專(zhuān)利名稱(chēng)：蕓香苷作為酪氨酸酶抑制劑的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到蕓香苷的用途，尤其涉及作為酪氨酸酶抑制劑的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
酪氨酸酶(EC I. 14. 18. I, Tyrosinase)是一種含銅的金屬酶,廣泛分布于微生物、動(dòng)植物及人體中。酪氨酸酶是皮膚色素合成中具有多重催化功能的重要的酶，該酶兼有加氧酶和氧化酶的雙重功能，在黑色素合成過(guò)程中起關(guān)鍵作用，是黑色素合成過(guò)程的限速酶。酪氨酸酶屬于第三類(lèi)銅蛋白家族(I. Yoon J, Fujii S, Solomon EI. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 Apr 21 ；106(16) :6585-6590 ;2· Li Y, Wang Y, Jiang H, Deng J. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 Oct 6 ； 106 (40) : 17002-17006.)，在活性部位 2 個(gè)銅離子分別與3個(gè)組氨酸相連，并且這2個(gè)銅離子與不同的催化反應(yīng)直接相關(guān)，如單酚羥基化為二酹(甲酹酶活性)和二酹氧化為二醌(鄰苯二酹氧化酶活性)(3. Decker, H. and Tuczek,
F.Trends Biochem. Sci. 2000 ；25 :392-397.)。酪氨酸酶的活性與黑色素合成量密切相關(guān)，在人體內(nèi)的活性增高會(huì)導(dǎo)致雀斑、黃褐斑等黑色素過(guò)度沉積疾病的發(fā)生(4. Olivares C，Solano F.Pigment Cell Melanoma Res. 2009 Dec ；22 (6) :750-760 ；5.Jimbow K, Park JS, Kato F, Hirosaki K, Toyofuku K, Hua C, Yamashita T. Pigment Cell Res. 2000Aug ； 13(4) :222-229.)。食物(果蔬、蝦蟹等)中的酪氨酸酶會(huì)引起食物加工及貯藏過(guò)程中的褐變，導(dǎo)致食物變質(zhì)(6.Kim YJ, Uyama H. Cell Mol Life Sci. 2005Aug ；62(15) 1707-1723 ；7. Rescigno A, Sollai F, Pisu B, Rinaldi A, Sanjust E. J Enzyme Inhib Med Chem. 2002Aug ； 17 (4) :207-218.)。酪氨酸酶在昆蟲(chóng)體內(nèi)也普遍存在，在昆蟲(chóng)創(chuàng)傷愈合 (8. KanostMR, Jiang H, Yu XQ. Tmmunol Rev. 2004Apr ；198 :97-105 ；9. Lai SC, Chen CC, Hou RF. J Med Entomol. 2002Mar ；39(2) :266-274.)和表皮形成(10. Guerrero,A. and Rosell,
G.Curr· Med. Chem. 2005 ; 12 :461-469.)中起重要作用。由于酪氨酸酶在醫(yī)藥、化妝品和農(nóng)業(yè)上的潛在應(yīng)用前景，其活性調(diào)控研究成為研究的焦點(diǎn)。迄今為止，已研制出多種類(lèi)型的酪氨酸酶抑制劑，可作為開(kāi)發(fā)美白劑及生物殺蟲(chóng)劑的候選。目前，已有不少來(lái)源于化學(xué)合成和天然產(chǎn)物的酪氨酸酶抑制劑作為藥品、化妝品、 食品添加劑及生物殺蟲(chóng)劑。已普遍應(yīng)用的酪氨酸酶抑制劑有氫醌、曲酸及其衍生物、壬二酸、熊果苷、黃酮類(lèi)化合物、維生素C及其衍生物、綠茶提取物、甘草提取物等。但現(xiàn)有的酪氨酸酶抑制劑在抑制效果、穩(wěn)定性或安全性等多方面存在著不同程度的缺陷，因此繼續(xù)尋找抑制效果好、安全性高、性質(zhì)穩(wěn)定的酪氨酸酶抑制劑仍然具有十分重要的意義。蕓香苷，也稱(chēng)3-蕓香糖苷-槲皮素，是一種來(lái)源于蔬菜和水果的天然物質(zhì) (11. Z. Xie, Y. Zhao, P. Chen, P. Jing, J. Yue, and L. L. Yu. J Agric Food Chem. 2011 ； 59 :3042-3049 ；12. R. Slimestad and M. Verheul.J Agric Food Chem.2011 ；59 3180-3185 ；13. S. Tong, J. Yan, G. Chen, and J. Lou. J Chromatogr Sci. 2009 ；47 :341-344 ； 14. J. Kalinova,J. Triska,and N. Vrchotova. J Agric Food Chem. 2006 ；54 :5330-5335.)。在結(jié)構(gòu)上，蕓香苷包括一個(gè)黃酮槲皮素和通過(guò)糖苷鍵連接的二糖蕓香糖。蕓香苷被用于許多復(fù)合維生素的生產(chǎn)，并可作為中草藥的有效成分(15. I. Erlund, T. Kosonen, G. Alfthan, J. Maenpaa, K. Perttunen, J. Kenraali, J. Parantainen, and A. Aro. Eur J Clin Pharmacol. 2000 ；56 :545-553 ；16. ff. Dimpfel. Phytomedicine. 2009 ； 16 :287-294.)。 蕓香苷作為生物藥物的應(yīng)用主要是由于其具有抗氧化作用，可用于治療糖尿病(17. H. D. Je, C. Y. Shin, S. Y. Park, S. H. Yim, C. Kum, I. H. Huh, J. H. Kim, and U. D. Sohn. Arch Pharm Res. 2002 ；25 184-190 ； 18.A.A. Fernandes, E. L. Novelli, K. Okoshi, M. P. Okoshi,
B.P. Di Muzio, J. F Guimaraes, and A. Fernandes Junior. Biomed Pharmacother. 2010 ； 64 :214-219.)，還具有抗炎癥(19. K. Nones, Y. E. Dommel s, S. Martel I, C. Butts, ff.
C.McNabb, Z. A. Park, S. Zhu, D. Hedderley, M. P. Barnett, and N. C. Roy. Br J Nutr. 2009 ； 101 169-181.)，抗腫瘤(20· E. Bourogaa, J. Bertrand, M. Despeaux, R. Jarraya, N. Fabre, L. Payrastre, C. Demur, J. J. Fournie, M. Damak, A. E. Feki, and C. Leuk Res. 2011 ；35 1093-1101 ；21. J. P. Lin, J. S. Yang, J. J. Lin, K. C. Lai，H. F Lu, C. Y. Ma, R, Sai-Chuen Wu, K. C. Wu, F. S. Chueh, ff. Gibson Wood, and J. G. Chung. Environ Toxicol Jan. 2011 ； 20. doi 10. 1002/tox. 20662. [Epub ahead of print])和抗血管生成的作用(22. H. Luo, B. H. Jiang, S. Μ. King, and Y. C. Chen. Nutr Cancer. 2008 ；60 :800-809.)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供蕓香苷的新用途，即作為酪氨酸酶抑制劑的新應(yīng)用。本發(fā)明所用的蕓香苷,其英文名稱(chēng)為Rutin hydrate,分子式為C27H3tlO16 · 3H20,分子量610. 52，為淡黃色或草黃色粉末，溶于二甲基亞砜和吡啶、甲酰和堿液中，常溫密封避光貯存，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下所示蕓香苷為商品化物質(zhì)，可以從Sigma等試劑公司直接購(gòu)買(mǎi)到。酪氨酸酶的英文名稱(chēng)為T(mén)yrosinase，分子量為128X IO3道爾頓，為凍干粉末，購(gòu)于Sigma公司。以L(fǎng)-3,4- 二輕基苯丙氨酸(L-D0PA)作為底物，米用Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)作圖法測(cè)得購(gòu)買(mǎi)的酪氨酸酶的米氏常數(shù)Km = 0. 71±0. 04mM,最大反應(yīng)速度Vmax = 0. 17 ±0. OOSmr1Iiiin'為了更好的理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，下面詳細(xì)說(shuō)明蕓香苷作為酪氨酸酶抑制劑使用的機(jī)理。I.酪氨酸酶活性測(cè)定方法可通過(guò)測(cè)定酪氨酸酶的鄰苯二酚氧化酶活性來(lái)計(jì)算酪氨酸酶的活性。酪氨酸酶可催化底物L(fēng)-DOPA形成多巴醌，而多巴醌在475nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰。因此通過(guò)測(cè)定酶催化反應(yīng)體系的A475隨時(shí)間的增長(zhǎng)直線(xiàn)，該直線(xiàn)的斜率即為酪氨酸酶的活力，即以L(fǎng)-DOPA為底物通過(guò)分光光度法在波長(zhǎng)475nm處測(cè)定多巴醌的產(chǎn)生速度來(lái)計(jì)算酪氨酸酶活力的大小。 具體測(cè)定方法為=ImLL-DOPA底物體系中加入15 μ L酪氨酸酶溶液，迅速混勻，通過(guò)島津公司UV-1800紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)475nm處每分鐘吸光值變化來(lái)指示反應(yīng)速度v值，從而表征酶活性的大小。所有動(dòng)力學(xué)反應(yīng)和檢測(cè)的緩沖液均采用50mM Tris-HCl，pH8. 8。2.蕓香苷對(duì)酪氨酸酶抑制作用的測(cè)定配制50mM(毫摩爾/升)蕓香苷，用緩沖液逐級(jí)稀釋成不同濃度。將不同濃度的蕓香苷30 μ L與等體積的酪氨酸酶液混合，25°C保溫3hr后測(cè)定酶活力。測(cè)定時(shí)酪氨酸酶終濃度為2. O μ g/mL，底物L(fēng)-DOPA濃度為2mM，底物中含相應(yīng)濃度抑制劑蕓香苷。蕓香苷濃度與酪氨酸酶活力的關(guān)系如圖I所示。由圖I可知酪氨酸酶活力被蕓香苷以濃度依賴(lài)的方式顯著地抑制，酪氨酸酶活力下降一半時(shí)蕓香苷的濃度(IC5tl)為6.8±0.3mM(n = 3);當(dāng)蕓香苷濃度高于12mM時(shí)，酪氨酸酶被完全抑制。酪氨酸酶抑制劑是通過(guò)抑制酪氨酸酶活性從而抑制黑色素生成。在蕓香苷存在下進(jìn)行酪氨酸酶的活性測(cè)定，測(cè)得的多巴醌V值在475nm波長(zhǎng)處每分鐘吸光值的變化即v值顯著減小，說(shuō)明酪氨酸酶被蕓香苷抑制，這種抑制作用可導(dǎo)致黑色素生成的抑制從而起到美白等作用。由圖I可知，當(dāng)蕓香苷濃度高于12mM時(shí)酪氨酸酶活性被完全抑制，該濃度可作為酪氨酸酶抑制劑使用時(shí)的最低濃度。3.蕓香苷對(duì)酪氨酸酶的抑制為可逆的抑制作用為了判斷蕓香苷介導(dǎo)的抑制作用是否為可逆反應(yīng)，我們?cè)诜磻?yīng)體系中，加入不同濃度的蕓香苷，當(dāng)?shù)孜風(fēng)-DOPA濃度不變時(shí)，改變酪氨酸酶的加入量，測(cè)定酪氨酸酶催化底物氧化的活力隨酶量的關(guān)系。結(jié)果如圖2所示v值代表在475nm波長(zhǎng)處每分鐘吸光值的變化，[E]代表酪氨酸酶的濃度，圖2中1-5號(hào)蕓香苷的濃度分別為0，2. 5,5,7. 5和10mM， 體系中L-DOPA的終濃度為2mM。圖中直線(xiàn)均經(jīng)過(guò)坐標(biāo)軸原點(diǎn)，直線(xiàn)的斜率隨著加入蕓香苷濃度的增大而下降，證實(shí)蕓香苷對(duì)酪氨酸酶的抑制作用是一個(gè)可逆過(guò)程。4.蕓香苷和Cu2+的紫外/可見(jiàn)光掃描由于蕓香苷為多羥基的化合物，可預(yù)期其具有較強(qiáng)的銅離子螯合能力。通過(guò)紫外掃描光譜發(fā)現(xiàn)蕓香苷溶液中加入銅離子引起明顯的紅移現(xiàn)象，即峰值處波長(zhǎng)變大，如圖3 所示。這說(shuō)明蕓香苷可螯合銅離子，證實(shí)蕓香苷可在酪氨酸酶的活性位點(diǎn)直接螯合銅離子。 圖3所示曲線(xiàn)中蕓香苷的測(cè)試濃度為O. 05mM, Cu2+的測(cè)試濃度為O. 2mM。5.蕓香苷對(duì)酪氨酸酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制分析為了評(píng)估蕓香苷對(duì)酪氨酸酶抑制的類(lèi)型，用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法作圖。競(jìng)爭(zhēng)性抑制動(dòng)力學(xué)分析的Lineweaver-Burk方程如公式I和公式2所示
權(quán)利要求
1.蕓香苷作為酪氨酸酶抑制劑的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及到蕓香苷作為酪氨酸酶抑制劑的應(yīng)用。蕓香苷作為酪氨酸酶抑制劑的作用機(jī)理為蕓香苷與酪氨酸酶的結(jié)合引起了競(jìng)爭(zhēng)性抑制，但未引起三級(jí)結(jié)構(gòu)的明顯變化，蕓香苷結(jié)合殘基位于活性中心的凹陷區(qū)域，這些殘基影響蕓香苷在初始階段的對(duì)接，一個(gè)位于活性中心與3個(gè)組氨酸結(jié)合的銅離子在平衡狀態(tài)直接與蕓香苷螯合。蕓香苷作為酪氨酸酶抑制劑的進(jìn)一步研究可開(kāi)發(fā)用于皮膚黑色素生成紊亂的新型美白劑，抑制效果好，并且細(xì)胞毒性非常微小。
文檔編號(hào)A61K8/60GK102579273SQ201210017958
公開(kāi)日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月19日
發(fā)明者尹尚軍, 斯越秀, 樸龍斗, 錢(qián)國(guó)英 申請(qǐng)人:浙江萬(wàn)里學(xué)院