專利名稱：羥基磷灰石基生物復(fù)合支架及組織工程骨的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種羥基磷灰石基生物復(fù)合支架及其制備方法，以及由其構(gòu)建的組織工程骨，屬于生物醫(yī)用材料領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
在生命活動中由外傷、感染、腫瘤及先天性疾病等原因造成的骨缺損十分常見，尤其是肢體創(chuàng)傷所造成的骨缺損發(fā)病率高達(dá)10%，骨缺損的治療和修復(fù)是骨科臨床常見的難癥之一。已有研究表明長管狀骨骨干的直徑?jīng)Q定了骨缺損能否自行愈合的長度，當(dāng)骨缺損長度超過其直徑的1.5 2. 5倍時即難自行愈合，需要植骨材料修復(fù)。但目前臨床使用的骨修復(fù)材料各有利弊，尚不能達(dá)到修復(fù)骨缺損理想材料的要求。近年來隨著骨組織工程技術(shù)的發(fā)展，構(gòu)建有生命活性的組織工程化復(fù)合材料的研究有了一定的進(jìn)展，這無疑將會對臨床治療骨缺損帶來重大的科學(xué)意義和實用價值。組織工程骨的構(gòu)建基本方法為將體外培養(yǎng)的種子細(xì)胞-成骨細(xì)胞復(fù)合接種到作為細(xì)胞外基質(zhì)的支架材料上，經(jīng)過體內(nèi)或體外培養(yǎng)構(gòu)建成組織工程骨，植入體內(nèi)進(jìn)行骨缺損的修復(fù)。目前骨組織工程研究中最大的問題是支架材料的選擇。骨組織工程所需支架材料應(yīng)具有以下特點(1)具有良好的生物活性和生物降解性，在體內(nèi)的降解產(chǎn)物對人體無害；(2)具有一定的骨誘導(dǎo)性和骨傳導(dǎo)性，利于細(xì)胞貼附與增殖；(3)具有一定強度，在機體內(nèi)保持自身形狀并能對抗外力；(4)易于塑形，可根據(jù)需要加工成各種形狀和大??；(5)具有負(fù)荷最大量細(xì)胞的高滲透性；(6)支持成骨細(xì)胞生長和功能分化的表面化學(xué)性質(zhì)與微結(jié)構(gòu)；(7)可與其他生物活性分子如骨形態(tài)發(fā)生蛋白復(fù)合、控釋從而對種子細(xì)胞的生長進(jìn)行調(diào)控；(8)易消毒。目前骨組織工程支架材料來源可分為無機材料和有機材料兩類。無機材料主要是指生物陶瓷類材料。這類材料主要由鈣、磷元素組成，與人體內(nèi)主要無機成分類似，故具有良好的生物相容性、生物降解性以及骨傳導(dǎo)性。但是這類材料的最大缺陷在于降解極其困難，影響了新生骨的生成和改建。有機類材料可分為天然與人工有機材料。天然有機材料包括膠原、殼聚糖、纖維蛋白凝膠等，這類材料的共性是生物相容性好，利于細(xì)胞貼附、增殖、分化，但是作為骨組織工程支架機械強度不夠，降解時間難以控制。因此將納米級羥基磷灰石與具有骨誘導(dǎo)活性的有機大分子復(fù)合構(gòu)建與天然骨類似的復(fù)合骨替代材料已成為當(dāng)前的研究趨勢。組織工程修復(fù)均屬于血管形成過程，是一個多因子協(xié)調(diào)作用的復(fù)雜調(diào)控過程。目前認(rèn)為毛細(xì)血管形成過程中，Ang-I、Ang-2及VEGF這三種因子發(fā)揮重要作用，構(gòu)成Ang/血管生成素受體信號傳導(dǎo)途徑。當(dāng)機體啟動血管生長時，首先是VEGF與VEGF受體結(jié)合，引發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞增生并遷移，內(nèi)皮細(xì)胞相互作用形成幼稚管腔，逐漸發(fā)育形成毛細(xì)血管。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是骨組織工程臨床應(yīng)用良好的種子細(xì)胞來源。若將VEGF基因轉(zhuǎn)入BMSCs 中，就有可能使BMSCs在發(fā)揮成骨作用的同時，表達(dá)分泌VEGF，從而促進(jìn)血管的生成與長入，有利于血管化組織工程骨的新生，提高組織工程骨修復(fù)骨缺損的效果，并解決了活體直接應(yīng)用VEGF不能長久保持其活性且價格昂貴等問題。
本發(fā)明的申請人曾于2009年06月10日申請過一項發(fā)明專利，公開號為CN 101085374A，發(fā)明名稱為“一種組織工程化骨復(fù)合體及應(yīng)用”，公開了一種組織工程化骨復(fù)合體，是由呈多空狀且孔徑間貫通的人工骨支架及植入孔中的轉(zhuǎn)染有血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組成的，其可作為骨缺損修復(fù)材料應(yīng)用，可使種子細(xì)胞在發(fā)揮成骨作用的同時，表達(dá)分泌VEGF，從而促進(jìn)血管的生成或長入，為新骨生成提供物質(zhì)基礎(chǔ)， 有利于血管化組織工程骨組織的新生，提高組織工程骨組織修復(fù)骨缺損的效果。但其存在以下缺陷羥甲基殼聚糖粘度大，不易降解。中國專利申請200910229016. 9，公開號為CN102085391A的發(fā)明專利申請公開
了一種羥基磷灰石/殼聚糖-絲素蛋白納米復(fù)合材料，其權(quán)利要求1為羥基磷灰石/殼聚糖一絲索蛋白納米復(fù)合材料，其特征在于將產(chǎn)物HA/Chs-SF中各組分的質(zhì)量比定為 HA Chs SF= (60 80) (10 20) (10 20)，氫氧化鈣和磷酸水溶液按經(jīng)基磷灰石中Ca/P的化學(xué)計量比混合，并與混合在一起的絲素蛋白、殼聚糖溶液進(jìn)行共沉淀反應(yīng)，利用此素蛋白與殼聚糖復(fù)合有機模板對IIA結(jié)晶的成核和生長的調(diào)控作用，保證納米隊粒子在復(fù)合有機基質(zhì)中的均勻分散，實現(xiàn)無機與有機組元在分子水平的復(fù)合，形成與天然骨相似的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的納米復(fù)合材料。但其存在以下缺陷制備過程中沒有加入造孔劑或者采用其他有效的造孔方法，因而所得復(fù)合材料氣孔率及孔徑分布無法控制；此外該專利沒有添加細(xì)胞及生長因子，所得復(fù)合材料無法直接應(yīng)用于骨組織修復(fù)。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供了一種羥基磷灰石基生物復(fù)合支架及其制備方法，以及由其構(gòu)建的組織工程骨。本發(fā)明以粒子浙濾和真空干燥的方法獲得了一種以羥基磷灰石為基體，絲素蛋白與殼聚糖為增強相的具有三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的多孔復(fù)合支架材料，同時，依照組織工程骨復(fù)合體的三要素(支架材料、種子細(xì)胞、信號因子)的原則，利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將VEGF轉(zhuǎn)染BMSCs植入復(fù)合材料內(nèi)，構(gòu)建了一種新型組織工程骨，使BMSCS在發(fā)揮成骨作用的同時，表達(dá)分泌VEGF，促進(jìn)血管化，從而提高骨缺損修復(fù)的效率。本發(fā)明可以為研制理想的骨缺損修復(fù)替代材料提供一定的實驗依據(jù)和理論基礎(chǔ)。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的一種羥基磷灰石基生物復(fù)合支架，是由羥基磷灰石、絲素蛋白和殼聚糖構(gòu)成的，其中，各組分的質(zhì)量比為HA SF CS=(⑶ 8O) (10 2O) (10 2O)，復(fù)合支架呈多孔狀，孔隙率為70 90%，孔徑尺寸150 200 μ m，以圓形為主，孔與孔之間相互貫通。所述羥基磷灰石基生物復(fù)合支架的制備方法，包括以下步驟(1)將桑蠶繭去蛹、清洗，按照浴比(10 20) 1(質(zhì)量比)置于0.01 O.lmol/ L的碳酸鈉溶液中煮沸30 90min，然后用去離子水洗滌、干燥，除去對人體組織有致敏反應(yīng)的絲膠蛋白，得到絲素蛋白；(2)按最終產(chǎn)物中 HA SF CS = (60 80) (10 20) (10 20)的比例將上述脫膠處理后的絲素蛋白溶于氯化鈣-乙醇-水三元溶液中，50 90°C攪拌20 60min，至完全溶解，得絲素蛋白溶液，置于三口燒瓶中，備用；其中，三元溶液中，氯化鈣 乙醇水的摩爾比為1:2:8;(3)以氯化鈣為鈣源，按照羥基磷灰石中Ca/P摩爾比為1. 67配置磷酸氫二銨溶液，其中，磷酸氫二銨的濃度為0. 5 2mol/L ；(4)按最終產(chǎn)物中 HA SF CS = (60 80) (10 20) (10 20)的比例，將上述磷酸氫二銨溶液逐滴加入到絲素蛋白溶液中，30 90°C下機械攪拌反應(yīng)1 6h， 再在室溫下靜置陳化10 48h，反應(yīng)過程中通過氨水調(diào)節(jié)并控制反應(yīng)液的pH值在8 11 ； 反應(yīng)結(jié)束后，用蒸餾水洗滌至中性后再用無水乙醇洗滌，干燥，得到納米級弱結(jié)晶的羥基磷灰石/絲素蛋白復(fù)合粉體；(5)向上述所得的羥基磷灰石/絲素蛋白復(fù)合粉體中加入無水乙醇，攪拌成糊狀， 得羥基磷灰石/絲素蛋白無水乙醇膠體，其中，羥基磷灰石/絲素蛋白復(fù)合粉體與無水乙醇的質(zhì)量比為1 (0.5 2)；(6)按最終產(chǎn)物中 HA SF CS = (60 80) (10 20) (10 20)的比例稱取殼聚糖，按照殼聚糖乙酸溶液質(zhì)量比1 (15 20)將其溶解于乙酸濃度為0.01 0. 04g/mL的乙酸溶液中；(7)將上述配置好的殼聚糖乙酸溶液加入到步驟(5)中的羥基磷灰石/絲素蛋白無水乙醇膠體中，攪拌，超聲分散，得到均勻的復(fù)合溶膠；(8)按質(zhì)量比(羥基磷灰石+絲素蛋白+殼聚糖)氯化鈉=1 (0.5 2)， (絲素蛋白+殼聚糖)京尼平=1 (10 50)的比例，將粒徑為150 250 μ m的氯化鈉顆粒以及京尼平加入到上述復(fù)合溶膠中，攪拌、注模，室溫下靜置10 Mh，然后置于真空干燥箱中干燥，得復(fù)合材料；(9)將所得復(fù)合材料脫模后，室溫下置于去離子水中浸泡1 4h，然后真空干燥； 重復(fù)該步驟(指在去離子水中浸泡和真空干燥步驟)3 5次，然后將氯化鈉顆粒浙濾干凈，即得到羥基磷灰石基生物復(fù)合支架。一種由羥基磷灰石基生物復(fù)合支架構(gòu)建的組織工程骨，是由轉(zhuǎn)染VEGF基因的 BMSCs植入羥基磷灰石基生物復(fù)合支架上構(gòu)建而成的。本發(fā)明所植入的轉(zhuǎn)染VEGF基因的BMSCs同發(fā)明專利CN101085374A中所用的一致，在此不再贅述。本發(fā)明的有益效果如下本發(fā)明以羥基磷灰石、絲素蛋白和殼聚糖為原料，采用粒子浙濾結(jié)合真空干燥工藝制備羥基磷灰石基生物復(fù)合支架材料，通過調(diào)節(jié)各組員比例調(diào)節(jié)支架的降解速率，通過調(diào)節(jié)氯化鈉顆粒的半徑及加入量控制復(fù)合材料內(nèi)孔徑分布。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所得支架降解率及孔徑分布更容易控制，分布更理想，且具有良好的力學(xué)性能。本發(fā)明所得組織工程骨使BMSCs在發(fā)揮成骨作用的同時，表達(dá)分泌VEGF，從而促進(jìn)血管的生成與長入，有利于血管化組織工程骨的新生，提高組織工程骨修復(fù)骨缺損的效果，并解決了活體直接應(yīng)用VEGF不能長久保持其活性且價格昂貴等問題。


圖1為HA/SF-CS復(fù)合材料XRD分析。圖2為HA/SF-CS復(fù)合材料SEM分析。圖3為組織工程骨植入1周后X光照片。圖4為組織工程骨植入12周后X光照片。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。實施例1制備羥基磷灰石基生物復(fù)合支架步驟如下(1)將桑蠶繭去蛹、清洗，按照浴比10 1置于0. 02mol/L的碳酸鈉溶液中煮沸 30min，然后用去離子水洗滌，除去對人體組織有致敏反應(yīng)的絲膠蛋白，得到絲素蛋白(2)按最終產(chǎn)物中HA SF CS = 8 1 1，稱取上述脫膠處理后的絲素蛋白溶于氯化鈣-乙醇-水三元溶液中，80°C攪拌30min，至完全溶解，得絲素蛋白溶液，將之置于三口燒瓶中備用；其中，三元溶液中，氯化鈣乙醇水的摩爾比為1:2:8;(3)以氯化鈣為鈣源，按照Ca/P摩爾比為1. 67配置濃度為0. 5mol/L的磷酸氫二銨溶液；(4)將磷酸氫二銨溶液逐滴加入到絲素蛋白溶液中，60°C下機械攪拌反應(yīng)2h，室溫靜置陳化16h，反應(yīng)過程中通過氨水調(diào)節(jié)并控制反應(yīng)液的pH值在9 ；反應(yīng)結(jié)束后，用蒸餾水洗滌至中性后再用無水乙醇洗滌、干燥，得到納米級弱結(jié)晶的羥基磷灰石/絲素蛋白復(fù)合粉體；(5)向上述所得的羥基磷灰石/絲素蛋白復(fù)合粉體中按照質(zhì)量比1 0.7加入無水乙醇，攪拌成糊狀；(6)按最終產(chǎn)物中HA SF CS = 8 1 1稱取殼聚糖，按照1 20的比例將其溶解于濃度為0. 02g/mL的乙酸溶液中；(7)將配置好的殼聚糖乙酸溶液加入到步驟(5)中得羥基磷灰石/絲素蛋白無水乙醇膠體中，攪拌，超聲分散，得到均勻的復(fù)合溶膠；(8)按照質(zhì)量比(羥基磷灰石+絲素蛋白+殼聚糖)氯化鈉為1 1，(絲素蛋白+殼聚糖)京尼平為1 30，將粒徑為200μπι的氯化鈉顆粒以及京尼平加入到上述復(fù)合溶膠中，攪拌、注模，室溫下靜置20h，然后置于真空干燥箱中干燥，得復(fù)合材料；(9)將所得復(fù)合材料脫模后，室溫下置于去離子水中浸泡2h，然后真空干燥；重復(fù)該步驟3次，將氯化鈉顆粒浙濾干凈，即得到羥基磷灰石基生物復(fù)合支架。 實施例2制備羥基磷灰石基生物復(fù)合支架重復(fù)實施例1，其中HA SF CS比改為7 2 1。實施例3制備羥基磷灰石基生物復(fù)合支架重復(fù)實施例1，其中(羥基磷灰石+絲素蛋白+殼聚糖)氯化鈉質(zhì)量比改為 1 1.5。上述三個實施例所得羥基磷灰石/絲素蛋白-殼聚糖復(fù)合支架進(jìn)行下列檢測XRD與FT4R檢測證實復(fù)合支架由羥基磷灰石、絲素蛋白、殼聚糖三相構(gòu)成，如圖 1所示；經(jīng)過JEM-lOOCx II SEM分析表明復(fù)合支架中中孔與孔之間相互貫通，氣孔率均超過70%，平均孔徑在150 200 μ m(圖2)；經(jīng)深圳三思萬能材料試驗機檢測復(fù)合支架抗壓強度均超過150MPa，符合骨支架復(fù)合材料的要求。
實施例4構(gòu)建組織工程骨及相關(guān)性能檢測步驟如下(1)由NCBI gene bank獲得兔的VEGF基因序列，利用分子生物學(xué)的原理和方法， 自兔組織提取總RNA，根據(jù)合成的引物，反轉(zhuǎn)錄制備VEGF cDNA片段。與載體相連接，通過脂質(zhì)體構(gòu)建pcDNA3. I-VEGF質(zhì)粒。抽取成年兔骨髓進(jìn)行體外細(xì)胞培養(yǎng)、傳代獲得BMSCs。將構(gòu)建的VEGF質(zhì)粒導(dǎo)入BMSCs。(2)取實施例1中制備的HA/SF-CS復(fù)合支架，然后通過常規(guī)方法將轉(zhuǎn)染VEGF基因的BMSCs植入支架內(nèi)，即得到組織工程骨。(3)建立兔橈骨中段15 20mm長的骨缺損模型(建模方式與發(fā)明專利 CN101085374A中一致)，采用X射線方法觀察轉(zhuǎn)染VEGF的BMSCs復(fù)合HA/SF-CS的成骨情況。植入組織工程骨1周后如圖3所示，骨缺損明顯；4周可見支架部分降解；植入12 周后如圖4所示，可見降解顯著，骨組織周圍血管生長豐富，開始生成新骨，骨髓腔貫通，修復(fù)良好，基本愈合，自體骨形成。另外，實驗中未發(fā)生明顯異常反應(yīng)，支架生物相容性良好。
權(quán)利要求
1.羥基磷灰石基生物復(fù)合支架，其特征在于是由羥基磷灰石、絲素蛋白和殼聚糖構(gòu)成的，其中，各組分的質(zhì)量比為HA SF CS= (60 80) (10 20) (10 20)，復(fù)合支架呈多孔狀，孔隙率為70 90%，孔徑尺寸150 200 μ m,以圓形為主，孔與孔之間相互貫通。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的羥基磷灰石基生物復(fù)合支架的制備方法，其特征在于，包括以下步驟(1)將桑蠶繭去蛹、清洗，按照浴比(10 20) 1置于0. 01 0. lmol/L的碳酸鈉溶液中煮沸30 90min，然后用去離子水洗滌、干燥，得到絲素蛋白；(2)按最終產(chǎn)物中HA SF CS = (60 80) (10 20) (10 20)的比例， 將上述脫膠處理后的絲素蛋白溶于氯化鈣-乙醇-水三元溶液中，50 90°C攪拌20 60min，至完全溶解，得絲素蛋白溶液，備用；其中，三元溶液中，氯化鈣乙醇水的摩爾比為 1 2 8 ；(3)以氯化鈣為鈣源，按照羥基磷灰石中Ca/P摩爾比為1.67配置磷酸氫二銨溶液，其中，磷酸氫二銨的濃度為0. 5 2mol/L ；(4)按最終產(chǎn)物中HA SF CS= (60 80) (10 20) (10 20)的比例，將上述磷酸氫二銨溶液逐滴加入到絲素蛋白溶液中，30 90°C下機械攪拌反應(yīng)1 他，再在室溫下靜置陳化10 48h，反應(yīng)過程中通過氨水調(diào)節(jié)并控制反應(yīng)液的pH值在8 11 ；反應(yīng)結(jié)束后，用蒸餾水洗滌至中性后再用無水乙醇洗滌，干燥，得到羥基磷灰石/絲素蛋白復(fù)合粉體；(5)向上述所得的羥基磷灰石/絲素蛋白復(fù)合粉體中加入無水乙醇，攪拌成糊狀，得羥基磷灰石/絲素蛋白無水乙醇膠體，其中，羥基磷灰石/絲素蛋白復(fù)合粉體與無水乙醇的質(zhì)量比為1 (0. 5 2)；(6)按最終產(chǎn)物中HA SF CS = (60 80) (10 20) (10 20)的比例稱取殼聚糖，按照殼聚糖乙酸溶液質(zhì)量比1 (15 20)將其溶解于乙酸濃度為0.01 0. 04g/mL的乙酸溶液中；(7)將上述配置好的殼聚糖乙酸溶液加入到步驟(5)中的羥基磷灰石/絲素蛋白無水乙醇膠體中，攪拌，超聲分散，得到均勻的復(fù)合溶膠；(8)按質(zhì)量比(羥基磷灰石+絲素蛋白+殼聚糖)氯化鈉=1 (0.5 幻，(絲素蛋白+殼聚糖)京尼平=1 (10 50)的比例，將粒徑為150 250 μ m的氯化鈉顆粒以及京尼平加入到上述復(fù)合溶膠中，攪拌、注模，室溫下靜置10 Mh，然后置于真空干燥箱中干燥，得復(fù)合材料；(9)將所得復(fù)合材料脫模后，室溫下置于去離子水中浸泡1 4h，然后真空干燥；重復(fù)該步驟3 5次，然后將氯化鈉顆粒浙濾干凈，即得到羥基磷灰石基生物復(fù)合支架。
3.一種由權(quán)利要求1所述的羥基磷灰石基生物復(fù)合支架構(gòu)建的組織工程骨，其特征在于是由轉(zhuǎn)染VEGF基因的BMSCs植入羥基磷灰石基生物復(fù)合支架上構(gòu)建而成的。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種羥基磷灰石基生物復(fù)合支架，是由羥基磷灰石、絲素蛋白和殼聚糖構(gòu)成的，其中，各組分的質(zhì)量比為HA∶SF∶CS＝(60～80)∶(10～20)∶(10～20)，復(fù)合支架呈多孔狀，孔隙率為70～90％，孔徑尺寸150～200μm，以圓形為主，孔與孔之間相互貫通。本發(fā)明還公開了一種由羥基磷灰石基生物復(fù)合支架構(gòu)建的組織工程骨，是由轉(zhuǎn)染VEGF基因的BMSCs植入羥基磷灰石基生物復(fù)合支架上構(gòu)建而成的。本發(fā)明以羥基磷灰石、絲素蛋白和殼聚糖為原料，采用粒子瀝濾結(jié)合真空干燥工藝制備羥基磷灰石基生物復(fù)合支架材料，通過調(diào)節(jié)各組員比例調(diào)節(jié)支架的降解速率，通過調(diào)節(jié)氯化鈉顆粒的半徑及加入量控制復(fù)合材料內(nèi)孔徑分布。
文檔編號A61L27/54GK102302804SQ201110260650
公開日2012年1月4日 申請日期2011年9月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月5日
發(fā)明者盧志華, 趙冬梅 申請人:濟(jì)寧學(xué)院