專利名稱：內(nèi)皮細(xì)胞促生長(zhǎng)素抑制素受體的選擇性處理的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及選擇性的肽和非肽類的促生長(zhǎng)素抑制素受體激動(dòng)劑治療性應(yīng)用的領(lǐng)域。
SS的效應(yīng)由SS受體家族(SSTR)轉(zhuǎn)導(dǎo)，其中的5個(gè)(SSTR1-SSTR5)已被克隆(Coy等，1993，同上)?；谙鄬?duì)序列相似性和對(duì)SS類似物的親合性，這些受體可被分為兩個(gè)亞群(Hoyer等，1995,TrendsPharmacol Sci16:86)。第一個(gè)亞群由SSTR2,SSTR3和SSTR5組成。第二個(gè)亞群包含SSTR1和SSTR4。部分是由于對(duì)SSTR、特別是對(duì)SSTR2具選擇性的SS類似物的可用性，第一個(gè)受體亞群的生理學(xué)已經(jīng)被更徹底的定性。已知全部5種SSTR有一些共同的機(jī)理性特征，例如已經(jīng)證實(shí)所有5種都與G蛋白偶聯(lián)并調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)cAMP的水平，這部分是通過(guò)Gi的激活完成的(Patel等，1994,Biochem.BilphysRes.Commun.198:605)。
在體內(nèi)SS半壽期非常短，導(dǎo)致它不適用于多種治療。為了治療方面的應(yīng)用，已鑒定了許多SS短肽類似物，尤其是SSTR的第一亞組的激動(dòng)劑(見(jiàn)，例如1984年11月27出版的U.S．專利4,485,101；1990年2月27出版的4,904,642；1992年9月15出版的5,147,859；1995年4月25出版的5,409,894；1997年1月28出版的5,597,894；和下述國(guó)際專利公開(kāi)1997年1月16日的WO97/01579和1997年12月18的WO97/47317；全部在此引用作為參考)。
其中特征研究最為透徹的SSTR肽激動(dòng)劑是Octreotide(SandozLtd.,Basel,Switzerland)和angiopeptin(有時(shí)也稱為BIM23014)。Octreotide被認(rèn)為是SSTR2選擇性的激動(dòng)劑(Yang等，1998,PNASUSA95:10836)。angiopeptin被認(rèn)為是一種SSTR2/SSTR5的選擇性激動(dòng)劑(Alderton等，1998，英國(guó)藥理學(xué)雜志(Br.J.Parmacol)124(2):323)。U.S．專利號(hào)5,750,499(Hoeger等,1998年5月12日出版，在此引用作為參考)公開(kāi)了其中聲稱為是第一種SSTR1選擇性激動(dòng)劑(也見(jiàn)于Liapakis等，1996.The J.of Pharmacology andExperimental Therapeutics276(3)1089，在此引用作為參考)，其中的一種被證實(shí)為des-AA1,2,5[DTrp8,LAamp9]SS(即脫氨基酸1,2,5[Dtryptophan8,N-對(duì)異丙基-4-氨甲基-L-苯丙氨酸9]SS，此處簡(jiǎn)寫(xiě)為“SSTR1′499激動(dòng)劑”)。
通過(guò)應(yīng)用組合化學(xué)的方法，發(fā)現(xiàn)了許多非肽類的促生長(zhǎng)素抑制素受體亞型選擇性激動(dòng)劑(Rohrer等，1998，科學(xué)(Science)282:737，在此引用作為參考)。Rhorer等(同上)鑒定的激動(dòng)劑中，包括有SSTR1和SSTR4的選擇性激動(dòng)劑。Rhorer等(同上)也公開(kāi)了SS14與SSTR受體結(jié)合的表觀抑制常數(shù)(Ki)(如表1所示)，并公開(kāi)了計(jì)算SSTR選擇性激動(dòng)劑的常數(shù)的方法。Rhorer等(同上)指出其中公開(kāi)的SSTR1和SSTR4激動(dòng)劑是無(wú)生理活性的，原因在于它們?cè)谀Ｐ拖到y(tǒng)中不能抑制生長(zhǎng)激素、胰高血糖素或胰島素的釋放。相反，其中公開(kāi)了一種SSTR2激動(dòng)劑具有強(qiáng)的抑制生長(zhǎng)激素，胰高血糖素和胰島素分泌的效果。
表1SS14 SSTR特異性(Ki,nM)*
*來(lái)自Rohrer等，1998，科學(xué)282:737已經(jīng)提示，特定的SSTR激動(dòng)劑在多種疾病的治療中可能有用，尤其是某些動(dòng)物模型中有利的治療結(jié)果可說(shuō)明這一點(diǎn)。例如，根據(jù)雞絨毛尿囊膜(CAM)模型，提示SSTR2激動(dòng)劑尤其可能是血管形成的有效的抑制劑(Woltering等，1997,Investigational New Drugs15:77，其中多種激動(dòng)劑的SSTR2結(jié)合活性與化合物的抗血管形成的能力相關(guān))。在血管形成方面，在裸鼠模型中，通過(guò)抑制鼠的血管形成，最近顯示SS本身可控制異種移植的Kaposi肉瘤在小鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)(Albini等，1999,The FASEB J.13(6):647，其中提供的結(jié)果表明人內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)SSTR3)。也有大量的證據(jù)表明SSTR2激動(dòng)劑，尤其是angiopeptin，在動(dòng)物模型中對(duì)抑制動(dòng)脈損傷后的內(nèi)膜增生有效(Lundergan等，1989，動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis)80:49；Foegh等，1989，動(dòng)脈粥樣硬化78:229；Conte等，1989,Transpl Proc 21:3686；Vargas等，1989,Transplant Proc21:3702；Hong等，1993,Circulation88:229；Leszczynski等，1993,Regulatory peptides 43:131；Mooradian等，1995,J.Cardiovasc Pharm25:611；Light等，1993，美國(guó)生理學(xué)雜志(Am J Physiol)265:H1265)。提示這種在動(dòng)物模型中的治療活性反映了angiopeptin抑制損傷的內(nèi)皮細(xì)胞釋放生長(zhǎng)因子的能力(Hayry等，1996,Metabolism45(8Suppl1):101)。但是，在臨床研究方面，利用angiopeptin對(duì)導(dǎo)致病人再狹窄的內(nèi)膜增生進(jìn)行抑制未得到什么結(jié)論(Eriksen等，1995,Am Heart J.130:1；Emanuelsson等，1995,Circulation 91:1689；Kent等，1993,Circulation 88:1506)。angiopeptin在預(yù)防冠狀動(dòng)脈血管成形術(shù)后的再狹窄的臨床試驗(yàn)方面效力較差，與動(dòng)物研究中令人鼓舞的結(jié)果相反，其中原因在于angiopeptin對(duì)SSTR2受體的內(nèi)在活性低，再加上缺乏對(duì)SSTR5受體的激動(dòng)劑活性(Alderton等，1998,Br.J.Pharmacol124(2):323)。SSTR2激動(dòng)劑已經(jīng)被證實(shí)在治療糖尿病性視網(wǎng)膜病變方面通常也是無(wú)效的(Kirkegaard等，1990,Acta Endocrinologica(Copenh)122:766),盡管體外和動(dòng)物研究提示這樣的化合物有抗血管形成的活性。
內(nèi)皮細(xì)胞形成被覆人體所有血管的單細(xì)胞層，被其它的細(xì)胞類型如成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞包圍。內(nèi)皮細(xì)胞局限于血管內(nèi)。調(diào)節(jié)血管重建的生理系統(tǒng)的不平衡導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞介導(dǎo)的增殖性疾病如血管生成性疾病和內(nèi)膜增生依然是重要的健康問(wèn)題。例如，在諸如年齡相關(guān)的黃斑變性和糖尿病性視網(wǎng)膜病變中眼內(nèi)新血管形成是最常見(jiàn)的失明原因之一?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)內(nèi)膜增生導(dǎo)致的再狹窄或動(dòng)脈狹窄的發(fā)病率在冠狀動(dòng)脈成形術(shù)中為30-50％，分流術(shù)后大約為20％(McBride等，1988,N.Engl.J.Med.318:1734；Clowes,1986,J.Vasc.Surg3:381)。實(shí)體瘤生長(zhǎng)誘導(dǎo)的血管形成不僅可能導(dǎo)致原發(fā)腫瘤的增大，而且可借助新生的血管發(fā)生轉(zhuǎn)移。
發(fā)明詳述一個(gè)方面，本發(fā)明提供了SSTR1和SSTR4選擇性激動(dòng)劑的治療性使用。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明涉及使用SSTR1和SSTR4選擇性激動(dòng)劑治療內(nèi)皮細(xì)胞介導(dǎo)的增殖性疾病。內(nèi)皮細(xì)胞介導(dǎo)的增殖性疾病的例子包括內(nèi)膜增生和血管形成性疾病(血管形成性疾病的特征在于因不適當(dāng)?shù)幕虿荒苷{(diào)節(jié)的血管形成導(dǎo)致的病理性新血管形成)。增殖性疾病可能由內(nèi)皮細(xì)胞介導(dǎo)，例如，其中內(nèi)皮細(xì)胞可能參與病理性細(xì)胞增殖的上調(diào)，如在內(nèi)膜增生(其中的增殖細(xì)胞可能是內(nèi)皮細(xì)胞或其它細(xì)胞類型)就是如此，或，如實(shí)體瘤的血管形成的例子中，其中的內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)病理性細(xì)胞增殖。內(nèi)皮細(xì)胞介導(dǎo)的增殖性疾病的種類可以被醫(yī)學(xué)實(shí)踐者和本領(lǐng)域技術(shù)人員所識(shí)別，并隨醫(yī)學(xué)研究的進(jìn)展而不時(shí)的改變。
在本發(fā)明的多方面，血管形成性疾病可以包含增殖性視網(wǎng)膜病變，如糖尿病性視網(wǎng)膜病變，早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變，角膜移植排斥，晶狀體后纖維組織形成，新生血管性青光眼，虹膜發(fā)紅(rubeosis)，黃斑變性引起的視網(wǎng)膜新血管形成(包含光動(dòng)力治療后的抗血管形成治療)，缺氧，與感染或外科干預(yù)相關(guān)的眼內(nèi)血管形成，和眼內(nèi)其它異常新血管形成狀況；皮膚病如牛皮癬相關(guān)的血管形成；血管疾病例如血管瘤(hemagiomas)，和動(dòng)脈粥樣斑內(nèi)的毛細(xì)血管增殖，Oser-Webber綜合癥，心肌血管形成，和斑新生血管化，毛細(xì)血管擴(kuò)張癥，血友病性關(guān)節(jié)，血管纖維瘤，和創(chuàng)傷肉芽發(fā)生。其它的應(yīng)用包括治療以過(guò)度或不正常的內(nèi)皮細(xì)胞激活為特征的疾病，包含但不局限于腸粘連，Crohn’s疾病，動(dòng)脈粥樣硬化，硬皮病和肥大疤痕，即疤痕疙瘩。SSTR1和SSTR4的選擇性激動(dòng)劑也在以血管形成為病理結(jié)果的疾病如貓抓病(Rochele nianlia quintosa)和潰瘍(Helicobacter pylori)的治療方面有用。
本發(fā)明另外一個(gè)方面包括SSTR1和SSTR4選擇性激動(dòng)劑用于對(duì)抗血管形成治療敏感的腫瘤的治療，包含原發(fā)和轉(zhuǎn)移的實(shí)體瘤，包括乳腺癌，結(jié)腸癌，直腸癌，肺癌，口咽癌，喉癌，食管癌，胃癌，胰腺癌，肝癌，膽囊癌和膽管癌，小腸癌，泌尿道癌(包括腎臟癌，膀胱癌和尿道上皮癌)，女性生殖道癌(包括宮頸癌，子宮癌和卵巢癌，以及絨毛膜癌，和妊娠滋養(yǎng)層疾病)，男性生殖道癌(包含前列腺癌，精囊癌，睪丸癌和生殖細(xì)胞腫瘤)，內(nèi)分泌腺癌(包括甲狀腺癌，腎上腺癌，和腦下垂體癌)，和皮膚癌，以及血管瘤，黑色素瘤，肉瘤(包括骨和軟組織來(lái)源的肉瘤以及Kaposi’s肉瘤)和腦腫瘤，神經(jīng)瘤，眼瘤和腦膜瘤(包括星形細(xì)胞瘤，神經(jīng)膠質(zhì)瘤，神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤，神經(jīng)瘤，神經(jīng)母細(xì)胞瘤，神經(jīng)鞘瘤，腦脊膜瘤)。在本發(fā)明的一些方面，SSTR1和SSTR4選擇性激動(dòng)劑在造血組織惡化來(lái)源的惡性腫瘤如白血病(即綠色肉瘤，漿細(xì)胞瘤和蕈樣肉芽腫病斑及瘤，和皮膚T細(xì)胞淋巴瘤/白血病)以及淋巴瘤(何杰金氏和非何杰金氏淋巴瘤)的治療方面也是有用的。此外，SSTR1和SSTR4選擇性激動(dòng)劑可單獨(dú)或與放療和/或其它的化療試劑聯(lián)合用于預(yù)防上述腫瘤的轉(zhuǎn)移。
在幾個(gè)方面，本發(fā)明涉及對(duì)一種或更多種促生長(zhǎng)素抑制素受體亞型具有選擇性的促生長(zhǎng)素抑制素受體激動(dòng)劑。在此方面，可以進(jìn)行受體-配基結(jié)合試驗(yàn)以確定化合物對(duì)一種或多種促生長(zhǎng)素抑制素受體的相對(duì)親合力，例如Rhorer等，1998，科學(xué)282:737描述的例子。在一些實(shí)施方案中，如果某化合物相對(duì)于某受體的表觀抑制常數(shù)(Ki，如Rhorer等描述的方法計(jì)算)低于該化合物相對(duì)于另一促生長(zhǎng)素抑制素受體的Ki，并且在一些實(shí)施方案中至少低10倍，則表示該化合物對(duì)該受體是選擇性的。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明中使用的激動(dòng)劑的選擇性可以高于10倍，如100倍或1000倍。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明包含對(duì)一種以上SSTR具選擇性的化合物。
一個(gè)方面，本發(fā)明應(yīng)用了已建立的模型系統(tǒng)來(lái)研究人血管形成。該模型系統(tǒng)包含自發(fā)轉(zhuǎn)化的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株ECV304，在Matrigel基底上生長(zhǎng)(Hughes,1996，實(shí)驗(yàn)細(xì)胞研究(Experimental CellResearch)225:171-185)。Matrigel是一種溶解的基底膜提取物，它能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞在體外分化成毛細(xì)血管狀的結(jié)構(gòu)。已經(jīng)表明在Matrigel培養(yǎng)基上，當(dāng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)歷與新生血管形成相關(guān)聯(lián)的形態(tài)學(xué)改變時(shí)，將發(fā)生細(xì)胞骨架的重組織(Grant等，1991,In VitroCell Dev Biol27A(4):327-36)。如此處實(shí)施例1中公開(kāi)的，利用包含在Matrigel基底上的ECV304細(xì)胞的體外血管形成模型，本發(fā)明內(nèi)容表明SS14可抑制血管形成。已發(fā)現(xiàn)在次微摩爾和更高的濃度下，SS14可顯著地抑制這種模型系統(tǒng)中新生血管的生長(zhǎng)。這些結(jié)果提示，SS14這種所有促生長(zhǎng)素抑制素受體亞型的激動(dòng)劑(見(jiàn)表1)，可作為血管形成抑制劑作用于人內(nèi)皮細(xì)胞。
本發(fā)明者進(jìn)一步闡明了ECV304細(xì)胞僅表達(dá)SSTR1和SSTR4受體亞型，并不表達(dá)RT-PCR可檢測(cè)量的SSTR2,SSTR3或SSTR5的mRNA(見(jiàn)實(shí)施例2)。因此，所闡明的SS14對(duì)ECV304細(xì)胞的抗血管形成作用可能是由SSTR1和/或SSTR4介導(dǎo)。本發(fā)明者也闡明了SSTR1的選擇性激動(dòng)劑對(duì)ECV304細(xì)胞具有相似于SS14的生理效果，特別是對(duì)肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維的解裝配和片狀偽足的形成效果相似(見(jiàn)實(shí)施例3)。這表明，在本發(fā)明其它實(shí)施方案中，SSTR1和SSTR4選擇性激動(dòng)劑對(duì)人內(nèi)皮細(xì)胞具有抗血管形成的效應(yīng)，正如SS14在ECV304/Matrigel模型系統(tǒng)中具有抗血管形成作用一樣。
已表明促生長(zhǎng)素抑制素類似物在許多增殖性疾病，包括血管形成和內(nèi)膜增生的動(dòng)物模型中具有治療效果。有證據(jù)表明尤其是SSTR2激動(dòng)劑可成功用于改善內(nèi)皮細(xì)胞介導(dǎo)的增殖性疾病模型例如CAM，幾種動(dòng)物種屬的動(dòng)脈囊損傷(arterial balloon injury)，和腫瘤模型中的鼠血管增殖的病變。本發(fā)明者也已確定，與內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)SSTR2的動(dòng)物模型相反(見(jiàn)實(shí)施例4和Chen等，1997,J.of Investigative Surgery10:17)，人內(nèi)皮細(xì)胞和組織表達(dá)SSTR1和SSTR4。這種結(jié)果提示，SSTR2激動(dòng)劑在治療人內(nèi)皮細(xì)胞介導(dǎo)的增殖性病變或疾病的動(dòng)物模型方面是有效的，而SSTR1和SSTR4選擇性激動(dòng)劑可以用來(lái)治療人類的患者。
盡管此處公開(kāi)了本發(fā)明的多種實(shí)施方案，但依據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員的常識(shí)在本發(fā)明范圍內(nèi)可進(jìn)行許多改編和修改。這種修改包括本發(fā)明任何方面的已知等價(jià)物的代替從而以基本上相同的方式取得相同的結(jié)果。數(shù)字范圍包含確定界限的數(shù)字。在權(quán)利要求中，單詞“包含”是一個(gè)開(kāi)放式的術(shù)語(yǔ)，基本等同于“包括，但不局限于”。下面的實(shí)施例是本發(fā)明多個(gè)方面的例證性的描述，并不限制如此處公開(kāi)的本發(fā)明寬廣的方面。實(shí)施例1:SS14的抗血管形成效應(yīng)這個(gè)實(shí)施例說(shuō)明利用一種已建立的血管形成模型，在體外SS14對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞毛細(xì)血管樣微管形成的抗血管形成作用。該模型是基于人內(nèi)皮細(xì)胞，尤其是ECV304細(xì)胞在Matrigel(一種基底膜提取物)上形成毛細(xì)血管樣微管的傾向性(Hughes,1996，實(shí)驗(yàn)細(xì)胞研究(Experimental Cell Reseach)225:171)。
利用1.0mL0.01％BSA/0.01N乙酸/PBS重溶5mg小瓶的SS14(Biomeasure Incorporated)，以獲得3mM的工作貯存液。人內(nèi)皮細(xì)胞株ECV304(ATCC)在添加2mML-谷氨酰胺(Gibco BRL),1mM丙酮酸鈉(Gibco BRL),5×10-5M2-巰基乙醇(Sigma),100U/mL青霉素(Gibco BRL),100μg/mL鏈霉素(Gibco BRL),20mMHEPES(Sigma)，和可任選加入的10％熱滅活胎牛血清(Gibco BRL)或1％BSA的Medium199(M199,Sigma)中培養(yǎng)。細(xì)胞長(zhǎng)滿后，用0.05％胰酶，0.005％EDTA(Gibco BRL)按1∶5傳代。
將ECV304細(xì)胞(3.5×104個(gè)在0.5mL完全M199培養(yǎng)基中)鋪在以0.125mLMatrigel(Becton-Dickinson)預(yù)包被的24孔板上。立即將SS14加入ECV304細(xì)胞并將細(xì)胞在CO2濕化的箱內(nèi)37℃培養(yǎng)。24小時(shí)后，將微管形成的圖象記錄在膠片上。利用Hewlett-PackardScanJet4C/T掃描儀將圖象轉(zhuǎn)變成數(shù)字化格式，應(yīng)用Optimas6.1圖象分析軟件(Optimas Corp)測(cè)量毛細(xì)血管樣微管的總長(zhǎng)度。
圖2以圖解形式說(shuō)明SS14以劑量依賴形式抑制新生血管微管的形成結(jié)果。圖2中的圖形表示，通過(guò)測(cè)量新生血管微管相對(duì)于SS14未處理對(duì)照樣品的相對(duì)長(zhǎng)度，濃度為0.1-100μM的SS14對(duì)血管形成的抑制均大于50％。實(shí)施例2人內(nèi)皮細(xì)胞的特征以RT-PCR檢測(cè)von Willebrand因子(vWF)的mRNA和以免疫組織化學(xué)檢測(cè)vWF(vWF參與體內(nèi)血液凝集級(jí)聯(lián)反應(yīng)，是內(nèi)皮細(xì)胞已知的功能性標(biāo)志物)，確定本發(fā)明中使用的ECV304細(xì)胞的內(nèi)皮細(xì)胞特征。此處使用的ECV304細(xì)胞也表達(dá)內(nèi)皮性標(biāo)志物-內(nèi)皮細(xì)胞氧化氮合酶(eNOS)。
RT-PCR提供證據(jù)表明ECV304細(xì)胞和來(lái)源于臍靜脈的原代內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC細(xì)胞株中存在SSTR1和SSTR4的mRNA。兩種細(xì)胞株都不表達(dá)SSTR2、SSTR3和SSTR5的mRNA，除了一些HUVEC培養(yǎng)細(xì)胞的較晚代細(xì)胞表達(dá)低水平的SSTR2。
進(jìn)行ECV304和HUVEC內(nèi)皮細(xì)胞株的SSTR1和vWF免疫染色，證實(shí)SS受體的位置。ECV304和HUVEC細(xì)胞株顯示在細(xì)胞漿內(nèi)和質(zhì)膜上有SSTR1免疫染色。vWF在ECV304細(xì)胞和HUVEC細(xì)胞的早期傳代細(xì)胞中的定位揭示，95-100％細(xì)胞是有免疫活性的，但在較晚代數(shù)的HUVEC中有免疫染色的細(xì)胞較少(60％)。
在本實(shí)施例中，將ECV304細(xì)胞(American Type CultureCollection,Manassas,VA)在添加2mM谷氨酰胺，24mM丙酮酸鈉，10mMHepes，青霉素(100U/mL)，鏈霉素(0.1mg/mL)，和熱滅活胎牛血清(10％)的Medium199培養(yǎng)基(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)中培養(yǎng)。HUVEC和AoSMC細(xì)胞與所需的培養(yǎng)基來(lái)自CloneticsCorporation(Walkersville,MD)。用于RNA收集的細(xì)胞株在75cm2Falcon瓶(Becton Dickinson Labware,Frahklin Lakes,NJ.)中生長(zhǎng)，用于組織學(xué)分析的細(xì)胞株接種在24孔Costar平板(Corning Inc.,Corning,NY)內(nèi)覆蓋20mm蓋玻片的APES(Sigma)上。以下ECV304細(xì)胞株的信息由ATCC提供ATCC號(hào)CRL-1998，最初保藏于1992年5月生物體人(人類)名稱ECV304組織正常，臍靜脈，內(nèi)皮，內(nèi)皮的形態(tài)學(xué)卵圓形保藏者K.Takahashi病毒敏感性Semliki Forest virus(SFV)成瘤性是，在BALB/c nu/nu小鼠核型形態(tài)數(shù)目=80產(chǎn)物血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)培養(yǎng)基更新率每周2-3次傳代培養(yǎng)移去培養(yǎng)基，加入新鮮的0.25％胰酶，0.03％EDTA溶液，沖洗并移去胰酶。將瓶放置在室溫(或37℃孵育)直到細(xì)胞分開(kāi)(通常5-10分鐘)，加入新鮮培養(yǎng)基，吹打并轉(zhuǎn)入新的瓶?jī)?nèi)。
傳代比率推薦1∶6到1∶10生長(zhǎng)特性單層注解ECV304是從正常人臍靜脈血(捐獻(xiàn)者號(hào)304)中建立的自發(fā)轉(zhuǎn)化的永生化內(nèi)皮細(xì)胞株，該細(xì)胞以卵圓形單層生長(zhǎng)模式，無(wú)需任何特殊生長(zhǎng)因子即具有高增殖潛能，以及具有接觸抑制的錨定依賴性為特征。電鏡研究證實(shí)有內(nèi)皮特異性Weibel-Palade小體。對(duì)植物血凝素Ulex europaeusⅠ(UEA-Ⅰ)和PHM5(抗人內(nèi)皮以及腎小球上皮單克隆抗體)的免疫組織化學(xué)染色呈陽(yáng)性。這些細(xì)胞對(duì)于Ⅷ因子相關(guān)抗原，堿性和酸性磷酸酶以及上皮角蛋白為陰性。該細(xì)胞在BALB/cnu/nu小鼠上能夠形成腫瘤，并且在家兔的角膜上可引起新血管生成。據(jù)報(bào)道它們能夠產(chǎn)生尿激酶原型PA(pro-u-PA)并表達(dá)少量的細(xì)胞間粘附分子(ICAM-1)，淋巴細(xì)胞功能相關(guān)的抗原-3(LFA-3)，血管細(xì)胞粘附分子(VCAM-1)和粒細(xì)胞膜蛋白-140(GMP-140)。白細(xì)胞介素-1(IL-1)和干擾素對(duì)ECV304具有抑制效應(yīng)。這些細(xì)胞在用IL-1刺激后，也能夠產(chǎn)生IL-6。該細(xì)胞株曾以BM Cycline處理21天以消除支原體的污染。更詳盡的信息可能包含在以下的在此引用作為參考的文獻(xiàn)中Takahashi等，1990,In Vitro Cell.Dev.Biol.26:265；Takahashi和Sawasaki,1991,In Vitro Cell Dev.Biol27A:766；Takahasi和Sawasaki,1992,In Vitro Cell.Dev.Biol28A:380)。該細(xì)胞株的增殖可以在ATCC Medium199培養(yǎng)基，90％；10％的熱滅活胎牛血清中進(jìn)行。
在本實(shí)施例中，根據(jù)制造商說(shuō)明書(shū)從裂解于Trizol溶液(GibcoLife Technologies,Grand Island,N.Y.)中的組織樣品和細(xì)胞株中分離總RNA。任何存在的DNA通過(guò)在含1mM dNTP(Pharmacia),10URnasin(Pharmacia)，和2U的DNA酶(Promega Corporation,Madison,WT)的第一鏈緩沖液(25mMTris-HCl pH8.3,37.5mMKCL,1.5mMMgCl2和10mMDTT)中并加熱到37℃,30min孵育以除去。加熱到75℃,5min滅活DNA酶。取一樣品作為PCR的模板以證實(shí)無(wú)基因組DNA。以寡聚dT為引物((Gibco)，10U Rnasin(Pharmacia)，和1mMdNTP(Pharmacia))按照制造商說(shuō)明書(shū)，利用SuperscriptⅡ逆轉(zhuǎn)錄酶(100U MMLV,Gibco Life Technologies,Grand Island,N.Y.)自純化的RNA中合成cDNA。樣品在42℃孵育1小時(shí)。通過(guò)加熱樣品到75℃，15分鐘滅活酶。在PCR擴(kuò)增前cDNA樣品貯存在-20℃。
為檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞株(和人血管)中的SSTR亞型，在AppliedBiosystems Model391DNA合成儀上合成如下寡核苷酸引物
表2人SSTR引物
設(shè)計(jì)與其受體獨(dú)特區(qū)域雜交的SSTR-1,-2,-3,-4和-5引物對(duì)。利用2μ1cDNA在含1mM MgCl2(擴(kuò)增SSTR5的MgCl2為5mM),0.2mMdNTP(Pharmacia),5％DSMO(僅在擴(kuò)增SSTR5時(shí)加入)和100ng5′和3′引物和Taq聚合酶(1.25U,Gibco BRL)的25μl總體積的PCR緩沖液(67mM Tris pH9.01,1.5mM MgSO4,166mM AmSO4,10mM巰基乙醇)中進(jìn)行SSTR1-5的PCR反應(yīng)。擴(kuò)增反應(yīng)在RoboCycler Gradient96(Stratagene,LA Jolla,CA)上進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。每個(gè)循環(huán)組成為94℃，變性45秒，在各自適宜的退火溫度(見(jiàn)表2)下退火45秒，72℃延伸45秒。最后以72℃延伸5分鐘結(jié)束擴(kuò)增。通過(guò)1％瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物。用Eagle EyeⅡVideo System(Stratagene)觀察并拍攝DNA圖譜。從凝膠中分離應(yīng)用SSTR1,2和5的引物獲得的DNA片段并連接到pGEM-T載體(Stratagene,LaJolla,CA)中。利用T7測(cè)序酶(Pharmacia Biotech Inc.)以雙脫氧核苷酸鏈終止法測(cè)定亞克隆的DNA序列。應(yīng)用SSTR3和4的引物獲得的DNA片段從凝膠中洗脫后進(jìn)行診斷性限制消化分析以確認(rèn)該P(yáng)CR產(chǎn)物就是SSTR-3和-4。
為檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞中的vWF，利用寡核苷酸序列為5′-CCCACCCTTTGATGAACACA-3′的正向引物和5′-CCTCACTTGCTGCACTTCCT-3′的反向引物進(jìn)行PCR反應(yīng)以檢測(cè)von Willebrand’s(vWF)因子cDNA。在含2.0mM MgCl2,0.2mMdNTP(Pharmacia),5％DSMO和100ng 5′和3′引物，和Taq聚合酶(1.25U,Gibco BRL)的PCR緩沖液(20mMTris-HCl(pH8.4),50mMKCl)中進(jìn)行PCR反應(yīng)。在60℃的退火溫度下按上述方法進(jìn)行35個(gè)PCR循環(huán)。如上所述分離和觀察PCR產(chǎn)物。自凝膠中分離DNA片段并進(jìn)行診斷性限制消化分析以確認(rèn)該P(yáng)CR產(chǎn)物就是vWF。實(shí)施例3:SSTR1選擇性激動(dòng)劑對(duì)人內(nèi)皮細(xì)胞的作用現(xiàn)已闡明SS通過(guò)作用于SSTR1而調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的pH(Barber等，1989,J.Biol.Chem.264:21038)并且細(xì)胞內(nèi)pH又反過(guò)來(lái)調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維的產(chǎn)生(Tominaga等，1998,Mol.Biol.Cell.9:2287)。應(yīng)用熒光素標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽定位肌動(dòng)蛋白，本實(shí)施例描述了SS14和一種SSTR1選擇性激動(dòng)劑對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白成束的共同作用。
為確定SS14對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的作用，洗滌ECV304細(xì)胞以除去生長(zhǎng)培養(yǎng)基并加入新鮮的培養(yǎng)基(無(wú)血清)(1ml/孔)。在測(cè)試孔中加入SS14(10nM,Peninsula Laboratories；Belmont,CA)而對(duì)照孔僅加入等體積的培養(yǎng)基前，將細(xì)胞冷卻至4℃15分鐘以濃縮細(xì)胞膜上的SSTR。接著細(xì)胞在37℃孵育30分鐘，在4％PFA中固定5分鐘，在PBS中洗滌。將細(xì)胞與ALEXA-488偶聯(lián)的鬼筆環(huán)肽(1:50,Molecular ProbesInc.,Eugene,OR)在室溫共孵育15分鐘，以顯現(xiàn)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架。利用上述Zeiss Axiophot顯微鏡觀察細(xì)胞。采用同樣的方法評(píng)價(jià)SSTR1選擇性激動(dòng)劑對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的作用。
在對(duì)照ECV304細(xì)胞中觀察到大量橫跨整個(gè)細(xì)胞的應(yīng)力纖維而沒(méi)有觀察到多少片狀偽足。SS14處理的ECV304細(xì)胞表現(xiàn)出長(zhǎng)的應(yīng)力纖維喪失而且剩余的纖維短且缺乏定向組織。此外，在質(zhì)膜上片狀偽足的數(shù)目和大小有增加。除了這些形態(tài)學(xué)的改變外，由細(xì)胞內(nèi)pH呈像確定出SS14還表現(xiàn)對(duì)ECV304細(xì)胞上的Na/H交換器的抑制。這些結(jié)果提示探測(cè)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架或細(xì)胞內(nèi)pH的變化是跟蹤內(nèi)皮細(xì)胞上SS受體激活的快速和簡(jiǎn)單的方法。在一些實(shí)施方案中，這種試驗(yàn)也可以用來(lái)篩選SSTR1或SSTR2選擇性激動(dòng)劑。
以SSTR1′499激動(dòng)劑處理ECV304或HUVEC細(xì)胞產(chǎn)生了與以SS14處理這些細(xì)胞相似的結(jié)果。SSTR1′499處理的結(jié)果是應(yīng)力纖維的減少和片狀偽足形成的增加。以SSTR2選擇性激動(dòng)劑DC32-87(Raynor等，1993,Mol.Pharmacol43(6):838)處理ECV304或HUVEC細(xì)胞，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞沒(méi)有影響。實(shí)施例4人類內(nèi)皮組織與動(dòng)物組織中的SSTR在人類，以RT-PCR檢測(cè)表明，SSTR1,SSTR2和SSTR4(但不是SSTR3或SSTR5)的mRNA存在于正常的主動(dòng)脈，正常的內(nèi)乳動(dòng)脈，正常的隱靜脈，動(dòng)脈粥樣硬化的腘動(dòng)脈。在所有的正常內(nèi)皮組織中，SSTR1均有表達(dá)并且是最豐富的受體亞型。SSTR2和SSTR3的表達(dá)有更多變化，一些個(gè)體缺乏兩種中的一種亞型的表達(dá)。在正常組織內(nèi)，與SSTR1相比較，SSTR2和SSTR3的mRNA的豐度較低一些。
由旁路法，斷肢或與Pacific Organ Retrieval and TransplantSociety相關(guān)并得到英國(guó)哥倫比亞大學(xué)Ethical Committee on HumanExperimentation倫理學(xué)上允許的器官移植捐獻(xiàn)人收集人動(dòng)脈樣品(100-400mg)。收集正常靜脈N=6(大隱靜脈和胳膊靜脈)，動(dòng)脈N=5(主動(dòng)脈和內(nèi)乳動(dòng)脈)和動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)脈或動(dòng)脈瘤動(dòng)脈N=3。用來(lái)獲取這些結(jié)果的正常的組織如下2個(gè)正常的主動(dòng)脈樣品，其一來(lái)自42歲的女性，第二個(gè)來(lái)自19歲的男性；3個(gè)內(nèi)乳動(dòng)脈樣品，和3個(gè)隱靜脈樣品來(lái)自年齡為69-74歲的男性病人。在動(dòng)脈粥樣硬化腘動(dòng)脈中，SSTR1也是占主要的受體，SSTR2和SSTR4的水平不定，同樣沒(méi)有SSTR3或SSTR5存在的證據(jù)。3個(gè)腘動(dòng)脈樣品來(lái)源于68,72,73歲的男性病人。
此處分析的血管組織包括內(nèi)皮和非內(nèi)皮細(xì)胞。尤其是，非內(nèi)皮性平滑肌細(xì)胞組成脈管系統(tǒng)的實(shí)質(zhì)性成分。在主動(dòng)脈平滑肌原代細(xì)胞制備物中，檢測(cè)到SSTR1,SSTR2和SSTR4的mRNA，也檢測(cè)到vWF的mRNA和免疫染色(＜10％的細(xì)胞)，提示在這些細(xì)胞培養(yǎng)物中包含一些內(nèi)皮細(xì)胞。
綜合人內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)mRNA的表達(dá)分析結(jié)果(實(shí)施例2)，在本實(shí)施例中報(bào)道的結(jié)果提示在人血管組織中檢測(cè)到的SSTR2mRNA來(lái)源于該組織中的非內(nèi)皮細(xì)胞，而SSTR1和SSTR4的mRNA則來(lái)源于內(nèi)皮細(xì)胞。
應(yīng)用免疫組織化學(xué)檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞原位表達(dá)的SSTR1。正常和病變的血管內(nèi)皮細(xì)胞能夠被SSTR1而不是SSTR2抗體免疫染色。vWF因子的免疫反應(yīng)性(IR)局限于正常和病變血管的內(nèi)皮細(xì)胞。為進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)法將每種血管樣品的一小部分在4％福爾馬林(PFA)中固定1小時(shí)，利用封固在載玻片上的10μm恒冷箱切片和在PFA中固定10分鐘的培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。將兔抗人SSTR-1抗血清(1∶100)和抗SSTR2抗血清(1∶100)(CURE/Gastroenteric BiologyCenter Antibody/RIA Core,NIH grant DK41301)和抗vWF抗血清(Sigma；1∶1000)在切片或完整細(xì)胞上4℃孵育過(guò)夜。在PBS中洗滌除去多余的抗體后，用1∶1000的CY3綴合的驢抗兔IgG(JacksonImmuno Research Laboratories Inc.,West Grove,PA.)在室溫定位結(jié)合的抗體1小時(shí)。利用裝備落射熒光的Zeiss Axiophot顯微鏡掃描載玻片。應(yīng)用配備氪氬激光的Biorad MRC600激光共聚焦掃描顯微鏡數(shù)字化有代表性的切片，利用NIH圖像(共享儀器)將疊加的圖像轉(zhuǎn)化成最大強(qiáng)度的投影，并用Adobe Photoshop制作最后的圖象。
動(dòng)物模型的組織中SSTR試驗(yàn)的結(jié)果可能與上述人組織中的結(jié)果相反(見(jiàn)背景實(shí)施例Chen等，1997,J.Invest.Surg.10∶17)。在嚙齒動(dòng)物髂動(dòng)脈對(duì)照樣品中，沒(méi)有觀察到對(duì)SSTR1,2和3特異性抗血清的可檢測(cè)的免疫反應(yīng)性。但是，動(dòng)脈損傷后，在損傷處聚集的內(nèi)皮細(xì)胞表面觀察到SSTR-2免疫反應(yīng)性。通過(guò)用抗vWF的單克隆抗體進(jìn)行雙染色確定了SSTR2免疫反應(yīng)性細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞是相同的細(xì)胞。這種免疫組織化學(xué)的結(jié)果提示SSTR2是大鼠動(dòng)脈損傷模型中有活性的SS受體。利用特異于5種已知SSTR的引物進(jìn)行的RT-PCR證實(shí)了這種結(jié)果。該結(jié)果表明正常大鼠動(dòng)脈表達(dá)低水平的SSTR2和SSTR3，但不表達(dá)SSTR1,SSTR4或SSTR5。利用競(jìng)爭(zhēng)性PCR方法比較對(duì)照和損傷血管中SSTR2 mRNA的水平。應(yīng)用該方法的結(jié)果表明，在大鼠髂動(dòng)脈的囊部損傷7天后，SSTR2受體的表達(dá)水平有顯著地增加，繼后實(shí)驗(yàn)說(shuō)明這種增加可維持至損傷后長(zhǎng)達(dá)2月之久。這些動(dòng)物模型結(jié)果與angiopeptin抑制大鼠內(nèi)膜增生的能力以及SSTR1和SSTR4的選擇性激動(dòng)劑抑制人內(nèi)膜增生的能力是相符合的。
本發(fā)明提供包含SS激動(dòng)劑的藥學(xué)組合物(藥物)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該組合物包含足以改變，優(yōu)選地抑制γ-干擾素產(chǎn)生的治療或預(yù)防有效量的SS激動(dòng)劑化合物，以及藥學(xué)上可接受的載體。在另一實(shí)施方案中，該組合物包含足以抑制血管形成的治療或預(yù)防有效量的SS激動(dòng)劑化合物，和藥學(xué)上可接受的載體。
SSTR1和SSTR4選擇性激動(dòng)劑可以與其它的組合物以及治療疾病的方法配伍使用。例如，可以常規(guī)地將光動(dòng)力治療，外科手術(shù)，放療或化療與SSTR1或SSTR4選擇性激動(dòng)劑組合使用以治療腫瘤，然后可以將SSTR1或SSTR4選擇性激動(dòng)劑給予病人以延長(zhǎng)微小轉(zhuǎn)移灶的休眠期并穩(wěn)定和抑制任何殘余原發(fā)腫瘤的生長(zhǎng)。
“治療有效量”是指在劑量和所需的作用時(shí)間上能夠取得預(yù)期的治療結(jié)果的有效量，如減少或逆轉(zhuǎn)腫瘤中的血管形成，或減少或抑制內(nèi)膜增生的劑量。根據(jù)諸如個(gè)體疾病的狀態(tài)，年齡，性別和體重，以及在個(gè)體中SS激動(dòng)劑誘導(dǎo)預(yù)期反應(yīng)的能力，SS激動(dòng)劑的治療有效量是可改變的?？梢酝ㄟ^(guò)調(diào)節(jié)給藥方案以提供最佳的治療反應(yīng)。治療有效量同樣也是一種治療有益效應(yīng)超過(guò)SS激動(dòng)劑的任何毒性或有害效應(yīng)的劑量。
“預(yù)防有效量”是指在劑量和必需的作用時(shí)間上，能有效取得預(yù)期預(yù)防性結(jié)果，如防止或抑制腫瘤轉(zhuǎn)移率或內(nèi)膜增生發(fā)生的量。可以按照上述確定治療有效量的方法確定預(yù)防有效量。通常，由于在疾病發(fā)生之前或疾病的較早期使用預(yù)防有效量，因此預(yù)防有效量將低于治療有效量。
在具體的實(shí)施方案中，SSTR1或SSTR4選擇性激動(dòng)劑優(yōu)選的治療或預(yù)防有效量的范圍可以是0.1nM-0.1M,0.1nM-0.05M，0.05nM-15μM或0.01nM-10μM。可選擇地，每日的總劑量可能范圍在約0.001-1mg/kg病人體重。劑量值可以隨待緩解的病情嚴(yán)重程度變化。應(yīng)該進(jìn)一步理解，對(duì)于任何特殊的患者，特殊的給藥方案應(yīng)該根據(jù)個(gè)體的需要和管理或指導(dǎo)給予該組合物的人員的專業(yè)判斷不時(shí)地作出調(diào)整，此處列出的劑量范圍僅是例證性的，目的不是局限本發(fā)明方法的范圍或?qū)嵺`。
在治療組合物中活性SSTR選擇性激動(dòng)劑的量可依據(jù)如個(gè)體的疾病狀態(tài)，年齡，性別和體重等因素來(lái)改變?？梢酝ㄟ^(guò)調(diào)節(jié)給藥方案以產(chǎn)生最佳的治療反應(yīng)。例如，可以使用單個(gè)藥丸，或在一段時(shí)間內(nèi)使用數(shù)份劑量，或適應(yīng)緊急治療狀況劑量按比例減少或增加。制成便于給藥并且劑量均一的單位劑型的胃腸外組合物是特別有益的。此處使用的單位劑型是指適于單元?jiǎng)┝康奈锢砩想x散的單位，每個(gè)單位包含預(yù)計(jì)能夠產(chǎn)生預(yù)期治療效果的預(yù)定量活性化合物以及所需的藥學(xué)載體。本發(fā)明劑型單位的規(guī)格直接取決于(a)活性化合物的獨(dú)特特性和欲取得的特定治療效果，和(b)組合這種用于治療個(gè)體敏感性的活性化合物領(lǐng)域中固有的局限性。
此處用到的“藥學(xué)可接受的載體”或“賦形劑”包括生理相容的任何和全部溶劑，分散介質(zhì)，包衣，抗細(xì)菌和抗真菌試劑，等滲劑和延緩吸收劑等。在一個(gè)實(shí)施方案中，該載體適宜胃腸外給藥?？蛇x擇地，該載體可以適用于靜脈內(nèi)，腹膜內(nèi)，肌內(nèi)，舌下給藥或口服。藥學(xué)上可接受的載體包括無(wú)菌水溶液或分散液以及用于臨時(shí)制備無(wú)菌可注射的溶液或分散液的無(wú)菌粉。這種藥學(xué)上有活性物質(zhì)的介質(zhì)和試劑的應(yīng)用在本領(lǐng)域是眾所周知的。除去與該活性化合物不兼容的任何常規(guī)的介質(zhì)和試劑，它們?cè)诒景l(fā)明藥學(xué)組合物中的使用均涵蓋在內(nèi)，其它的活性化合物也可摻入該組合物中。
治療性組合物一般必需是無(wú)菌的，并且在制造和貯存的條件下是穩(wěn)定的。該組合物可以配制成溶液，微乳劑，脂質(zhì)體或與高藥物濃度相宜的其它有序的結(jié)構(gòu)。該載體可以是一種溶劑或分散介質(zhì)，其中包括例如水，乙醇，多元醇(例如，甘油，丙二醇和液體聚乙二醇等)，和其適宜的混合物。合適的流動(dòng)性可以通過(guò)例如使用諸如卵磷脂的包衣，維持分散液中所需的顆粒大小以及使用表面活性劑來(lái)維持。在許多情況下，在組合物中優(yōu)選地包含等滲劑，例如，糖，多元醇，諸如甘露醇，山梨醇或氯化鈉。通過(guò)在組合物中包含一種能夠延遲吸收的試劑例如，單硬脂酸鹽和明膠，可以制備延長(zhǎng)吸收的可注射組合物。而且，SS激動(dòng)劑能夠以時(shí)間釋放形式給藥，例如通過(guò)在包含緩釋多聚體的組合物中完成給藥?；钚曰衔锬軌蚺c防止該化合物迅速釋放的載體一起制備，這種控釋制劑，包括植入體和微囊化的傳送系統(tǒng)?？梢允褂蒙锟山到獾纳锵嗳莸亩嗑垠w，如乙烯乙酸乙烯酯，聚酸酐類，聚乙醇酸，膠原，聚原酸酯，聚乳酸和乳酸-乙醇酸共聚物(PLG)。制備這種制劑的許多方法已申請(qǐng)專利或通常被本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知。
通過(guò)向適宜的溶劑中摻入需要量的活性化合物(例如SS激動(dòng)劑)和上述一種或多種成分(如果必要)，接著過(guò)濾滅菌，可以制備無(wú)菌注射液。通常，通過(guò)將活性化合物摻入包含基本分散介質(zhì)和所需的上述其它成分的無(wú)菌載體中而制備分散液。至于用于制備無(wú)菌的可注射溶液的無(wú)菌粉末，優(yōu)選制備方法是真空干燥和凍干，從而由事先已過(guò)濾滅菌溶液得到活性成分與其它所需成分的粉末。依據(jù)本發(fā)明的一個(gè)可選擇的方面，SS激動(dòng)劑可以與一種或多種能夠增加SS激動(dòng)劑溶解性的其它化合物一起配制。
另外一種給藥形式是眼部給藥。SSTR1或SSTR4選擇性激動(dòng)劑可以由藥學(xué)上可接受的眼用載體送遞，從而使該化合物與眼睛表面的接觸持續(xù)足夠的時(shí)間，以允許該化合物滲入角膜和眼睛內(nèi)部區(qū)域，如前房，后房，玻璃體，眼房水，玻璃體液，角膜，虹膜/睫狀體，晶狀體，脈絡(luò)膜/視網(wǎng)膜，鞏膜。藥學(xué)可接受的眼用載體可以，例如，是一種軟膏，植物油或包裹材料?？蛇x擇的，本發(fā)明的化合物可直接注入玻璃體液和眼房水內(nèi)。在另外的選擇中，該化合物可以被系統(tǒng)地給藥，例如通過(guò)靜脈內(nèi)灌輸或注射，用來(lái)治療眼睛。在一些實(shí)施方案中，以SSTR1或SSTR4激動(dòng)劑進(jìn)行的抗血管形成處理可以在光動(dòng)力治療后實(shí)施(如1998年8月25日出版的U.S.5,798,349中描述的，在此引用作為參考)。
根據(jù)本發(fā)明的另外一個(gè)方面，本發(fā)明的包含SSTR1或SSTR4選擇性激動(dòng)劑的治療性組合物，可以裝在帶有有關(guān)用SSTR1或SSTR4選擇性激動(dòng)劑治療內(nèi)皮細(xì)胞介導(dǎo)的增殖性疾病的說(shuō)明書(shū)標(biāo)簽的容器中。
權(quán)利要求
1．SSTR1或SSTR4選擇性激動(dòng)劑在制備用于治療內(nèi)皮細(xì)胞介導(dǎo)的增殖性疾病的藥物中的應(yīng)用。
2．SSTR1或SSTR4選擇性激動(dòng)劑在制備用于治療人患者中內(nèi)皮細(xì)胞介導(dǎo)的增殖性疾病的藥物中的應(yīng)用。
3．根據(jù)權(quán)利要求1或2的SSTR1或SSTR4選擇性激動(dòng)劑的應(yīng)用，其中內(nèi)皮細(xì)胞介導(dǎo)的增殖性疾病是內(nèi)膜增生。
4．根據(jù)權(quán)利要求1或2的SSTR1或SSTR4選擇性激動(dòng)劑的應(yīng)用，其中內(nèi)皮細(xì)胞介導(dǎo)的增殖性疾病是血管形成疾病。
5．根據(jù)權(quán)利要求4的SSTR1或SSTR4選擇性激動(dòng)劑的應(yīng)用，其中血管形成疾病是年齡相關(guān)的黃斑變性。
6．根據(jù)權(quán)利要求4的SSTR1或SSTR4選擇性激動(dòng)劑的應(yīng)用，其中血管形成疾病是實(shí)體瘤。
7．根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的SSTR1或SSTR4選擇性激動(dòng)劑的應(yīng)用，其中所述SSTR1或SSTR4選擇性激動(dòng)劑是des-AA1,2,5[DTrp8，IAamp9]SS。
8．根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的SSTR1或SSTR4選擇性激動(dòng)劑的應(yīng)用，其中所述SSTR1或SSTR4選擇性激動(dòng)劑是SSTR1選擇性激動(dòng)劑。
9．根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的SSTR1或SSTR4選擇性激動(dòng)劑的應(yīng)用，其中所述SSTR1或SSTR4選擇性激動(dòng)劑是SSTR4選擇性激動(dòng)劑。
10．一種治療內(nèi)皮細(xì)胞介導(dǎo)的增殖性疾病的方法，包括給有此需要的人患者施用治療有效量的SSTR1或SSTR4選擇性激動(dòng)劑。
11．根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中內(nèi)皮細(xì)胞介導(dǎo)的增殖性疾病是內(nèi)膜增生。
12．根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中內(nèi)皮細(xì)胞介導(dǎo)的增殖性疾病是血管形成疾病。
13．根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中血管形成疾病是年齡相關(guān)的黃斑變性。
14．根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中血管形成疾病是實(shí)體瘤。
15．根據(jù)權(quán)利要求10-14中任一項(xiàng)的方法，其中SSTR1或SSTR4選擇性激動(dòng)劑是des-AA1,2,5[DTrp8，IAamp9]SS。
16．根據(jù)權(quán)利要求10-14中任一項(xiàng)的方法，其中SSTR1或SSTR4選擇性激動(dòng)劑是SSTR1選擇性激動(dòng)劑。
17．根據(jù)權(quán)利要求10-14中任一項(xiàng)的方法，其中SSTR1或SSTR4選擇性激動(dòng)劑是SSTR4選擇性激動(dòng)劑。
18．一種抑制血管形成的方法，包括給有此需要的人患者施用治療有效量的SSTR1或SSTR4選擇性激動(dòng)劑。
19．一種抑制內(nèi)膜增生的方法，包括給有此需要的人患者施用治療有效量的SSTR1或SSTR4選擇性激動(dòng)劑。
20．用于治療內(nèi)皮細(xì)胞介導(dǎo)的增殖性疾病的組合物，其中包含SSTR1或SSTR4選擇性激動(dòng)劑以及藥學(xué)可接受的載體。
21．一種調(diào)節(jié)人內(nèi)皮細(xì)胞的方法，包括用有效量的SSTR1或SSTR4選擇性激動(dòng)劑處理所述細(xì)胞。
22．根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中對(duì)人內(nèi)皮細(xì)胞的活性進(jìn)行調(diào)節(jié)以抑制血管形成。
23．根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中對(duì)人內(nèi)皮細(xì)胞的活性進(jìn)行調(diào)節(jié)以便對(duì)該細(xì)胞產(chǎn)生與促生長(zhǎng)素抑制素相同的作用。
全文摘要
本發(fā)明提供了利用SSTR1或SSTR4選擇性激動(dòng)劑治療人內(nèi)皮細(xì)胞和配制人用藥物的應(yīng)用,其中該藥物可以用來(lái)治療內(nèi)皮細(xì)胞介導(dǎo)的增殖性疾病。SSTR1或SSTR4選擇性激動(dòng)劑治療內(nèi)皮細(xì)胞介導(dǎo)的增殖性疾病的應(yīng)用可以包含,例如,內(nèi)膜增生或血管增殖疾病的治療。在不同的實(shí)施方案中,血管增殖病可能是例如黃斑變性,或?qū)嶓w瘤。SSTR1或SSTR4選擇性激動(dòng)劑可以包含SSTR1′499激動(dòng)劑(des－AA
文檔編號(hào)A61P27/00GK1320042SQ99811513
公開(kāi)日2001年10月31日 申請(qǐng)日期1999年9月1日 優(yōu)先權(quán)日1998年9月1日
發(fā)明者Y·希桑, A·布昌, J·G·萊維, P·M·C·瑪佳隆 申請(qǐng)人:不列顛哥倫比亞大學(xué), Qlt公司