專利名稱：17α－二氫馬萘雌酮作為醫(yī)用抗氧化劑的用途的制作方法
背景技術(shù)：
生物學(xué)上生成的自由基與許多疾病均有連帶關(guān)系，需氧生物在有氧環(huán)境中的存活涉及這些極具活性的化學(xué)基團的生物生成與生物控制它們的能力之間復(fù)雜的相互作用(Del Maestro RF，Acta Phy ScanSuppl.492153-68(1980))，宿主生物與生物學(xué)上生成的自由基之間的這種相互作用導(dǎo)致了以生物細(xì)胞的損傷和死亡為終結(jié)的深奧的生物化學(xué)變化。自由基反應(yīng)積累的產(chǎn)物導(dǎo)致了許多疾病，這些疾病已被認(rèn)為部分地起因于增長的細(xì)胞內(nèi)自由基通量而誘發(fā)的細(xì)胞損傷，這些疾病包括(但不局限于)癌癥、心血管疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)紊亂、骨疾、衰老、阿爾茨海默氏癡呆、炎癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、自身免疫疾病、呼吸窘迫和肺氣腫。
自由基損害與許多疾病的聯(lián)系被廣為報道，包括酶、離子通道、結(jié)構(gòu)蛋白和膜脂質(zhì)的許多細(xì)胞成分均是活性自由基的潛在目標(biāo)(Rice-Evans C，Mol Aspects of Med 13(1)1-11(1992))，處于合適位點的抗氧化劑會限制該損害，與這些潛在目標(biāo)的自由基反應(yīng)可以影響一系列的細(xì)胞功能而導(dǎo)致病變和最終的細(xì)胞死亡，處于潛在反應(yīng)位點的抗氧化劑會限制該損害，抗氧化劑在保護DNA、蛋白質(zhì)(包括脂蛋白)和膜脂質(zhì)免于氧化性損害中起著重要的作用。
有強有力的證據(jù)證明自由基損害造成許多慢性健康問題，對于大多數(shù)人類疾病而言，由內(nèi)源產(chǎn)生的氧化劑對初期疾病過程是次要的，但氧化性損害加重了初期的損傷，例如，再灌注損傷可以被定義為發(fā)生于局部缺血發(fā)作之后恢復(fù)血流時器官的損害。盡管是必需的，但是氧恢復(fù)增加了在損傷的組織中氧化劑的形成并暫時惡化了該損傷(UraizeeA，Circulaton 75(6)1237-1248(1987))。Guanicri描述了在缺氧心肌中抗氧化劑防御的減少然后隨著重新充氧作用而脂質(zhì)過氧化增加(Biochim-Biophys-ACTA718(2)157-164(1982))。在再灌注損傷中，局部缺血后由于粘連和激活中性白細(xì)胞，在內(nèi)皮損傷位點處的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致產(chǎn)生超氧化物。在許多不同的臨床情況中，也增加了肝臟中氧自由基的產(chǎn)生。在病毒性肝炎和慢性活動性肝炎中，肝臟中累積了大量被刺激的巨噬細(xì)胞，它們產(chǎn)生自由基，由于肝臟中增加了常由細(xì)胞色素P-450介導(dǎo)的自由基的生成，大量有毒的化學(xué)物質(zhì)導(dǎo)致肝中毒性損傷?？梢詳喽◤蔫F蛋白釋放出的鐵催化羥基的生成是許多肝臟病易發(fā)的機理(Lee WM，N Eng J of Med；Review P.1118(1995))。
氧化和抗氧化劑的使用對于許多炎癥疾病的治療也是很重要的，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是最常見的慢性炎性疾病，流行病學(xué)研究表明標(biāo)準(zhǔn)和明確的RA流行率在0.3％和1.5％之間。慢性持續(xù)性炎性關(guān)節(jié)疾病伴隨有在發(fā)炎的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)里H2O2的生成，在發(fā)炎期間，多形核白細(xì)胞(PMN)和巨噬細(xì)胞也尤其產(chǎn)生氧自由基。在任何慢性或急性炎癥疾病中，PMN和巨噬細(xì)胞會產(chǎn)生O2-和H2O2。結(jié)核病、牛皮癬、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、其它自身免疫疾病和成人呼吸窘迫綜合癥也可以被稱為伴隨氧化作為主要因素的炎性疾病，許多其它疾病也可以列入該行列中。
在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)創(chuàng)傷和中風(fēng)(例如局部缺血)領(lǐng)域中，氧自由基的生成和脂質(zhì)過氧化過程也已成為研究人員關(guān)注的焦點。許多研究提供了大量的證據(jù)證明了在損傷或局部缺血的CNS中存在著自由基和脂質(zhì)過氧化的反應(yīng)((Hall ED，J-Neurotrauma 9(Suppl.l)S165-S172(1992))。
已建議抗氧化劑可保護性抗乳癌和抗其它癌(包括腦癌和肝癌)，以及保護性抗心血管疾病和骨質(zhì)疏松((Wiseman H，F(xiàn)ree Radical Res21(3)187-94(1994))。已經(jīng)證明這些抗氧化劑保護模型和細(xì)胞膜(包括核膜)以對抗可能致癌的自由基中間體和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物。人們已將對于與動脈粥樣硬化有關(guān)的嚴(yán)重綜合癥和其通常發(fā)病率的注意力集中在能夠通過抗氧化劑保護低密度脂蛋白(LDL)免受氧化損傷的能力來預(yù)防和治療該血管疾病上(Steinberg D，N Engl J of Med 14915-924(1989))。
發(fā)明描述本發(fā)明提供了將抗氧化劑量的17α-二氫馬萘雌酮或其3-硫酸酯藥用鹽給入需要的哺乳類動物以治療或抑制自由基誘導(dǎo)的疾病的方法。依此推論，本發(fā)明提供了處理哺乳類動物中自由基與酶、離子通道、結(jié)構(gòu)蛋白和膜脂質(zhì)反應(yīng)的方法，該方法包括給入作為犧牲底物的17α-二氫馬萘雌酮或其藥用硫酸酯鹽，其量足以選擇性地與同患者的酶、離子通道、結(jié)構(gòu)蛋白和膜脂質(zhì)反應(yīng)的自由基反應(yīng)并抑制自由基與患者的酶、離子通道、結(jié)構(gòu)蛋白和膜脂質(zhì)的反應(yīng)，其中確定用抗氧化劑治療有保證的具體病癥是癌癥、中樞神經(jīng)系統(tǒng)紊亂、骨疾、衰老、炎癥、末梢血管疾病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、自身免疫疾病、呼吸窘迫、肺氣腫、預(yù)防重新灌注損傷、病毒性肝炎、慢性活動性肝炎、結(jié)核病、牛皮癬、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、成人呼吸窘迫綜合癥、中樞神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷和中風(fēng)。
作為本發(fā)明的用途，處理包括已有疾病的治療、改善疾病或減輕疾病，抑制包括抑制或預(yù)防疾病的發(fā)展或擴散。
17α-二氫馬萘雌酮3-硫酸酯藥用鹽包括(但不局限于此)堿金屬鹽、堿土金屬鹽、銨鹽、含有1-6個碳原子的烷基胺鹽或在各自的烷基基團中含有1-6個碳原子的二烷基胺鹽。
采用標(biāo)準(zhǔn)的藥理測試方法確定17α-二氫馬萘雌酮抗氧化劑性能，該方法通過TBARS(硫代巴比妥酸活性物質(zhì))方法分析游離醛(YagiK.，Biochem Med 15212-216(1976))測定其對由暴露在Cu++離子或培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞中誘導(dǎo)的氧化變性的低密度脂蛋白(LDL)的形成的抑制能力(Parthasarathy S，Proc Natl Acad Sci USA 861046-1050(1989))。
用該標(biāo)準(zhǔn)藥理測試方法得到的結(jié)果表明17α-二氫馬萘雌酮是有效的LDL氧化反應(yīng)抑制劑，即抑制可達(dá)至多100％，在Cu++離子介導(dǎo)的和豬主動脈內(nèi)皮細(xì)胞介導(dǎo)的氧化中分別得到0.17μM和0.065μM的IC50值。由比較，在豬主動脈內(nèi)皮細(xì)胞介導(dǎo)的氧化測試方法中，雌酮所得到的IC50值為0.56μM。用該測試方法也可以證明17α-二氫馬萘雌酮是有效的LDL和血漿氧化抑制劑，得到的IC50s值分別為0.065μM和0.07μM。
17α-二氫馬萘雌酮抗氧化劑性能還通過它的動力學(xué)效果來評價，該動力學(xué)效果涉及在Cu++存在下發(fā)生的LDL、HDL和血漿的氧化，即已用于誘導(dǎo)LDL變性的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(Esterbauer H，Ann NY Acad Sci1989；570254-267，Huber LA，F(xiàn)ree Rad Res Comms 1990；8167-173，Vossen Rcrm，Lipids 1993；8857-861，Jialal I，J Lipid Res1992；33899-906)。用分光光度法跟蹤共軛二烯(主要的初期脂質(zhì)過氧化物)的形成估計的下列參數(shù)為延遲期或Tmin氧化開始所用時間；T50形成50％共軛雙二烯所用時間；和Tmax達(dá)到最大氧化所用時間。
濃度為25nM受試的17α-二氫馬萘雌酮能夠在人類LDL的共軛二烯形成中延長延遲期28％。T50和Tmax分別延長31％和30％。在同樣的試驗中，25nM的雌酮僅增加所有參數(shù)7-10％。25nM的17α-二氫馬萘雌酮具有明顯抑制人類HDL的共軛二烯形成的效果，它延長延遲期的299％。T50和Tmax分別延長134％和118％。相同濃度的雌酮由延長延遲期20％、T5038％和Tmax46％對HDL共軛二烯的形成起作用。在人類血漿共軛二烯的形成中，25nM的17α-二氫馬萘雌酮對延遲期無作用，然而，他的確延長T50和Tmax分別為19％和32％，這就指示了雖然它對氧化初期幾乎沒有作用，但它降低了它的速率。該體系中的雌酮對延遲期也無作用，對于T50和Tmax的效果僅分別為5％和10％。
為進一步證明17α-二氫馬萘雌酮的抗氧化性能，用培養(yǎng)的細(xì)胞進行兩個附加標(biāo)準(zhǔn)藥理學(xué)測試步驟。在第一個測試步驟中，在17α-二氫馬萘雌酮存在或不存在的情況下，將放射性同位素標(biāo)記的LDL(125I-LDL)(McFarlane AS，InMunro HN，Allison JB，eds.MammalianProtein Metabolism.Vol.l.New YorkAcademic Press297-341(1964))置于Cu++中變性。下一步，將表達(dá)結(jié)合氧化變性LDL的清除劑脂蛋白受體的J774巨噬細(xì)胞置于處理的125I-LDL中。該試驗結(jié)果表明在17α-二氫馬萘雌酮存在下，氧化的Cu++-處理的LDL的結(jié)合減少70％和41％(分別是2.5和0.25μM17α-二氫馬萘雌酮)，通過比較，相同濃度的雌酮分別減少39％和0％的氧化LDL的結(jié)合。因為氧化的LDL由巨噬細(xì)胞結(jié)合和代謝被認(rèn)為極強地促成了海綿狀細(xì)胞和動脈粥樣硬化斑的生長，因此，該減少LDL氧化和隨后結(jié)合到清除劑受體上的效果被認(rèn)為是非常有益的。
在第二個測試步驟中，將豬主動脈內(nèi)皮細(xì)胞(PAEC)置于LDL中，該LDL已如上述通過置于有或沒有17α-二氫馬萘雌酮情況下的Cu++中而變性。已證明氧化的LDL對內(nèi)皮細(xì)胞具有細(xì)胞毒性并且該過程與動脈粥樣硬化有很強的連帶關(guān)系。用處理的LDL孵育細(xì)胞24小時之后，進行MTT試驗以評價細(xì)胞毒性(Hansen MB，.J Immu Methods 119203-210(1989))。該測定方法對所給試驗中活細(xì)胞的百分率作出評價。在該試驗中，將細(xì)胞置于無化合物存在時氧化的25μg/ml LDL中，之后僅2％的細(xì)胞存活下來。與之對照，隨后將細(xì)胞置于在17a-二氫馬萘雌酮(0.25μM)存在下的Cu++處理的LDL中，存活細(xì)胞的百分率是45％或更多。在相同試驗中測試的其它化合物對PACE的保護影響最小(17β-雌二醇＝11％存活；馬烯雌酮＝4％存活；雌酮＝37％存活)。該測試方法的結(jié)果證明17a-二氫馬萘雌酮存在下改性的LDL無細(xì)胞毒性，因此，該數(shù)據(jù)與上述由TBARS方法證明的由17α-二氫馬萘雌酮抑制氧化變性相一致。
基于這些測試方法得到的結(jié)果，17α-二氫馬萘雌酮和其硫酸酯的藥用鹽作為抗氧化劑可用于治療或抑制自由基誘導(dǎo)的疾病，所述藥用鹽如堿金屬鹽、堿土金屬鹽、銨鹽、含有1-6個碳原子的烷基胺鹽或在各自的烷基基團中含有1-6個碳原子的二烷基胺鹽。
本發(fā)明抗氧化劑可配制成純品給藥或與藥用載體一起配制給藥，通過化合物的溶解度和化學(xué)性質(zhì)、選擇的給藥途徑和標(biāo)準(zhǔn)藥理學(xué)實踐來確定載體的比例。藥用載體可以是固體或液體。
固體載體可以包括一種或多種物質(zhì)，該物質(zhì)也可以起矯味劑、潤滑劑、增溶劑、懸浮劑、填充劑、助流劑、壓縮助劑、粘合劑或片劑崩解劑的作用；固體載體也可以是包膠物質(zhì)。在粉劑中，載體是細(xì)分的固體，該固體與細(xì)分的活性成分混合。在片劑中，活性成分與具有所需壓縮性質(zhì)的載體以合適的比例混合并被壓成所需的形狀和大小。優(yōu)選粉劑和片劑含有至多達(dá)99％的活性成分。合適的固體載體包括磷酸鈣、硬脂酸鎂、滑石、蔗糖、乳糖、糊精、淀粉、明膠、纖維素、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、聚乙烯吡咯烷酮、低熔點蠟和離子交換樹脂。
液體載體用于制備溶液、懸浮液、乳劑、糖漿、酏劑和加壓組合物。活性成分能被溶解于或懸浮于藥用液體載體，如水、有機溶劑、兩者的混合物或藥用油或脂肪中，液體載體能夠含有其它合適的藥用添加劑，如增溶劑、乳化劑、緩沖液、防腐劑、甜味劑、矯味劑、懸浮劑、增稠劑、色素、黏度調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑或滲透調(diào)節(jié)劑?？诜湍c胃外給藥的液體載體合適的實例包括水(部分地含有如上的添加劑，如纖維素衍生物，優(yōu)選羧甲基纖維素鈉溶液)、醇(包括一羥基醇和多羥基醇，如乙二醇)和它們的衍生物、lethicins和油(如精餾的椰子油和花生油)。對于腸胃外給藥，載體也可以是油脂，如油酸乙酯和肉豆蔻異丙酸酯。無菌液載體用于腸胃外給藥的無菌液形式的組合物中，對于加壓組合物的液體載體能夠是鹵化的烴或其它藥用推進劑。
無菌溶液或懸浮液的液體藥物組合物可以通過例如肌內(nèi)、腹膜內(nèi)或皮下注射使用。無菌溶液也能夠靜脈給藥，本發(fā)明的化合物也能夠以液體或固體組合物的形式口服給藥。
本發(fā)明抗氧化劑可以常規(guī)栓劑的形式經(jīng)直腸給入，為了由鼻內(nèi)或支氣管內(nèi)吸入或吹入給藥，可以將本發(fā)明抗氧化劑配制成水溶液或部分水溶液，然后使其能夠以氣霧劑的形式使用，本發(fā)明化合物也可以通過含有活性化合物和載體的透皮片經(jīng)皮給入，所述載體對于活性化合物是惰性的、對于皮膚是無毒的、并可通過皮膚使傳輸?shù)乃巹┤硇晕降窖髦小］d體可采取多種形式，如霜劑和軟膏劑、糊劑、凝膠和閉合裝置。霜劑和軟膏劑可以是水包油型或油包水型的粘稠液體或半固態(tài)乳劑，在含有活性成分的石油或親水石油中分散的吸附性粉末組成的糊劑也是適用的。也可以利用多種閉合裝置將活性成分釋放到血流中，如覆蓋含有活性成分、有或無載體的儲層的半透膜或含有活性成分的基質(zhì)，其它閉合裝置見于文獻(xiàn)中。
此外，通過與藥用賦形劑配制成含有0.1-5％(優(yōu)選2％)活性化合物的制劑，本發(fā)明抗氧化劑可以作為溶液、霜劑或洗液使用施于真菌作用的區(qū)域。
所需劑量隨所用具體組合物、給藥途徑、呈現(xiàn)癥狀的嚴(yán)重性和被治療的具體客體而變化，基于標(biāo)準(zhǔn)藥理測試方法得到的結(jié)果，設(shè)計的活性化合物的日劑量應(yīng)為0.02μg/kg-500μg/kg，通過用少于化合物的最佳劑量的小劑量開始治療。然后，增加劑量至達(dá)到治療環(huán)境下的最佳效果；藥劑師會根據(jù)治療各客體的經(jīng)驗確定口服、腸胃外、鼻內(nèi)或腹膜內(nèi)給藥的精確劑量，優(yōu)選藥物組合物是單位劑量形式，例如，片劑或膠囊，在該形式中，組合物被再分為含有合適量活性成分的單位劑量；單位劑量形式可以是被包裝的組合物，例如，是被包裝的粉劑，可以是藥瓶、安瓿、預(yù)填充注射器或含液體的sachets。單位劑量形式可以是例如膠囊或片劑本身，或可以是包裝形式下合適數(shù)量的任何所述組合物。
權(quán)利要求
1.抑制或治療自由基誘導(dǎo)的疾病的方法，該方法為將抗氧化劑量的17α-二氫馬萘雌酮或17α-二氫馬萘雌酮-3-硫酸酯的藥用鹽用于需要的哺乳類動物。
2.權(quán)利要求1的方法，其中3-硫酸酯的藥用鹽是堿金屬鹽、堿土金屬鹽、銨鹽、含有1-6個碳原子的烷基胺鹽或在各烷基基團中含有1-6個碳原子的二烷基胺鹽。
3.抑制需要相應(yīng)治療的哺乳類動物中自由基與酶、離子通道、結(jié)構(gòu)蛋白和膜脂質(zhì)反應(yīng)的方法，該方法包括使用作為犧牲底物的17α-二氫馬萘雌酮或17α-二氫馬萘雌酮-3-硫酸酯的藥用鹽，其量足以選擇性地與同所述哺乳類動物的酶、離子通道、結(jié)構(gòu)蛋白和膜脂質(zhì)反應(yīng)的自由基反應(yīng)并抑制自由基與所述哺乳類動物的酶、離子通道、結(jié)構(gòu)蛋白和膜脂質(zhì)的反應(yīng)。
4.抑制與下列疾病的發(fā)展有關(guān)的內(nèi)源性自由基的方法，所述疾病為癌癥、中樞神經(jīng)系統(tǒng)紊亂、阿爾茨海默氏病、骨疾、衰老、炎癥、末梢血管疾病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、自身免疫疾病、呼吸窘迫、肺氣腫、預(yù)防重新灌注損傷、病毒性肝炎、慢性活動性肝炎、結(jié)核病、牛皮癬、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、成人呼吸窘迫綜合癥、中樞神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷和中風(fēng)，或在重新灌注過程中的損傷，該方法包括使用17α-二氫馬萘雌酮或17α-二氫馬萘雌酮-3-硫酸酯的藥用鹽。
全文摘要
本發(fā)明提供了用17α－二氫馬萘雌酮或17α－二氫馬萘雌酮－3－硫酸酯的藥用鹽作為抗氧化劑的方法。
文檔編號A61P39/06GK1239890SQ97180446
公開日1999年12月29日 申請日期1997年12月5日 優(yōu)先權(quán)日1996年12月9日
發(fā)明者S·J·阿德曼, D·H·普羅茲勒克, D·E·科拉克 申請人:美國家用產(chǎn)品公司