專利名稱：原花青素在制備治療結(jié)腸炎藥物的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及一種原花青素在制備治療結(jié)腸炎藥物的用途。尤其涉及原花青素在制備治療潰瘍性結(jié)腸炎藥物的用途。
背景技術(shù)：
慢性非細菌結(jié)腸炎等炎癥性腸病屬難治病、多發(fā)病。潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)之一，于1875年由Wilks首先描述為不同于細菌性痢疾的獨立的結(jié)腸炎癥性疾病，1920年被醫(yī)學(xué)界所公認，1956年我國首次報告國內(nèi)病例。它是一種原因不明的非特異性的炎癥性腸病，病變主要位于結(jié)腸的粘膜層，且以潰瘍?yōu)橹?，多累及直腸和遠端結(jié)腸，但可向近端擴展，以至遍及整個結(jié)腸。組織學(xué)在活動期表現(xiàn)為腸粘膜充血水腫，淋巴細胞、中性粒細胞和單核細胞浸潤，隱窩膿腫以及潰瘍形成；長期病變可見腺體結(jié)構(gòu)紊亂、腺體萎縮以及粘膜面呈絨毛樣外觀。臨床主要癥狀有腹瀉、膿血便、腹痛和里急后重等。病程漫長，病情輕重不一，常反復(fù)發(fā)作，并與結(jié)腸癌的發(fā)病存在一定的關(guān)系。本病可見于任何年齡，但以20-30歲最多見，男性稍多于女性。
現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對潰瘍性結(jié)腸炎病理機制的研究認為，主要與遺傳因素、微生物因素、環(huán)境因素、免疫因素等有關(guān)。
潰瘍性結(jié)腸炎是一種病因病理不太明確的炎癥性腸病。在各種潰瘍性結(jié)腸炎疾病發(fā)生的學(xué)說中，大量的實驗和臨床研究傾向于支持潰瘍性結(jié)腸炎是由某種細菌抗原而引起免疫失調(diào)的炎癥性腸疾病。免疫失調(diào)導(dǎo)致各種細胞因子、活性氧和活性氮的持續(xù)過量生成，從而使結(jié)腸損傷和功能紊亂?；谶@種假說，目前潰瘍性結(jié)腸炎的治療措施主要集中在抗炎藥物，如氨基水楊酸類和皮質(zhì)甾醇類藥物。但是這些藥物由于副作用較大，使得潰瘍性結(jié)腸炎患者難以耐受，如糖皮質(zhì)激素的長期使用，盡管抑制了炎癥的發(fā)生，但是潰瘍性結(jié)腸炎的復(fù)發(fā)率高，容易出現(xiàn)患者難以忍受的毒性作用。另外，免疫抑制劑6-巰基嘌呤和硫唑嘌呤對于相當(dāng)一部分患者也難以耐受。在治療中使用消炎痛和非甾體類抗炎藥治療潰瘍性結(jié)腸炎無效。所以，迫切需要尋找一種療效高、副作用低的潰瘍性結(jié)腸炎治療藥物。
原花青素(英文名稱proanthocynidins，縮寫PA)，在英文中有以下幾種名稱proanthocynidins，condensed tannins，procyanidins，leucoanthocyanins，oligomericproanthocyanidins(OPCs)，procyanidolic oligomers(PCOs)，pycnogenols。
Proanthocynidins在植物化學(xué)的分類中稱為“原花色甙元類”，是指由黃烷單體通過C-C鍵和C-O酯鍵連接成的聚合黃酮類化合物。在可食用植物中，黃烷單體之間主要通過C4-C6，或C4-C8，或C4-C8和C2-O-C7連接聚合，平均聚合度一般在3到11之間，聚合度最高可達17。它在自然界中的存在結(jié)構(gòu)形態(tài)目前已發(fā)現(xiàn)有15種，與人類植物來源的食物有密切聯(lián)系的有3種原花青素類(procyanidins)，原翠雀素類(prodelephinidins)，原花葵素類(propelargonidins)。
原花青素化學(xué)結(jié)構(gòu)通式為 Procyanidin B1R′＝OH，R＝HProcvanidin B2R′＝H，R＝OH Procyanidin B3R′＝OH，R＝HProcyanidin B4R′＝H，R＝OH原花青素是多種植物中富含的植物多酚類化合物。對原花青素的研究已有40年的歷史。由于其獨特的生理保健功能，近20年來倍受人們的關(guān)注。原花青素在許多食物如各種水果，豆類種子，巧克力等和飲料如果汁，葡萄酒，啤酒，蘋果酒，茶等中廣泛存在。國外關(guān)于原花青素的生物活性研究較多，由于其極強的抗氧化活性，原花青素成為近年在抗癌、抗炎、抗微生物和保護心血管等方面研究的熱點，它對于各種疾病是一種極具潛力的治療藥物。
原花青素可使啤酒酵母S288C菌株線粒體的自發(fā)性基因突變比對照組減少，提示原花青素具有天然的抗誘變特性，具體機制不明。體外研究發(fā)現(xiàn)原花青素對某些癌細胞具有選擇性的細胞毒性而對正常的人結(jié)腸粘膜細胞和巨噬細胞沒有毒性。在小鼠體外的皮膚腫瘤動物模型的研究中證實原花青素抑制腫瘤發(fā)生的兩種標(biāo)記物鳥氨酸脫羧酶(ODC)和髓性過氧物酶(MPO)的表達。飲含有原花青素的紅酒后，原花青素在人體內(nèi)通過降低低密度脂蛋白的脂質(zhì)過氧化和增加自由基的誘捕能力顯示了其抗氧化活性的機制。
原花青素的研究主要以治療血管疾病，外周血管功能不全和淋巴水腫。因為原花青素對于血管壁、皮膚的表皮、胃腸粘膜的良好親和力，研究的熱點集中在影響這些組織的疾病方面。歐洲人用原花青素來治療各種血管疾病，包括靜脈曲張、靜脈功能不全、毛細血管脆性增加和視網(wǎng)膜血管疾病等。其臨床試驗已證實原花青素在治療血管疾病方面有良好作用。
原花青素的抗癌功效國外已有研究報道，但大多是體外研究，認為原花青素可以減輕化療藥物對于正常人細胞的細胞毒性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于避免現(xiàn)有技術(shù)的不足之處而提供一種原花青素在制備治療結(jié)腸炎藥物的應(yīng)用。
本發(fā)明的目的通過試驗說明原花青素在制備治療結(jié)腸炎藥物的應(yīng)用。
所述的原花青素在制備治療結(jié)腸炎藥物的應(yīng)用是原花青素在制備治療潰瘍性結(jié)腸炎藥物的應(yīng)用。
所述的原花青素在制備治療結(jié)腸炎藥物的應(yīng)用是原花青素在制備治療非細菌性慢性結(jié)腸炎藥物的應(yīng)用。
所述的原花青素在制備治療結(jié)腸炎藥物的應(yīng)用是原花青素口服制劑在制備治療潰瘍性結(jié)腸炎藥物的應(yīng)用。
所述的原花青素在制備治療結(jié)腸炎藥物的應(yīng)用，其特征是所述的口服制劑為為膠囊、微囊、脂質(zhì)體、顆粒劑、片劑、口服液。
原花青素包括從天然植物葡萄籽或松樹皮或可可提取的及人工合成的單體及低聚體。
發(fā)明人采用角叉菜膠誘導(dǎo)小鼠足腫模型研究原花青素的抗炎作用，并進行了灌胃(ig)給藥方式與腹腔注射(ip)給藥方式的對比。
腹腔注射(ip)給藥對角叉菜膠致小鼠足腫的影響昆明種小鼠27只，體重20±2g，隨機分為3組模型對照組、陽性對照組、原花青素組。一次給藥，原花青素ip40mg/kg，陽性對照組ip地塞米松注射液(Dex，2mg/kg)，模型對照組ip等量生理鹽水。給藥30min后，于每鼠右足跖sc(皮下注射)角叉菜膠(1％)50μl致炎，4h后處死小鼠從踝關(guān)節(jié)處對稱剪下鼠足，稱重，以左右鼠足重量差作為腫脹度，計算抑制率。
表1.原花青素ip對角叉菜膠致小鼠足腫的影響(x±s)

**P＜0.01vs對照組與對照組相比，原花青素(40mg/kg)或地塞米松注射液(2mg/kg)ip能顯著抑制角叉菜膠誘發(fā)的小鼠足腫，抑制率分別為72.0％(P＜0.01)，57.6％(P＜0.01)。
對于大鼠和小鼠肌肉內(nèi)注射，證實原花青素有明顯的抑制炎性細胞因子白介素-1和腫瘤壞死因子α生成的作用，其抗炎活性強于目前最強的抗炎藥之一地塞米松。
灌胃(ig)給藥對角叉菜膠致小鼠足腫的影響昆明種小鼠30只，體重20±2g，分組同上，ig給藥(原花青素200mg/kg水液)，給藥后1h致炎。用同樣方法對角叉菜膠所致小鼠足腫進行測定。
表2.原花青素ig對角叉菜膠致小鼠足腫的影響(x±s)

**P＜0.01vs對照組與對照組相比，Dex(2mg/kg)ig能顯著抑制角叉菜膠誘發(fā)的小鼠足腫，抑制率分別為40.1％(P＜0.01)，原花青素(200mg/kg)ig的抑制率僅為11.1％(P＞0.05)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
通過試驗，發(fā)明人注意到灌胃(ig)給藥方式與腹腔注射(ip)給藥方式結(jié)果是不一樣的。灌胃給藥的方式不能取得預(yù)期的結(jié)果，這說明原花青素在胃腸道中受各種因素被破壞，或是其分子結(jié)構(gòu)特點導(dǎo)致吸收障礙而難以經(jīng)胃腸吸收。
對原花青素的藥動學(xué)研究認為原花青素是一類具有高分子量的黃酮類化合物，分子量≥578(二聚體)。單體兒茶素(catechin，CA)、表兒茶素(epicatechin，ECA)及它們的沒食子酸酯在人類和動物體內(nèi)均可吸收。
低聚體的原花青素一般認為在腸道不吸收。Donovan JL等給大鼠一次性分別口服添加兒茶素、純原花青素二聚體B3、或葡萄籽提取物(GS，含原花青素混合物)的半純化食物。大鼠隨機分為5組對照組，CA組(20mg)，原花青素B3組(20mg)，原花青素S1組(200mg)，原花青素S2組(400mg)。200mgGS中含有CA20mg，ECA14mg，原花青素B111mg，原花青素B27mg，原花青素B33mg。GS2組中對應(yīng)成分的含量是GS1組的2倍。分別于餐后3h(小腸吸收)，9h(腸道細菌作用后大腸吸收)，24h采集血樣并收集24h的尿樣。樣品經(jīng)處理后與β-葡糖醛酸酶芳基硫酸酯酶共同孵育水解后，經(jīng)HPLC色譜分析發(fā)現(xiàn)對照組血漿中未檢測到CA、ECA和它們的甲基化形式及任何一種原花青素。CA組血漿測到了CA和3’-O-甲基CA，未發(fā)現(xiàn)4’-O-甲基CA。B3組與GS組在任一時間點均未發(fā)現(xiàn)B1、B2、B3的存在。也就是說沒有任何一種的原花青素血藥濃度超過20nmol/L。說明原花青素并不吸收進入血液循環(huán)。B3組血漿中未測到CA或3’-O-甲基CA，甚至在9h和24h接觸過腸菌的血樣中也未檢測到，因此可以判斷B3并不是血漿CA的前體。GS1、GS2組血漿中含有CA、ECA及它們的3’-O-甲基化物，色譜圖未顯示有其它黃烷醇類物質(zhì)的特征吸收，這表明血漿里沒有其它保留有黃酮環(huán)結(jié)構(gòu)的代謝物存在。CA組與GS1組含等量的CA，故血漿水平可直接比較。這兩組任一時間的CA與3’-O-甲基CA總量無明顯區(qū)別，提示GS1中沒有CA的其它前體。唯一的區(qū)別是CA組與GS組CA甲基化的比例在3h時有顯著差別(P＜0.05)，CA組55％，GS1、GS2組分別為37％、30％。9h時無明顯區(qū)別，24h時三組的血漿中只有甲基化形式存在。各組24h尿樣處理后測得的代謝物與對應(yīng)組的血漿相同。CA組與GS1組尿液中CA的排泄比例無顯著差別，也提示GS組不含有兒茶素的任何前體。GS2組與GS1組相比，CA與ECA的24h尿排量顯著降低(P＜0.05)，提示給予大劑量后會使消除減慢或吸收減少。此項研究比較了黃烷醇類單體(CA與ECA)和原花青素低聚體的吸收和代謝。血樣、尿樣中黃烷醇類的檢測限分別是20nmol/L和40nmol/L。結(jié)果表明含等量CA的兩組，CA的血漿水平是15μmol/L。在血漿和尿液中均檢測不到原花青素低聚體。GS2組中所含的原花青素低聚體量相當(dāng)高，如果吸收則血漿中很容易檢測到。因此排除了大鼠組織對原花青素B1、B2、B3極少部分吸收的可能。由此推斷原花青素二聚體在大鼠體內(nèi)不吸收。Donovan JL等的實驗結(jié)果還提示原花青素在大鼠胃、小腸或大腸中并不水解為可生物利用的單體，在口服20mg純化原花青素B3后，大鼠血漿和尿液中均未檢測到CA，含相同CA量的GS1組和CA組CA的代謝水平?jīng)]有區(qū)別，表明葡萄籽提取物中沒有CA的前體，原花青素在消化過程中，無論在胃還是大腸中，并不能裂解為可生物利用的CA。
原花青素具有極強的抗氧化、清除氧自由基作用和抗炎活性，但灌胃給藥對角叉菜膠致小鼠足腫無明顯影響，表明其生物利用度極低。原花青素藥動學(xué)研究資料證實其在胃和小腸不吸收或吸收極少，代謝途徑是在結(jié)腸內(nèi)降解。原花青素吸收代謝的特點使其可和結(jié)腸粘膜充分接觸，從而具有天然結(jié)腸靶向制劑的特征，對結(jié)腸炎尤其對潰瘍性結(jié)腸炎有良好療效。
原花青素的毒性作用，就目前的文獻資料來看，安全性較高。Ray S等對原花青素進行了急性和長期毒性試驗，通過給大鼠灌胃給藥，原花青素的半數(shù)致死量大于5000mg/kg；給小鼠每日每公斤體重500mg原花青素，6個月后，解剖檢查了小鼠的腦部、十二指腸、心臟、腎臟、肝臟、肺臟、胰腺和脾臟，血清生化無明顯變化，未發(fā)現(xiàn)原花青素的有害影響，與正常小鼠無明顯差異。
原花青素全身性毒副作用低，大鼠的慢性毒性試驗結(jié)果顯示原花青素每日每公斤體重1400-1500mg灌胃，在長達90天的時間里，也未見不良反應(yīng)。與目前治療潰瘍性結(jié)腸炎的氨基水楊酸類和皮質(zhì)甾醇類藥物相比，其療效顯著、沒有副作用，原花青素是治療潰瘍性結(jié)腸炎的一個極具潛力的藥物。為此，發(fā)明人用乙酸誘導(dǎo)大鼠潰瘍性結(jié)腸炎，以說明原花青素對結(jié)腸炎、尤其對潰瘍性結(jié)腸炎的治療作用及其效果。
本發(fā)明的有益效果(1)通過實驗證實了原花青素對實驗性結(jié)腸炎的影響。
(2)利用原花青素口服難吸收、主要進入結(jié)腸內(nèi)這一特性，結(jié)合其具有的強大的抗炎作用，充分展示了原花青素對結(jié)腸炎的治療作用，揭示了抗氧化劑對結(jié)腸炎的治療價值，立意新奇。
(3)采用形態(tài)與生化測定(MPO活性測定)相結(jié)合，定性、定量觀察藥物對潰瘍性結(jié)腸炎愈合的影響，使對藥物療效的評價更為可靠。機理研究指標(biāo)緊密結(jié)合結(jié)腸炎的已知有關(guān)病理生理機制和的原花青素抗氧化特性，如炎細胞浸潤(MPO)、氧化損傷與抗氧化能力變化(SOD、GSH-Px)、脂質(zhì)過氧化物(MDA)生成，深入、系統(tǒng)、全方位地揭示原花青素抗氧化治療與促進潰瘍性結(jié)腸炎愈合的關(guān)系，進而闡明原花青素在腸粘膜抗損傷及修復(fù)過程中的調(diào)節(jié)作用，思路獨特，構(gòu)思新穎。
(4)通過系統(tǒng)、全面研究原花青素對實驗性結(jié)腸炎的治療作用機理，揭示了抗氧化劑對結(jié)腸炎的治療作用機理，為潰瘍性結(jié)腸炎的藥物治療提供了新的思路。
具體實施例方式以下結(jié)合最佳實施例作進一步詳述實施例1原花青素治療的效果。
1.材料1.1動物Wistar大白鼠，體重260-320g，雌雄兼用，由蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供。
1.2藥物原花青素提取物尖峰天然產(chǎn)物公司，批號20010131。醋酸潑尼松西安利君制藥股份有限公司，批號0408334.1。
1.3主要試劑冰醋酸(北京化工廠，批號000108，分析純)；考馬斯亮蘭蛋白含量、髓過氧化物酶(MPO)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、及氧化型谷光甘肽過氧化物酶(GSH-PX)等試劑盒，購自南京建成生物工程研究所，試劑批號20041207。
1.4主要儀器TGL型低溫高速離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠制造；DY-2型電動玻璃勻漿機，寧波新芝生物科技股份有限公司制造；753-2型分光光度計，上海第三分析儀器廠制造；KA-1000型臺式離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠制造；SONY DSC-F717型照相機，日本制造；SPS2001F型電子天平，梅特勒-托利多(常州)稱重設(shè)備系統(tǒng)有限公司制造。
2.方法2.1分組大鼠140只，按體重隨機分為正常對照組、模型對照組、醋酸潑尼松組、原花青素肌注組和原花青素低、中、高劑量灌胃給藥組，每組20只。
2.2模型制作方法實驗前各組大鼠禁食不禁水48h。記錄體重。戊巴比妥鈉30mg/kg，ip麻醉。正常對照組將導(dǎo)管經(jīng)肛門插進8cm，注入生理鹽水1ml/只，20s后，令大鼠頭部朝下、肛門朝上，仰臥位手托20s，再注入2ml生理鹽水沖洗1次；模型對照組、Prednisone組、原花青素肌注組、低、中、高劑量原花青素灌胃給藥組將導(dǎo)管經(jīng)肛門插進8cm，注入10％乙酸1ml/只，然后同正常對照組操作。造模后，每天清洗鼠籠，用干凈且干燥的鋸末鋪墊籠底，減少因大鼠腹瀉、便血而引起的鼠籠內(nèi)污染。
2.3給藥和觀察造模24h后，正常對照組和模型對照組用生理鹽水灌胃(1ml/100g)，陽性對照組用醋酸潑尼松生理鹽水溶液灌胃(5mg/kg)，原花青素肌注組用原花青素的生理鹽水溶液大腿部肌肉注射(40mg/kg)，原花青素低、中、高劑量灌胃給藥組分別用原花青素的生理鹽水溶液按100、200、400mg/kg灌胃。每組中10只連續(xù)給藥3天，每天給藥1次，第3天給藥24h后，處死以備生化測定，剩余10只，連續(xù)給藥7天，每天給藥1次。每日觀察各組大鼠的精神活動、進食狀況和糞便狀態(tài)。
2.4取材連續(xù)給藥7天的大鼠，第7天給藥24h后，稱重記錄，頸椎脫臼法處死動物，迅速剖腹，取出肛門至盲腸末端的整個結(jié)腸和直腸段。沿腸系膜緣剪開腸腔。用生理鹽水沖洗腸內(nèi)容物。沖洗干凈后，用濾紙拭干，稱量整個腸段。然后，將整個腸段平鋪于塑料板上，大頭針固定腸段周邊，數(shù)碼相機拍照以便大體觀察評分。再留取各組大鼠結(jié)腸病變最明顯處組織若干，10％福爾馬林固定，以備制作病理切片。
生化測定用大鼠在給藥3天后處死取結(jié)腸，剖腹取出肛門至盲腸末端的整個結(jié)腸和直腸段，沿腸系膜緣剪開腸腔，用生理鹽水沖凈腸內(nèi)容物，用濾紙拭干。剪取病變組織塊，準(zhǔn)確稱重，用眼科剪剪碎，加冷生理鹽水，低溫制成10％組織勻漿。(1)測MPO活性時，再加冷生理鹽水稀釋成5％組織勻漿后測定；(2)測MDA含量時，將10％組織勻漿低溫離心后，取上清液測定；(3)測蛋白含量、SOD活性、GSH-Px活性時，稀釋成1％組織勻漿后直接測定。
2.5病理切片制作方法剪取病變最明顯處結(jié)腸組織，病變面積較大的，分段(每段1cm)編號剪切，將標(biāo)本用10％福爾馬林固定。24h后用水漂洗，逐級酒精脫水，石蠟定向包埋，切片，二甲苯透明，HE染色，中性樹脂膠封片，光鏡下觀察。
2.6結(jié)腸損傷評分結(jié)腸損傷評分的半定量標(biāo)準(zhǔn)參照Vilaseca等人的評分標(biāo)準(zhǔn)修訂而成。具體評分由病理學(xué)專業(yè)人員按表3執(zhí)行。
表3.結(jié)腸損害形態(tài)學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)

2.7生化指標(biāo)測定MPO活性測定髓性過氧化物酶(MPO)的含量變化主要反映炎癥組織內(nèi)中性粒細胞浸潤程度。每個細胞所含的酶的量是一定的，約占細胞干重的5％，該酶具有使過氧化氫還原的能力，利用這一特點可以測定酶的活力，反映組織中性粒細胞浸潤程度。原理；。通過供氫體鄰聯(lián)茴香胺供氫后生成黃色化合物，在460nm處通過比色測定A產(chǎn)物的生成量，從而推算MPO活力及H2O2減少的量，以每克組織在37℃的反應(yīng)體系中H2O2被分解1μmol為1個酶活力單位。
MDA含量測定采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法，以每毫克組織蛋白納摩爾數(shù)(nmol/mg prot)表示，即過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物丙二醛可與硫代巴比妥酸縮合，形成紅色產(chǎn)物，在532nm處有最大吸收。
SOD活性測定通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基，后者氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑的作用下呈現(xiàn)紫紅色，用可見光分光光度測其吸收度。當(dāng)被測樣品中含SOD時，則對超氧陰離子有專一性抑制作用，使形成的亞硝酸鹽減少，比色時測定管的吸光度值低于對照管的吸光度值，通過公式計算可求出被測樣品中的SOD活力。以每毫克組織蛋白在1mL反應(yīng)液中SOD抑制率達50％時所對應(yīng)的SOD量為一個SOD活力單位(U)。
GSH-Px活力測定GSH-Px可促進過氧化氫(H2O2)與還原型谷胱甘肽(GSH)反應(yīng)生成水及氧化型谷胱甘肽(GSSG)，GSH-Px的活力可用其酶促反應(yīng)的速度來表示，測定此酶促反應(yīng)中還原性谷胱甘肽的消耗量，則可求出酶的活力。GSH-Px的活力以催化GSH的反應(yīng)速度來表示。由于底物在沒有酶的條件下，也能進行氧化還原反應(yīng)(稱非酶促反應(yīng))，所以最后計算此酶活力時必須扣除非酶促反應(yīng)所引起的GSH減少部分。GSH和二硫代二硝基苯甲酸作用生成5硫代二硝基苯甲酸陰離子，呈現(xiàn)較穩(wěn)定的黃色，在412nm處測其吸光度即可計算出GSH的量。通過測定GSH的濃度即可反映出GSH-Px活性。以每毫克組織蛋白，每分鐘扣除非酶反應(yīng)的作用，使體系中GSH濃度降低1μmol/L為一個活力單位。
2.8統(tǒng)計學(xué)處理非參數(shù)檢驗用Mann-Whitney U檢驗，參數(shù)檢驗用Student’s t檢驗。
結(jié)果與分析(1)大鼠外觀體征及結(jié)腸部位的一般觀察乙酸造模的結(jié)果導(dǎo)致大鼠結(jié)腸粘膜破損，沿腸系膜方向腸壁出現(xiàn)縱向潰瘍、出血，粘膜下水腫，結(jié)腸與小腸及其它器官不同程度粘連。造模動物于第2天出現(xiàn)膿血便、消瘦、食欲減退、蜷縮、毛發(fā)無光澤、活動減少等。各給藥組動物外觀癥狀均輕于模型對照組。
Sharon P等研究認為大鼠乙酸性結(jié)腸炎模型與人的炎癥性腸病在發(fā)病機理上類似，可以用做炎癥性腸病研究的動物模型。國內(nèi)外文獻報道認為乙酸模型成功的關(guān)鍵在于掌握乙酸的濃度和作用時間。國外報道最佳致炎濃度為大鼠經(jīng)漿膜法，20％冰乙酸0.02ml；大鼠腸腔灌注法，10％冰乙酸1ml或4％冰乙酸2ml。國內(nèi)報道如豚鼠，7％冰乙酸2.5ml灌腸；大鼠15％醋酸0.2ml灌腸；5％冰乙酸1ml灌腸，間隔2天，重復(fù)進行，連續(xù)4次；10％乙酸溶液2ml灌腸，準(zhǔn)確定時15s后，再用5ml生理鹽水沖洗；8％乙酸溶液2ml灌腸，準(zhǔn)確定時20s后，再用5ml生理鹽水沖洗2次。乙酸UC模型制作方法簡便經(jīng)濟，重現(xiàn)性好，適應(yīng)性強，造模周期短，適用于急性炎癥、炎癥介質(zhì)、致炎機理及藥物抗炎機理的研究。
(2)藥物對大鼠體重變化(體重、體重指數(shù))的影響從表4可以看出，在一周的觀察時間里，正常對照組體重呈增加趨勢，平均體重增加5.54％；模型對照組體重呈明顯減輕趨勢，平均體重減輕4.09％；原花青素低、中劑量灌胃給藥組，體重減輕程度明顯小于模型對照組，平均體重減輕分別是1.43％和0.37％；陽性對照組、原花青素高劑量灌胃給藥組和原花青素肌注給藥組體重則呈明顯增加趨勢，平均體重增加分別是0.76％、1.49％和0.75％；對各組體重指數(shù)(處死前體重/造模前體重)作統(tǒng)計分析的結(jié)果顯示，模型對照組分別與正常對照組和原花青素高劑量給藥組相比P＜0.01，差別有統(tǒng)計學(xué)意義；模型對照組分別與陽性對照組、原花青素中劑量灌胃給藥組和原花青素肌注給藥組相比P＜0.05，差別有統(tǒng)計學(xué)意義。
表4.藥物對乙酸性結(jié)腸炎大鼠體重變化的影響(x±s)

注a與模型對照組相比P＜0.01，b與模型對照組相比P＜0.05.
體重指數(shù)的變化反映了造模后各組病情的恢復(fù)情況。從體重變化來看，模型對照組大鼠體重在造模一周內(nèi)，呈明顯減輕趨勢，原花青素低、中劑量灌胃給藥組，體重雖有減輕，但減輕程度明顯小于模型對照組。陽性對照組、原花青素高劑量灌胃給藥組和原花青素肌注組大鼠體重呈明顯增加趨勢。這說明原花青素在用藥后對結(jié)腸炎大鼠全身狀態(tài)有改善作用。
3藥物對大鼠結(jié)腸濕重變化的影響(結(jié)腸濕重、結(jié)腸濕重指數(shù))從表5可以看出，模一周時，各造模組與正常對照組相比結(jié)腸濕重明顯增加，模型對照組結(jié)腸濕重增重最大，結(jié)腸濕重指數(shù)(全結(jié)腸濕重重量/處死前體重)在各組中最高(與正常對照組相比P＜0.01)，其后依次是原花青素低、中劑量灌胃給藥組、原花青素肌注給藥組、陽性對照組和原花青素高劑量灌胃給藥組(各用藥組與模型對照組相比P＜0.05或P＜0.01)，陽性對照組和原花青素高劑量灌胃給藥組與模型對照組相比結(jié)腸濕重增重相對較小，但與正常對照組比結(jié)腸濕重仍有所增加。
表5.原花青素對大鼠結(jié)腸濕重變化的影響(x±s)

注a與模型對照組相比P＜0.01，b與模型對照組相比P＜0.05.
結(jié)腸濕重指數(shù)的大小在一定程度上反映了結(jié)腸炎的嚴(yán)重程度，結(jié)腸濕重指數(shù)變化的統(tǒng)計結(jié)果也顯示給藥組與模型對照組之間差別有顯著性。大體觀察評分和病理切片組織學(xué)評分的結(jié)果與體重變化、結(jié)腸濕重變化的結(jié)果一致，模型對照組大鼠結(jié)腸粘膜潰瘍、充血、壞死嚴(yán)重，而原花青素灌胃給藥組及肌注給藥組大鼠結(jié)腸粘膜潰瘍面積縮小，組織修復(fù)明顯，且有明顯的劑量依賴性。原花青素防止乙酸性結(jié)腸炎大鼠體重下降、減輕大鼠結(jié)腸重量指數(shù)、減輕大體和病理學(xué)病變，減少組織壞死和潰瘍形成、減少炎細胞浸潤，促進上皮增長和潰瘍面修復(fù)，證明原花青素對大鼠性乙酸性結(jié)腸炎有明顯的治療作用。
4大體觀察評分結(jié)果(1)大體外觀正常對照組，結(jié)腸腸管粘膜皺襞紋理清晰，未見糜爛及潰瘍，整個腸段長度平均在20cm以上；模型對照組，造模后第7天，結(jié)腸腸管變粗，個別腸腔局部膨脹增大，腸壁變薄，腸壁外周粘連嚴(yán)重，腸粘膜壞死、潰瘍形成，病變表面有黑黃色膜狀物(組織病理切片證實為壞死組織和組織滲出物)附著，其附近粘膜充血、水腫明顯，整個腸段長度明顯縮短，一般短至15cm左右，有一只因中毒性巨結(jié)腸而死亡；陽性對照組，腸管粘膜表面黑黃色膜狀物附著面積明顯縮小，偶有充血、水腫，腸壁粘連，腸壁增厚減輕，病理性膨脹和腸段縮短減輕；原花青素低劑量灌胃給藥組，腸管粘膜上有大面積黑黃色膜狀物附著，其旁粘膜充血、水腫明顯；原花青素中劑量灌胃給藥組，腸管粘膜可有散在分布小塊黑黃色膜狀物附著，其旁粘膜充血、水腫仍明顯；原花青素高劑量灌胃給藥組，腸管粘膜外觀與陽性對照組相似；原花青素肌注組，粘膜外觀與原花青素中劑量灌胃給藥組相似。
(2)大體觀察評分各組大體觀察評分結(jié)果見表6。從表6可以看出模型對照組大體評分在6分以上，評分在8-9分的動物例數(shù)占到7只，而陽性對照組，原花青素低、中、高劑量灌胃給藥組和原花青素肌注給藥組評分在7分以下的動物例數(shù)分別各占到9只、9只、8只、7只和8只，各用藥組與模型對照組用Mann-Whitney U檢驗分析比較結(jié)果顯示，低劑量灌胃給藥組與模型對照組相比P＜0.05，其它各用藥組與模型對照組相比P＜0.01。
表6.實驗各組大體觀察評分比較

注a與模型對照組相比P＜0.05，b與模型對照組相比P＜0.015.病理組織學(xué)變化評分結(jié)果鏡下一般觀察正常對照組，大鼠結(jié)腸粘膜上皮完整、連續(xù)(但不整齊)，腺體排列規(guī)則、結(jié)構(gòu)清楚、分泌功能活躍，粘膜、固有膜內(nèi)血管纖維間質(zhì)正常，肌層無異常；模型對照組，大鼠結(jié)腸粘膜可見不同程度的灶性糜爛，粘膜腺體破壞，粘膜層壞死脫落代之以大量炎癥細胞浸潤；陽性對照組，潰瘍直徑縮小，表面可見再生的粘膜上皮覆蓋，潰瘍旁上皮修復(fù)明顯，腺體增生活躍；隱窩、腸腺及間質(zhì)可見較多急慢性炎細胞浸潤；原花青素低劑量灌胃給藥組，潰瘍直徑與模型對照組相比無明顯變化，可見少許再生的粘膜上皮；原花青素中劑量灌胃給藥組，潰瘍直徑縮小，可見少許再生的粘膜上皮覆蓋；原花青素高劑量灌胃給藥組，粘膜面可見數(shù)量較多的新生腺體，有較多再生的粘膜上皮，上皮修復(fù)明顯；原花青素肌注組，潰瘍面淋巴細胞散在分布，處于增殖狀態(tài)。
病理組織學(xué)評分各組病理切片組織學(xué)評分見表7。從表7可以看出模型對照組大體評分在5分以上，評分在6分以上的動物例數(shù)為8只，而陽性對照組，原花青素低、中、高劑量灌胃給藥組和原花青素肌注給藥組評分在6分以下的動物例數(shù)分別各占到10只、10只、9只、9只和9只，各用藥組與模型對照組用Mann-Whitney U檢驗分析結(jié)果顯示，原花青素低、中劑量灌胃給藥組與模型對照組相比P＜0.05，其它各用藥組與模型對照組相比P＜0.01。
表7.實驗各組病理組織學(xué)評分統(tǒng)計比較

注a與模型對照組相比P＜0.05，b與模型對照組相比P＜0.016藥物對大鼠結(jié)腸組織MPO活性的影響實驗各組大鼠結(jié)腸組織MPO活性的測定值見表8，正常對照組大鼠結(jié)腸組織MPO活性在各組中最低。模型對照組MPO活性在各組中最高，隨原花青素灌胃給藥劑量的增加，病變結(jié)腸組織中MPO活性逐漸減低。陽性對照組和原花青素肌注給藥組大鼠結(jié)腸組織MPO活性介于原花青素中、高劑量灌胃給藥組之間。各用藥組MPO活性高于正常對照組，但明顯低于模型對照組，低、中劑量灌胃給藥組的MPO活性與模型對照組相比，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，其它各用藥組的MPO活性與模型對照組相比有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01)。
表8.藥物對大鼠結(jié)腸組織MDA含量及MPO、SOD和GSH-Px活性的影響(x±s)

注與模型對照組相比*P＜0.05，**P＜0.01；與正常對照組相比◇◇P＜0.01
在腸炎的發(fā)生過程中，一般都伴隨著中性粒細胞的浸潤，受到炎癥信號刺激的中性粒細胞釋放溶酶體酶等，產(chǎn)生超氧化物及其它過氧化物，造成細胞損傷，因此中性粒細胞是炎癥反應(yīng)可溶性介質(zhì)的主要來源。髓性過氧化物酶(myeloperioxidase，MPO)是主要存在于中性粒細胞嗜天青顆粒中的一種酶(在單核和巨噬細胞中也有少量存在)，作為評價炎癥嚴(yán)重程度的指標(biāo)在國外已頗常應(yīng)用，其含量的增高可以反映中性粒細胞在某一組織中的增多，間接反映炎細胞浸潤程度及炎癥的存在。因此，凡是存在中性粒細胞浸潤的組織，都可以通過MPO活性測定來判定炎細胞浸潤程度。對乙酸性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸組織MPO活性測定結(jié)果顯示，各用藥組結(jié)腸組織MPO活性明顯低于模型對照組，這說明原花青素能減輕中性粒細胞浸潤，減輕結(jié)腸炎癥程度，這是其粘膜保護作用機理之一。但是，各用藥組與正常對照組比較，MPO活性仍然較高，說明原花青素不能完全消除乙酸誘導(dǎo)的結(jié)腸炎癥。原花青素低、中、高劑量灌胃給藥實驗結(jié)果顯示，隨著藥物劑量增大，結(jié)腸粘膜組織MPO活性降低，說明原花青素的抗炎作用有劑量依賴性。另外，原花青素高劑量灌胃組MPO活性與陽性對照組(Prednisone組)比較，差別無統(tǒng)計學(xué)意義，說明原花青素用于治療大鼠乙酸性結(jié)腸炎時可達與Prednisone作用強度相當(dāng)?shù)寞熜А?br> 7.藥物對大鼠結(jié)腸組織MDA含量的影響實驗各組大鼠結(jié)腸組織MDA含量測定結(jié)果見表8。和正常對照組比，模型對照組大鼠結(jié)腸組織MDA含量增加。原花青素各給藥組結(jié)腸組織MDA含量均較模型對照組降低，隨原花青素灌胃給藥劑量的增加，大鼠結(jié)腸組織MDA含量減少，作用呈劑量依賴性。陽性對照組和原花青素肌注給藥組的MDA含量明顯低于模型對照組，介于原花青素中、高劑量灌胃給藥組之間。各用藥組大鼠結(jié)腸組織MDA含量與模型對照組相比，差別有顯著性意義(P＜0.01)。
氧自由基(oxygen free radicals，OFR)是一類具有高度化學(xué)反應(yīng)活性的含氧基團，主要包括超氧陰離子(O2)、羥自由基(OH)等。在生理情況下，為了防御正常生命活動中產(chǎn)生的OFR對組織和細胞的損傷，機體建立了一整套完善的抗氧化防御系統(tǒng)，如超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)等，但當(dāng)OFR形成過量或抗氧化系統(tǒng)削弱，OFR可引起機體一系列損傷，其中最重要的是觸發(fā)細胞膜上的多不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，產(chǎn)生丙二醛(malondialdehyde，MDA)等脂質(zhì)過氧化物，使組織損害進一步加重。由于臨床上直接測定OFR十分困難，目前人們大多采用檢測MDA和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)過程中產(chǎn)生的呼氣乙烷的濃度來間接反映UC腸粘膜中OFR的水平。
本發(fā)明人測定了結(jié)腸粘膜MDA產(chǎn)生量、SOD和GSH-Px的活性。MDA含量水平不僅間接反映OFR生成的多少，同時也是OFR觸發(fā)生物膜脂質(zhì)過氧化的直接證據(jù)和膜結(jié)構(gòu)受損程度的指標(biāo)。結(jié)果顯示，模型對照組大鼠結(jié)腸組織MDA含量明顯升高，各用藥組的MDA含量明顯降低，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，與模型對照組比較均有統(tǒng)計學(xué)差異，表明大鼠乙酸性結(jié)腸炎模型脂質(zhì)過氧化作用增強，清除OFR能力下降，而PA對大鼠乙酸性結(jié)腸炎模型結(jié)腸粘膜炎癥和潰瘍的治療作用機制之一可能是清除了OFR。
8.藥物對大鼠結(jié)腸結(jié)腸組織SOD、GSH-PX活性的影響實驗各組大鼠結(jié)腸組織SOD活性和GSH-Px活性測定值見表8。正常對照組大鼠結(jié)腸組織SOD活性和GSH-Px活性最高，模型對照組大鼠結(jié)腸組織SOD活性和GSH-Px活性最低。隨PA灌胃給藥劑量的增加，大鼠結(jié)腸組織SOD活性和GSH-Px活性也增加，作用呈劑量依賴性。陽性對照組和原花青素肌注給藥組的SOD活性和GSH-Px活性介于原花青素中、高劑量灌胃給藥組之間，明顯高于模型對照組。原花青素各灌胃給藥組、肌注組和陽性對照組大鼠結(jié)腸組織GSH-Px活性和SOD活性與模型對照組比，差別均有統(tǒng)計學(xué)意義。但各用藥組與正常對照組比較，SOD活性和GSH-Px活性仍然低于正常對照組。
實驗結(jié)果顯示各用藥組結(jié)腸粘膜SOD、GSH-Px活性高于模型對照組，但低于正常對照組。這說明結(jié)腸粘膜急性炎癥時SOD、GSH-Px活性降低，組織抗氧化能力下降，從而導(dǎo)致氧自由基堆積，氧自由基損傷生物膜，使得MDA含量增高，而原花青素清除氧自由基，使內(nèi)源性SOD和GSH-Px損耗減少，間接使腸組織中重要的內(nèi)源性SOD和GSH-Px活性升高，提高病變結(jié)腸組織抗氧化能力，防止結(jié)腸粘膜過氧化損傷，從而起到細胞保護作用，減輕結(jié)腸粘膜損傷及炎癥。這些結(jié)果表明原花青素對大鼠乙酸性結(jié)腸炎的治療作用與其抗氧化作用有關(guān)。原花青素低、中、高劑量灌胃給藥后，隨著劑量增大，結(jié)腸粘膜組織MDA含量下降，而SOD、GSH-PX活性增大，說明原花青素的抗氧化作用有劑量依賴性。
結(jié)論1.原花青素灌胃給藥可防止乙酸性結(jié)腸炎大鼠體重下降、減輕大鼠結(jié)腸重量指數(shù)、減輕大體和病理學(xué)病變，減少組織壞死和潰瘍形成、減少炎細胞浸潤，促進上皮增生和潰瘍面修復(fù)，對大鼠乙酸性結(jié)腸炎有明顯的治療作用。
2.原花青素灌胃給藥降低大鼠乙酸性結(jié)腸炎結(jié)腸組織內(nèi)MPO活性，說明其有抑制中性粒細胞浸潤的作用，此作用是其抗炎作用之一。
3.原花青素灌胃給藥可使大鼠乙酸性結(jié)腸炎炎癥組織內(nèi)丙二醛含量下降，說明其有清除自由基、抗脂質(zhì)過氧化作用。同時能使結(jié)腸組織內(nèi)SOD活性和GSH-Px活性增加，這說明原花青素有提高結(jié)腸炎癥組織抗氧化能力的作用。
結(jié)果顯示，原花青素灌胃給藥對乙酸誘導(dǎo)的大鼠結(jié)腸炎有明顯療效，其作用機理和減少組織內(nèi)中性粒細胞浸潤、清除自由基、抗脂質(zhì)過氧化及提高組織抗氧化能力有關(guān)。
實施例2原花青素口服給藥的效果。
方法制備大鼠乙酸性結(jié)腸炎模型，分別設(shè)正常對照組、模型對照組、陽性對照組、原花青素肌肉注射組、原花青素低、中、高劑量灌胃組，共7組。每天給藥1次，共7天。于給藥8天時進行大鼠病變結(jié)腸大體及組織學(xué)評分；用鄰聯(lián)茴香胺法檢測結(jié)腸組織中MPO活性以考察中性白細胞浸潤程度；分別用亞硝酸鹽法和二硫代二硝基苯甲酸法檢測結(jié)腸組織SOD和GSH-Px活性，觀察結(jié)腸組織抗氧化能力的變化；用硫代巴比妥顯色法測定結(jié)腸組織脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量，觀察結(jié)腸組織脂質(zhì)過氧化程度。分別從整體、組織、生化水平多個層次觀察原花青素對大鼠乙酸性結(jié)腸炎的治療作用和可能的作用機制。
結(jié)果實驗一周時，模型對照組大鼠體重明顯下降，結(jié)腸濕重明顯增加，和模型對照組比，原花青素低、中劑量灌胃給藥組體重下降程度減輕(P＜0.05)，原花青素高劑量灌胃給藥組體重呈增加趨勢(P＜0.01)。原花青素各劑量灌胃給藥組結(jié)腸濕重增加幅度較模型對照組明顯降低(P＜0.05)。大體觀察，模型對照組結(jié)腸粘膜大面積潰瘍、壞死，和模型對照組比，原花青素各劑量灌胃組結(jié)腸粘膜潰瘍面積縮小，粘膜修復(fù)明顯。光鏡下觀察，模型對照組結(jié)腸粘膜組織內(nèi)可見大量炎性滲出物和組織壞死；原花青素各劑量灌胃治療組潰瘍面可見多量再生上皮和新生腺體。模型對照組結(jié)腸粘膜組織內(nèi)MPO含量較正常對照組明顯升高(P＜0.01)，原花青素各劑量灌胃給藥組MPO活性較模型對照組明顯降低(P＜0.05)。原花青素各劑量給藥組結(jié)腸粘膜組織MDA含量明顯降低，SOD和GSH-Px活性明顯升高，與模型對照組比較，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
結(jié)論原花青素對大鼠乙酸性結(jié)腸炎有明顯的治療作用，且呈劑量依賴性。其作用機制與其抗炎、抗氧化、提高組織抗氧化能力、減輕脂質(zhì)過氧化損傷及促進損傷組織的修復(fù)有關(guān)。
發(fā)明人前述的實驗證明原花青素灌胃給藥對全身性炎癥無效，該實驗對乙酸性結(jié)腸炎模型大鼠用原花青素灌胃給藥，療效明顯，說明原花青素灌胃給藥后的確未在胃及小腸中吸收，而是到達結(jié)腸部位，與結(jié)腸粘膜接觸后發(fā)揮局部抗炎作用，從而證實了原花青素是天然的結(jié)腸靶向制劑。
權(quán)利要求
1.原花青素在制備治療結(jié)腸炎藥物的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的原花青素在制備治療結(jié)腸炎藥物的應(yīng)用，其特征是原花青素在制備治療潰瘍性結(jié)腸炎藥物的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求1所述的原花青素在制備治療結(jié)腸炎藥物的應(yīng)用，其特征是原花青素在制備治療非細菌性慢性結(jié)腸炎藥物的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求1或2所述的原花青素在制備治療結(jié)腸炎藥物的應(yīng)用，其特征是原花青素口服制劑在制備治療潰瘍性結(jié)腸炎藥物的應(yīng)用。
5.如權(quán)利要求3所述的原花青素在制備治療結(jié)腸炎藥物的應(yīng)用，其特征是所述的口服制劑為為膠囊、微囊、脂質(zhì)體、顆粒劑、片劑、口服液。
6.如權(quán)利要求1-5所述的原花青素在制備治療結(jié)腸炎藥物的應(yīng)用，其特征是原花青素包括從天然植物葡萄籽或松樹皮或可可提取的及人工合成的單體及低聚體。
全文摘要
本發(fā)明主要涉及一種原花青素在制備治療結(jié)腸炎藥物的用途。尤其涉及原花青素在制備治療潰瘍性結(jié)腸炎藥物的用途。本發(fā)明通過試驗說明原花青素在制備治療結(jié)腸炎藥物的應(yīng)用。原花青素在制備治療結(jié)腸炎藥物的應(yīng)用是原花青素在制備治療潰瘍性結(jié)腸炎藥物的應(yīng)用。原花青素在制備治療結(jié)腸炎藥物的應(yīng)用是原花青素在制備治療非細菌性慢性結(jié)腸炎藥物的應(yīng)用。原花青素在制備治療結(jié)腸炎藥物的應(yīng)用是原花青素口服制劑在制備治療潰瘍性結(jié)腸炎藥物的應(yīng)用。本發(fā)明利用原花青素口服難吸收、主要進入結(jié)腸內(nèi)這一特性，結(jié)合其具有的強大的抗炎作用，充分展示了原花青素對結(jié)腸炎的治療作用，揭示了抗氧化劑對結(jié)腸炎的治療價值，立意新奇。通過系統(tǒng)、全面研究原花青素對實驗性結(jié)腸炎的治療作用機理，揭示了抗氧化劑對結(jié)腸炎的治療作用機理，為潰瘍性結(jié)腸炎的藥物治療提供了新的思路。
文檔編號A61P1/00GK1745747SQ200510042958
公開日2006年3月15日 申請日期2005年7月11日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月11日
發(fā)明者吳勇杰, 楊孝來, 王莉, 鞠洋, 李文廣, 高明堂 申請人:蘭州大學(xué)