專利名稱：從豬血中提取具有刺激細胞呼吸活性作用物質(zhì)的方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種從血液中提取刺激細胞呼吸活性作用物質(zhì)的方法，尤其涉及一種采用超濾等生物技術(shù)手段從豬血中提取促進細胞對氧和葡萄糖的攝取和利用物質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
豬血去蛋白提取物是以豬血液為原料制備的小分子(分子量＜6000D)肽、核苷酸和寡糖類物質(zhì)。其主要藥理作用是促進細胞對氧和葡萄糖的攝取和利用，使細胞中葡萄糖的無氧代謝轉(zhuǎn)向有氧代謝，促使能量物質(zhì)生成增多，延長細胞生存時間，促進組織細胞代謝及功能恢復和組織修復。
目前，國內(nèi)外尚未有關于從豬血中提取具有刺激細胞呼吸活性作用物質(zhì)的方法及相關產(chǎn)品的報道。
中國專利(專利號為96120777.9)公開了一種提取小牛血去蛋白提取物的方法，此方法采用乙醇為溶媒去蛋白，然后去除溶媒，這種方法使提取的物質(zhì)的活性損失，并且還存在處理量低、生產(chǎn)周期長、產(chǎn)量和收率低等問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種有效方法——可以從豬血中提取具有刺激細胞呼吸活性作用物質(zhì)的方法，該方法解決了目前相關技術(shù)上存在的處理量低、生產(chǎn)周期長、產(chǎn)量收率低以及活性損失較高等問題，而且應用該方法從豬血中提取的產(chǎn)品相對于傳統(tǒng)工藝的小牛血提取物具有更高的生物活性。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的
一種從豬血中提取具有刺激細胞呼吸活性作用物質(zhì)的方法，包括下述步驟①取非傳染區(qū)經(jīng)檢驗合格的健康豬，采用無菌動脈采血方法采血，在采集過程中或采集后2小時內(nèi)，用已消毒滅菌的棒狀器具進行攪拌，使纖維蛋白吸附在無菌的棒狀器具上，并將纖維蛋白除去，以避免出現(xiàn)凝血，得到去纖維蛋白豬血；②將去纖維蛋白豬血在-20℃～30℃下反復凍融，于低溫(0～8℃)條件下的膠體磨中反復勻漿，顯微鏡下檢查細胞基本破碎，得勻漿液；③將勻漿液過濾，用不同截留分子量超濾膜分級超濾，超濾最終截留分子量＜6000D，得豬血去纖維蛋白提取物超濾液，此超濾液經(jīng)低溫減壓濃縮和病毒滅活后得豬血去蛋白提取物。
所述的步驟②為將去纖維蛋白豬血在-20℃～40℃下反復凍融2～4次，于0～8℃條件下的膠體磨中勻漿2分鐘，重復3次，在顯微鏡下檢查細胞基本破碎，得勻漿液。
所述的步驟③為取勻漿液于4000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘后，棄去沉淀，取上清液，用截留分子量100000D的超濾膜超濾，得濾液A；取濾液A，用截留分子量30000D的超濾膜超濾，得濾液B；將濾液B用截留分子量10000D的超濾膜超濾得超濾液C；取超濾液C，用截留分子量6000D的超濾膜超濾，得超濾液D；將超濾液D經(jīng)低溫(25℃)減壓濃縮5～8倍(至總固體含量40mg/ml以上)，得濃縮液；并將濃縮液除菌過濾，在55～65℃下進行病毒滅活10～15小時；將檢驗合格的濃縮液分裝于一次性使用塑料輸液袋中，低溫(-18℃±2℃)貯存，即得豬血去蛋白提取物。
本發(fā)明的優(yōu)點和效果如下1.采用生物技術(shù)及分級超濾手段在本產(chǎn)品的制造工藝中，首次采用分級超濾手段。超濾膜分離技術(shù)作為二十一世紀六大高新技術(shù)之一，以其常溫低壓下操作、無相變、能耗低等顯著特點已成為一種分離過程的標準方法，在歐美等發(fā)達國家和地區(qū)得到了廣泛的使用，超濾膜分離過程具有以下幾個顯著特點①在常溫和低壓下進行分離，因而能耗低，因此設備的運行費用低。
②設備體積小、結(jié)構(gòu)簡單，故投資費用低。
③超濾分離過程只需簡單的加壓輸送液體，工藝流程簡單，易于操作管理。
④超濾分離過程中的超濾膜是由高分子材料制成的均勻連續(xù)體，該過程屬于純物理方法過濾，物質(zhì)在分離過程中不發(fā)生質(zhì)的變化，并且超濾膜在使用過程中不會有任何雜質(zhì)脫落，保證超濾液的純凈。
采用分級超濾技術(shù)手段，使本品中活性物質(zhì)的活性狀態(tài)保持良好；不經(jīng)過除溶媒過程，提高產(chǎn)品質(zhì)量和收率；可進行工業(yè)規(guī)?；a(chǎn)，生產(chǎn)周期短、成本低。
2.以豬血為原料提取其中具有刺激細胞呼吸活性作用的物質(zhì)目前國內(nèi)外同類產(chǎn)品(包括奧地利的“愛維治”、瑞士的“素高捷療”；國內(nèi)已批準上市的“愛維治”仿制品“奧德金”等)均以小牛血為原料。但現(xiàn)今由于瘋牛病的肆虐，世界衛(wèi)生組織嚴格限制使用牛血原料產(chǎn)品，并且廣大民眾對牛血生物制品也產(chǎn)生一種恐慌心理。目前，中國也嚴格限制牛資源制品，尤其是西方國家的食品和藥品的進口。因此，不遠的將來，此類品種在臨床應用上將受到廣泛的限制。所以，有必要尋求新的原料來源以替代小牛血生產(chǎn)具有相同功能的生化藥物。
由于上述原因，考慮到該類產(chǎn)品的原料問題，為了控制瘋牛病可能對人類健康造成的不良影響，本發(fā)明研制出一種“豬血去蛋白提取物”。實驗結(jié)果表明豬血去蛋白提取物的有效成份類似于小牛血去蛋白提取物，其比活性略高于小牛血去蛋白提取物，并且，該品種易提取，收率高，成本低，更易于規(guī)?；a(chǎn)。由于豬血去蛋白提取物原料來源安全，有效成分清楚，作用機理明確，必將替代或大部分替代牛血來源的同類產(chǎn)品，應用本發(fā)明工藝提取豬血活性物質(zhì)與應用傳統(tǒng)工藝提取小牛血活性物質(zhì)的對比，結(jié)果見下表

具體實施方式
實施例一①取非傳染區(qū)經(jīng)檢驗合格出生5個月的健康豬，采用無菌動脈采血方法采血。在采集過程中或采集后2小時內(nèi)，不斷用已消毒滅菌的棒狀器具(木棒或玻璃棒等)進行攪拌，使纖維蛋白吸附在無菌的棒狀器具上，除去纖維蛋白，以避免出現(xiàn)凝血，得到去纖維蛋白豬血。
②將去纖維蛋白豬血在-20℃冷凍，30℃下融化，反復3次，于低溫0℃或4℃或8℃條件下的膠體磨中反復勻漿，顯微鏡下檢查細胞基本破碎，得勻漿液。
③將勻漿液過濾，用不同截留分子量的超濾膜分級超濾，超濾最終截留分子量＜6000D，得豬血去纖維蛋白提取物超濾液，此超濾液經(jīng)低溫減壓濃縮及病毒滅活后得豬血去蛋白提取物。
實施例二①取非傳染區(qū)經(jīng)檢驗合格出生6個月的健康豬，采用無菌動脈采血方法采血。在采集過程中或采集后2小時內(nèi)，不斷用已消毒滅菌的棒狀器具(木棒或玻璃棒等)進行攪拌，使纖維蛋白吸附在無菌的棒狀器具上，除去纖維蛋白，以避免出現(xiàn)凝血，得到去纖維蛋白豬血。
②將去纖維蛋白豬血在-20℃冷凍，20℃下融化，反復3次，于低溫4℃或8℃條件下的膠體磨中反復勻漿，顯微鏡檢查細胞基本破碎，得勻漿液。
③將勻漿液過濾，用不同截留分子量的超濾膜分級超濾，超濾最終截留分子量＜6000D，得豬血去纖維蛋白提取物超濾液，此超濾液經(jīng)低溫減壓濃縮及病毒滅活后得豬血去蛋白提取物。
實施例三①取非傳染區(qū)經(jīng)檢驗合格出生3個月的健康豬，采用無菌動脈采血方法采血。在采集過程中或采集后2小時內(nèi)，不斷用表面已消毒滅菌的棒狀器具(木棒或玻璃棒等)進行攪拌，使纖維蛋白吸附在無菌的棒狀器具上，除去纖維蛋白，以避免出現(xiàn)凝血，得到去纖維蛋白豬血。
②將去纖維蛋白豬血在-15℃冷凍，40℃下融化，反復3次，于低溫1℃或3℃條件下的膠體磨中反復勻漿，顯微鏡檢查細胞基本破碎，得勻漿液。
③將勻漿液過濾，用不同截留分子量的超濾膜分級超濾，最終截留分子量＜6000D，得豬血去纖維蛋白提取物超濾液，此超濾液經(jīng)低溫減壓濃縮及病毒滅活后得豬血去蛋白提取物。
實施例四①取非傳染區(qū)經(jīng)檢驗合格出生4個月的健康豬，采用無菌動脈采血方法采血，收集在180℃干烤滅菌的不銹鋼桶內(nèi)。在采集過程中或采集后2小時內(nèi)，不斷用已消毒滅菌的棒狀器具(木棒或玻璃棒等)進行攪拌，使纖維蛋白吸附在器具上，除去纖維蛋白以避免出現(xiàn)凝血，得到去纖維蛋白豬血。
②將去纖維蛋白豬血在-20℃冷凍，40℃下融化，反復4次，于3～5℃條件下的膠體磨中勻漿2分鐘，重復3次，顯微鏡檢查細胞基本破碎，得勻漿液。
③取勻漿液于4000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘，棄沉淀；取上清液，用截留分子量100000D的超濾膜超濾，得濾液A；將濾液A用截留分子量30000D的超濾膜超濾，得濾液B；將濾液B用截留分子量10000D的超濾膜超濾，得超濾液C；取超濾液C，用截留分子量6000D的超濾膜超濾，得超濾液D；將超濾液D經(jīng)低溫(25℃)減壓濃縮8倍(至總固體含量40mg/ml以上)，得濃縮液；將濃縮液除菌過濾，并在60℃條件下進行病毒滅活12小時左右；將檢驗合格的濃縮液分裝于一次性使用塑料輸液袋中，低溫-20℃貯存，即得豬血去蛋白提取物。
實施例五①取非傳染區(qū)經(jīng)檢驗合格出生2個月的健康豬，采用無菌動脈采血方法采血，收集在180℃干烤滅菌的不銹鋼桶內(nèi)。在采集過程中或采集后2小時內(nèi)，不斷用已消毒滅菌的棒狀器具(木棒或玻璃棒等)進行攪拌，使纖維蛋白吸附在器具上，除去纖維蛋白以避免出現(xiàn)凝血，得到去纖維蛋白豬血。
②將去纖維蛋白豬血在-5℃下冷凍，20℃下融化，反復凍融2次，于0～5℃條件下的膠體磨中勻漿2分鐘，重復3次，在顯微鏡下檢查細胞基本破碎，得勻漿液。
③取勻漿液經(jīng)4000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘后，棄沉淀；取上清液，用截留分子量100000D的超濾膜超濾，得濾液A；將濾液A用截留分子量30000D的超濾膜超濾，得濾液B；將濾液B用截留分子量10000D的超濾膜超濾，得超濾液C；取超濾液C，用截留分子量6000D的超濾膜超濾，得超濾液D；將超濾液D，經(jīng)低溫20℃減壓濃縮6倍(至總固體含量40mg/ml以上)，得濃縮液；將濃縮液除菌過濾，并在65℃下進行病毒滅活15小時左右；將檢驗合格的濃縮液分裝于一次性使用塑料輸液袋中，-18℃±2℃貯存，即得豬血去蛋白提取物。
實施例六①取非傳染區(qū)經(jīng)檢驗合格出生6個月以內(nèi)的健康豬，采用無菌動脈采血方法采血，收集在180℃干烤滅菌的不銹鋼桶內(nèi)。在采集過程中或采集后2小時內(nèi)，不斷用已消毒滅菌的棒狀器具(木棒或玻璃棒等)進行攪拌，使纖維蛋白吸附在器具上，除去纖維蛋白以避免出現(xiàn)凝血，得到去纖維蛋白豬血。
②將去纖維蛋白豬血在-20℃下冷凍，10℃下融化，反復凍融4次，于0～8℃條件下的膠體磨中勻漿2分鐘，重復3次，在顯微鏡下檢查細胞基本破碎，得勻漿液。
③取勻漿液經(jīng)4000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘后，棄沉淀；取上清液，用截留分子量100000D的超濾膜超濾，得濾液A；將濾液A用截留分子量30000D的超濾膜超濾，得濾液B；將濾液B用截留分子量10000D的超濾膜超濾得超濾液C；取超濾液C，用截留分子量6000D的超濾膜超濾，得超濾液D；將超濾液D經(jīng)25℃減壓濃縮5倍，至總固體含量40mg/ml以上，得濃縮液；將濃縮液除菌過濾，并在55℃條件下進行病毒滅活10小時；將檢驗合格的濃縮液分裝于一次性使用塑料輸液袋中，-18℃±2℃貯存，即得豬血去蛋白提取物。
使用本發(fā)明提供的上述方法取得的豬血去蛋白提取物性狀為淡黃色澄明液體，其檢測情況如下[檢查]pH值應為6.5～7.5(中國藥典2000年版二部附錄VIH)吸收度420nm波長處的吸收度小于0.25(中國藥典2000年版二部附錄IVA)蛋白質(zhì)陰性細菌內(nèi)毒素每1ml中含細菌內(nèi)毒素量應小于1EU(中國藥典2000年版二部附錄XIE)照高效液相色譜法(中國藥典2000年版二部附錄VD)測定大分子量物質(zhì)。用凝膠色譜柱(如Pharmarcia Superdex Peptide或TSKG2000SW柱)，乙腈-三氟醋酸-水(40∶0.1∶60)為流動相，檢測波長為214nm，按面積歸一化法計算，含高分子量物質(zhì)(分子量＞5800D)的量不得超過2.0％。
采用瓦氏呼吸檢壓儀測定豚鼠肝勻漿的呼吸活力，從測得的耗氧量計算出呼吸活力QO2為4.0～6.0μlO2/mg·h；刺激指數(shù)(SI)為2.5～4.0。
(1)總固體量，精密量取2ml，置稱量瓶中，在55℃下真空干燥至恒重，每1ml中應含固型物為38～60mg。
(2)采用中國生物制品規(guī)程附錄蛋白質(zhì)含量測定法，測定本發(fā)明中產(chǎn)品的多肽含量，每1ml應為0.90～1.5mg。
(3)游離氨基酸含量，用高效液相進行氨基酸分析，游離氨基酸含量每1ml應不少于1.0～1.5mg。
權(quán)利要求
1.一種從豬血中提取具有刺激細胞呼吸活性作用物質(zhì)的方法，包括以下步驟①取非傳染區(qū)經(jīng)檢驗合格的健康豬，采用無菌動脈采血方法采血，在采集過程中或采集后2小時內(nèi)，不斷用已消毒滅菌的棒狀器具進行攪拌，使纖維蛋白吸附在無菌的器具上，除去纖維蛋白以避免出現(xiàn)凝血，得到去纖維蛋白豬血；②將去纖維蛋白豬血在-20℃～40℃下反復凍融，于0～8℃條件下的膠體磨中反復勻漿，顯微鏡下檢查細胞基本破碎，得勻漿液；③將勻漿液過濾，用不同截留分子量的超濾膜分級超濾，超濾后最終截留分子量＜6000D，得豬血去纖維蛋白提取物超濾液，此超濾液經(jīng)低溫減壓濃縮及病毒滅活后得豬血去蛋白提取物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從豬血中提取具有刺激細胞呼吸活性作用物質(zhì)的方法，其特征在于所述的步驟②為將去纖維蛋白豬血在-20℃～40℃下反復凍融2～4次，于0～8℃條件下的膠體磨中勻漿2分鐘，重復3次，在顯微鏡下檢查細胞基本破碎，得勻漿液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從豬血中提取具有刺激細胞呼吸活性作用物質(zhì)的方法，其特征在于所述的步驟③為取勻漿液經(jīng)4000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘后，棄沉淀；取上清液，用截留分子量100000D的超濾膜超濾，得濾液A；取濾液A，用截留分子量30000D的超濾膜超濾，得濾液B；將濾液B用截留分子量10000D的超濾膜超濾得超濾液C；取超濾液C，用截留分子量6000D的超濾膜超濾，得超濾液D；將超濾液D經(jīng)低溫(25℃)減壓濃縮5～8倍，至總固體含量40mg/ml以上；將濃縮液在55～65℃下進行病毒滅活10～15小時；將檢驗合格的濃縮液分裝于一次性使用塑料輸液袋中，-18℃±2℃貯存，即得豬血去蛋白提取物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從豬血中提取具有刺激細胞呼吸活性作用物質(zhì)的方法，它包括下述步驟取健康豬，采用無菌動脈采集方法采血，不斷用已消毒滅菌的棒狀器具進行攪拌，使纖維蛋白吸附在無菌的器具上，除去纖維蛋白得到去纖維蛋白豬血；－20℃～40℃下反復凍融，于0～8℃條件下的膠體磨中反復勻漿，得勻漿液；將勻漿液過濾，用不同截留分子量的超濾膜分級超濾，得豬血去纖維蛋白提取物超濾液，此超濾液經(jīng)低溫減壓濃縮及病毒滅活后得豬血去蛋白提取物。該方法所用設備體積小、結(jié)構(gòu)簡單，投資費用低；制備的活性物質(zhì)活性狀態(tài)保持良好且活性較高，不經(jīng)過除溶媒過程，提高產(chǎn)品質(zhì)量和收率；可進行工業(yè)規(guī)模化生產(chǎn)，生產(chǎn)周期短、成本低。
文檔編號A61K35/14GK1698652SQ200510046289
公開日2005年11月23日 申請日期2005年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月20日
發(fā)明者王光, 李莉, 史曉丹, 馬骉 申請人:沈陽斯佳科技發(fā)展有限公司