保護(hù)性抗體應(yīng)答。可以各種方式給予該組合物。最優(yōu)選的免疫途徑是肌肉內(nèi)注射(如注射到上肢或下肢)，但其它可用的途徑包括皮下注射、鼻內(nèi)[48-50]、口服[51]、皮內(nèi)[52. 53]、經(jīng)皮、透皮[54]等?？捎冒凑毡景l(fā)明制備的疫苗治療兒童和成年人?；颊呖梢孕∮贗歲、1-5歲、5-15歲、15-55歲或至少55歲?；颊呖梢允抢夏耆?如彡50歲，優(yōu)選彡65歲)、青年(如< 5歲)、住院患者、健康護(hù)理人員、軍隊(duì)服役人員和軍人、懷孕婦女、慢性疾病患者、免疫缺陷患者和去國(guó)外旅行的人。然而所述疫苗不僅適用于這些人群，還可用于更廣泛的群體。可在與其它疫苗基本相同的時(shí)間(例如在向健康護(hù)理專業(yè)人員的同一次醫(yī)療咨詢或就診期間)，將本發(fā)明疫苗給予患者。概述術(shù)語(yǔ)“包含”涵蓋“含有”以及“由……組成”，例如“包含” X的組合物可僅由X組成或可含有其它物質(zhì)，例如X+Y。與數(shù)值X相關(guān)的術(shù)語(yǔ)“約”是任選的并表示例如x± 10%。
詞語(yǔ)“基本上”不排除“完全”，如“基本上不含”Y的組合物可能完全不含Y。在必要時(shí)，詞語(yǔ)“基本上”可從本發(fā)明的定義中省略。除非另有明確說(shuō)明，包括混合兩種或多種組分的步驟的工藝不要求任何特定的混合順序。因此，組分可以任何順序混合。有三種組分時(shí)，可將兩種組分相互合并，然后可將該組合再與第三種組分混合等。本方法的各步驟可在相同或不同時(shí)間、相同或不同地理位置如國(guó)家以及由相同或不同人或?qū)嶓w進(jìn)行。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I圖I顯示蒸餾設(shè)備的示意圖，其用于本發(fā)明方法的純化和/或變性蒸餾步驟。參考圖I所述的過(guò)程可不向含鯊烯組合物添加任何溶劑而進(jìn)行。在圖I所示的實(shí)施方式中，·含鯊烯組合物置于氮?dú)飧采w的進(jìn)料容器(I)中。進(jìn)口管線(3)的一個(gè)末端具有聚丙二醇預(yù)濾器且置于進(jìn)料容器中，而所述進(jìn)口管線的另一末端具有不銹鋼針頭(19-ga.)，其插入蒸餾設(shè)備(5)的頂部。所述蒸餾設(shè)備包括形狀類似試管的室(7)，有圓柱形“熱指(hotfinger)"(9)從中央突出。沸點(diǎn)212° C的苯甲酸乙酯在所述指下加熱，為所述熱指壁提供熱量。盡管本實(shí)施方式使用苯甲酸乙酯，但明顯具有更高沸點(diǎn)的溶劑可用于增加所述熱指的溫度。蒸餾期間，所述蒸餾設(shè)備可抽空。含鯊烯組合物可加入所述蒸餾設(shè)備，如通過(guò)在所述蒸餾設(shè)備中使用低壓，通過(guò)不銹鋼針頭并滴在(11)所述熱指的熱壁上。隨著含鯊烯組合物被加熱，所述蒸餾設(shè)備壓力下沸點(diǎn)低于212° C的那些組分會(huì)揮發(fā)。為了用圖I的系統(tǒng)揮發(fā)鯊烯，所述蒸餾設(shè)備內(nèi)的壓力應(yīng)選擇成使鯊烯的沸點(diǎn)低于212° C或更低(如約I. 5mmHg或更低)。揮發(fā)的組分會(huì)在所述室(7)的外壁冷凝，其可通過(guò)周圍空氣冷卻，并會(huì)沿著壁流到也可為真空的收集燒瓶(13)中。非揮發(fā)性組分如蛋白留在所述熱指的壁上，并流入殘余物燒瓶(15)。極端揮發(fā)性組分可通過(guò)真空管線取出，降低其在鯊烯冷凝物中的水平。已進(jìn)行純化蒸餾的鯊烯用此設(shè)備蒸餾。不論什么來(lái)源，最終鯊烯一般具有>99. 9%的純度、〈O. 03mg KOH/g的酸值和<2mg/g的皂化值。變性蒸餾降低鯊烯的含水量，如
O.022%-0. 010%、O. 006-0. 005% 或 O. 010%_0· 006%。實(shí)施例2_測(cè)量阜化值。皂化值是中和游離酸并皂化I. Og物質(zhì)中所含酯類所需的氫氧化鉀的mg數(shù)。過(guò)程(USP〈401>):在配衡的250mL燒瓶中放置1.5g_2g物質(zhì)，精確稱重，加入25. OmL O. 5N氫氧化鉀-乙醇。在合適的冷凝器下用蒸汽浴加熱所述燒瓶，保持回流30分鐘，頻繁旋轉(zhuǎn)內(nèi)含物。然后加入ImL酚酞TS，用O. 5N鹽酸VS滴定過(guò)量的氫氧化鉀。相同條件下進(jìn)行空白測(cè)定。實(shí)際試驗(yàn)和空白試驗(yàn)中消耗O. 5N鹽酸的體積差異(以mL計(jì))乘以56. I和O. 5N鹽酸VS的精確當(dāng)量濃度，并除以所取樣品的重量(以g計(jì))即為皂化值。根據(jù)鯊烯來(lái)源，可獲得〈I. 4mg/g的皂化值。實(shí)施例3-測(cè)量酸值。脂肪和非揮發(fā)油的酸度可表示為中和10. Og物質(zhì)中游離酸所需的O. IN堿的mL數(shù)。酸值是中和I. Og物質(zhì)中游離酸所需的堿的mg數(shù)。過(guò)程(USP〈401>):在燒瓶中含有的50mL等體積醇和醚(已用O. IN氫氧化鈉中和為酚酞)中溶解精確稱重的約10. Og物質(zhì)。若所述測(cè)試樣品不溶于冷溶劑，則將所述燒瓶與合適的冷凝器連接并緩慢加熱，頻繁振蕩直到樣品溶解。加入ImL酚酞TS，并用O. IN氫氧化鈉VS滴定直到溶液振蕩30秒后仍為微粉色。計(jì)算各酸值。若滴定所需的O. IN堿VS的體積少于2mL，則可使用更稀釋的滴定液，或所述樣品大小可因此調(diào)節(jié)。結(jié)果可表示為滴定液的體積或O. IN氫氧化鈉的相當(dāng)體積形式。根據(jù)鯊烯來(lái)源，可獲得O. 03mg KOH/g的酸值。實(shí)施例4一摻入研究進(jìn)行許多摻入研究以證明所述變性蒸餾的效力。為了測(cè)定變性蒸餾移除的雜質(zhì)的水平，鯊烯組合物中摻入特定量的污染物(如水)以及可能的鯊烯分解產(chǎn)物(如甲醛、乙醛和丙酮)。摻入后的溶液經(jīng)過(guò)本發(fā)明所述的變性蒸餾并分析摻入的物質(zhì)。
4kg鯊烯組合物中摻入如O. 3mL(0. 2g)乙醛(>99. 5%純度)、0· 3mL (O. 2g)丙酮099. 9%純度)、0· 55mL 37重量%的甲醛水溶液(O. 2g)和3. 65g水，然后如實(shí)施例I所述進(jìn)行變性蒸餾。收集三部分蒸餾物并與摻入后的起始材料一起分析摻入的物質(zhì)。結(jié)果示于下表I
I摻入后I變性蒸餾部分廢料 試驗(yàn)/方法的起始第一部I第二部I第三部非揮發(fā)性 __材料分 分分 殘留物含水量(％>0.02 一 0.03 ~ 0.020.02 ~/A
丙酮(mg/K;;或 ppm)__50.9__XO__57__Lj__N/A._
乙醛(m /K 或 |>Pm)12.4 一 (i.9 ' i.9 1).9N/A
甲醛(mg/KK 或 ppm)2.2().70.9N/A表I表I的結(jié)果顯示丙酮、乙醛和甲醛濃度在變性蒸餾后全都下降。應(yīng)理解，僅以舉例的方式描述了本發(fā)明，在本發(fā)明的范圍和構(gòu)思內(nèi)可對(duì)之進(jìn)行修改。參考文獻(xiàn)[I]Borucinska和 Frasca(2002)J Fish Diseases 25:287-98.[2]Bertone 等(1996)J Fish Diseases 19:429-34.[3]Briones 等· (1998) J Vet Med B 45:443-5.[4]W090/14837.[5]Podda和 Del Giudice(2003)Expert Rev Vaccines 2:197-203.[6]Podda(2001)Vaccine 19:2673-2680.[7]Vaccine Design The Subunit and Adjuvant Approach (《疫苗設(shè)計(jì)亞基和佐劑方法》)(PowelI 和Newman編)Plenum Press (普萊努出版社)1995 (ISBN0-306-44867-X)。[8] Vaccine Adjuvants !Preparation Methods and Research Protocols (《疫苗佐劑制備方法和研究方案》)(Methods in Molecular Medicine series (《分子醫(yī)學(xué)方法》)叢書(shū)的第 42 卷)。ISBN: 1-59259-083-7. O，Hagan 編[9]W02008/043774.[10]US-2007/0014805.
[ll]US-2007/0191314.[12]Suli 等(2004)Vaccine 22(25-26):3464-9.[13]W02007/052155.[14]W02005/089837.[15] US 6, 692, 468.[16]W000/07647.[17]W099/17820.
[18]US 5, 971, 953.[19] US 4, 060, 082.[20]EP-A-0520618.[21]W098/01174.[22]Hoffmann 等.(2002)Vaccine 20:3165-3170.[23]Subbarao 等· (2003)Virology 305:192-200.[24]Liu 等.(2003)Virology 314:580-590.[25]0zaki 等· (2004) J. Virol. 78:1851-1857.[26]Webby 等·(2004)Lancet 363:1099-1 103.[27]W097/37000.[28]Brands 等.(1999) Dev Biol Stand 98:93-100.[29]Halperin 等· (2002)Vaccine 20:1240-7.[30]Tree 等.(2001)Vaccine 19:3444-50.[31]Kistner 等·(1998)Vaccine 16:960-8.[32]Kistner 等· (1999)Dev Biol Stand 98:101-110.[33]Bruhl 等· (2000)Vaccine 19:1149-58.[34]Pau 等·(2001)Vaccine 19:2716-21.[35] W001/22992.[36]Hehme 等.(2004) Virus Res. 103 (1-2) : 163-71.[37]Treanor 等(1996)J Infect Dis 173:1467-70.[38]Keitel 等· (1996)Clin Diagn Lab Tmmunol 3:507-10.[39]Williamson 等·(2006) Infection and Immunity 74:961-7.[40] Loukas 等· (2005) PLoS Med 2(10) :e295.[41] EP-A-0139417.[42]Harper 等· (2004)Lancet 364(9447):1757-65.[43]J Toxicol Clin Toxicol(2001)39:85-100.[44]Demicheli 等·(1998)Vaccine 16:880-884.[45] Stepanov 等· (1996) J Biotechnol 44:155-160.[46]Banzhoff(2000)Immunology Letters 71:91-96.[47]W002/097072.[48] Greenbaum 等· (2004) Vaccine 22:2566-77.[49] Zurbriggen 等·(2003) Expert Rev Vaccines 2:295-304.
[50]Piascik(2003)J Am Pharm Assoc (Wash DC)·43:728-30.[51]Mann 等(2004)Vaccine 22:2425-9.[52]Halperin 等· (1979)Am J Public Health 69:1247-50.
[53]Herbert 等· (1979) J Infect Dis 140:234-8. [54]Chen 等(2003)Vaccine 21:2830-6.
權(quán)利要求
1.一種從動(dòng)物源的含鯊烯組合物中制備鯊烯的方法，所述方法包括步驟 (a)在溫度T1進(jìn)行純化蒸餾； (b)在溫度T2進(jìn)行變性蒸餾； 其中步驟(a)和(b)可以任一順序進(jìn)行；!\和T2足以使鯊烯沸騰；T2>T1;且T2 彡 200。Co
2.一種從含鯊烯組合物中制備鯊烯的方法，所述方法包含步驟 (a)在溫度T1進(jìn)行純化蒸餾； (b)在溫度T2進(jìn)行變性蒸餾； 其中步驟(a)和(b)可以任一順序進(jìn)行J1和1~2足以使鯊烯沸騰；1\〈140° C;且T2 彡 200。Co
3.如權(quán)利要求I或權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述組合物包括一種或多種蛋白。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述組合物包含小清蛋白。
5.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法,其特征在于,所述變性蒸懼在O.5mmHg-5. OmmHg的壓力下進(jìn)行。
6.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述純化蒸餾在70-100°C的溫度下進(jìn)行。
7.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法,其特征在于,所述純化蒸懼在O.5 μ mHg-5 μ mHg的壓力下進(jìn)行。
8.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述純化蒸餾在所述變性蒸餾前進(jìn)行。
9.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述含鯊烯組合物經(jīng)歷皂化。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述皂化包括在含鯊烯組合物中添加NaOH或 Κ0Η。
11.一種含99%或更多鯊烯的組合物的重蒸餾方法，所述重蒸餾是在T2的溫度下進(jìn)行的變性蒸餾；其中T2彡200° C。
12.一種制造水包油乳液的方法，所述方法包括用如權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述制備的鯊烯來(lái)制備乳液。
13.—種制備疫苗組合物的方法，所述方法包括如權(quán)利要求12所述制備乳液，并將所述乳液與抗原混合。
14.一種制備疫苗藥盒的方法，所述方法包括如權(quán)利要求12所述制備乳液并將乳液與抗原組分一起包裝到藥盒中作為藥盒組分。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述藥盒組分在獨(dú)立的藥瓶中。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述藥瓶用硼硅酸鹽玻璃制成。
17.如權(quán)利要求13-16中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述抗原是流感病毒抗原。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述乳液和抗原的組合形成疫苗組合物且其中所述疫苗組合物包括每流感病毒株約15yg、約lOyg、約7. 5 μ g、約5 μ g、約3.8 μ g、約 3· 75 μ g、約 I. 9 μ g 或約 I. 5 μ g 血凝素。
19.如權(quán)利要求17或18所述的方法，其特征在于，所述乳液和所述抗原的組合形成疫苗組合物，且其中所述疫苗組合物包含硫柳汞或2-苯氧基乙醇防腐劑。
20.如權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的方法制備的鯊烯。
21.一種含權(quán)利要求20所述的鯊烯的水包油乳液。
22.—種含權(quán)利要求20所述的鯊烯的疫苗。
23.如權(quán)利要求20所述的鯊烯在佐劑和/或疫苗中的應(yīng)用。
全文摘要
從含鯊烯組合物中制備鯊烯的改良方法，所述方法包括步驟(a)在溫度T1進(jìn)行純化蒸餾;(b)在溫度T2進(jìn)行變性蒸餾;其中步驟(a)和(b)可以任一順序進(jìn)行;T1和T2足以使鯊烯沸騰;T2>T1;且T2>200°C。
文檔編號(hào)A61K9/107GK102892734SQ201180023553
公開(kāi)日2013年1月23日 申請(qǐng)日期2011年5月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月12日
發(fā)明者M·霍拉 申請(qǐng)人:諾華有限公司