專利名稱：硅膠柱層析分離大黃酚和大黃素甲醚的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中草藥成分提取與分離，更確切地說(shuō)涉及髙純度大黃酚和大 黃素甲醚的分離方法。
背景技術(shù)：
大黃酚和大黃素甲醚屬于蒽醌類化合物，是天然存在于多種中藥中的兩 種有效成分，如大黃、虎杖、決明子、何首烏等中藥均含有該兩種游離蒽醌 苷元或與糖結(jié)合的蒽醌苷類。大黃酚具有止血、抗衰老的作用，還具有對(duì) A1C13致急性衰老小鼠記憶障礙的保護(hù)作用及抗常壓缺氧、急性腦缺氧和提 高機(jī)體耐力的作用。大黃酚經(jīng)氧化可制成大黃酸，再經(jīng)乙?；芍瞥呻p醋瑞 因，后者是治療骨關(guān)節(jié)炎的重要藥品原料。大黃素甲醚對(duì)人體宮頸癌Hela 細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用較強(qiáng)，還可有效抑制ICAM-1和caspase-3的表達(dá)，減輕 腦出血血腫周圍組織損傷。大黃酚和大黃素甲醚極性相近，酸堿度也相近， 對(duì)其混合物的分離比較困難。
目前對(duì)其分離方法研究有不少報(bào)道，包括纖維素粉柱、磷酸氫鈣柱、硅 膠干柱層析、離心薄層分離及硅膠柱層析等，雖均有一定特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)，但缺 點(diǎn)也十分明顯，如纖維素粉難制備，商品纖維素粉價(jià)髙，磷酸氫鈣需要用酸 調(diào)至合適pH值，處理麻煩且不易常握最佳條件，硅膠干柱層析與離心薄層 制備量十分有限?，F(xiàn)有的硅膠柱層析分離方法中使用最多的洗脫劑為石油醚 與石油醚/醋酸乙酯系統(tǒng)，單純以石油醚洗脫雖可獲得不錯(cuò)的分離效果，但 由于石油醚極性過(guò)小，洗脫時(shí)間大大延長(zhǎng)，生產(chǎn)效率低下，而石油醚/醋酸 乙酯系統(tǒng)對(duì)大黃酚和大黃素甲醚的分離效果很差，載樣量小，無(wú)法批量制備。
王定勇等于《廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)》2007年10月25巻5期報(bào)道了一種高 效分離大黃酚和大黃素甲醚的簡(jiǎn)便方法，釆用硅膠柱色譜進(jìn)行分離，在以 工業(yè)級(jí)柱層析硅膠(100 200目)為填充劑的色譜柱上，以石油醚乙酸乙 酯甲酸(體積比100 : 1 : 0.5)為洗脫劑，可以將大黃酚和大黃素甲醚完全分 離。硅膠柱層析中分離大黃酚與大黃素甲醚時(shí)于石油醚/醋酸乙酯中加入少 量甲酸或醋酸確實(shí)可以明顯改善分離效果，但甲酸與醋酸沸點(diǎn)均很髙，與石 油醚/醋酸乙酯沸點(diǎn)相差大，溶劑回收后三者之間的比例變化較大，不利于 回收溶劑的再利用，另外本方法洗脫劑中含有酸，對(duì)色譜柱和回收設(shè)備要求
3耐酸腐蝕，而工業(yè)生產(chǎn)常用不銹鋼設(shè)備，故本方法僅適用于試驗(yàn)室小量制備， 無(wú)法適應(yīng)工業(yè)化大量生產(chǎn)。
中國(guó)專利申請(qǐng)CN1594261的專利"一種髙純度大黃素甲醚和大黃酚的 制備方法"公開(kāi)了一種髙速逆流色譜法(HSCCC)從中藥大黃中分離髙純度大 黃素甲醚和大黃酚的制備方法，但本方法需要的髙速逆流色譜儀價(jià)格昂貴， 最佳分離條件需要反復(fù)摸索而得，制備量也十分有限，難以推廣應(yīng)用。
中國(guó)專利授權(quán)公告CN1310164的專利"一種分離大黃素甲醚和大黃酚 的方法"公開(kāi)了一種根椐酸堿質(zhì)子理論的原理，選擇適宜的溶劑，使大黃素 甲醚和大黃酚之間的Pka之差加大，進(jìn)而用pH梯度萃取法使二者達(dá)到良好 的分離的方法。但該方法大量使用強(qiáng)酸、強(qiáng)堿及有機(jī)溶劑萃取，勢(shì)必對(duì)環(huán)境 造成較大污染，并且萃取次數(shù)多，容易乳化，萃取過(guò)程成分的交叉很難避免， 產(chǎn)品純度必然受到影響。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種硅膠柱層析分離大黃酚和大黃素甲醚的方法， 克服現(xiàn)有分離大黃酚和大黃素甲醚生產(chǎn)工藝存在的缺點(diǎn)，以及無(wú)法滿足藥理 活性的篩選與臨床應(yīng)用需求的缺陷，是一種工藝簡(jiǎn)便，適合工業(yè)化批量生產(chǎn) 的生產(chǎn)工藝。
本發(fā)明的技術(shù)方案是
采用硅膠柱，用商品硅膠填充柱或自裝柱，常壓分離采用100-300目粒 徑的硅膠，干法裝柱或與石油醚攪拌均勻，去除氣泡后濕法裝柱，用石油醚 洗脫平衡好備用。選用粒徑更細(xì)的硅膠可獲得更好的分離效果，如硅膠H和 硅膠G，但需要柱前加壓，采用低壓或中壓，或柱后真空減壓，以提高流速。 通過(guò)對(duì)含兩種游離蒽醌苷元或與糖結(jié)合的蒽醌苷類的中藥直接提取或?qū)⑤?醌苷水解后提取得到大黃酚與大黃素甲醚混合物，將其用溶劑，如丙酮、氯 仿、醋酸乙酯等溶解與硅膠拌樣，并揮干溶液劑后上樣，或用低極性溶劑， 如石油醚溶解直接進(jìn)樣，根據(jù)選用硅膠粒徑的不同，采用常用、低壓、中壓 或柱后真空減壓，先用石油醚洗脫極性小于大黃酚的雜質(zhì)，再用石油醚/醋 酸丁酯，比例為100/0.1~10/1洗脫大黃酚與大黃素甲醚，薄層層析跟蹤檢測(cè)， 相同流份合并，依次分離得到大黃酚與大黃素甲醚，分別經(jīng)結(jié)晶與重結(jié)晶得 到純品。
4產(chǎn)品檢測(cè)使用髙效液相色譜儀，紫外檢測(cè)器。ds-ODS柱；流動(dòng)相甲 醇-水(85:15):流速1.0ml/min;樣品進(jìn)樣濃度約0.1mg/ml，進(jìn)樣量為 1011 1，大黃酚與大黃素甲醚混合物采用外標(biāo)法進(jìn)行定量分析。大黃酚與大 黃素甲醚的純度分析采用峰面積歸一化法檢測(cè)。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是
1、 本發(fā)明硅膠柱層析中采用的洗脫劑石油醚/醋酸丁酯較石油醚/醋酸乙 酯系統(tǒng)分離效果好，載樣量大。
2、 本發(fā)明方法中的洗脫劑可反復(fù)回收利用，成本低廉。中國(guó)專利授權(quán) 公告號(hào)為CN1310164的專利中列出成本核算，制備1克大黃素甲醚的材料 與試劑成本約需200元人民幣，而采用本發(fā)明方法，同等的材料成本，以分 析純?cè)噭┯?jì)算，可分出3克以上的大黃素甲醚和IO克以上的大黃酚，材料 成本優(yōu)勢(shì)明顯，而時(shí)間也僅需2-4天。
3、 本發(fā)明方法所用洗脫劑安全、低毒、可重復(fù)利用，有利于操作人員 的勞動(dòng)保護(hù)和環(huán)境保護(hù)。
4、 本發(fā)明工藝路線簡(jiǎn)化易操作，可實(shí)現(xiàn)從實(shí)驗(yàn)室小量制備到工業(yè)化批 量生產(chǎn)。
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 大黃酚和大黃素甲醚混合物的制備
取大黃粉15kg，加10倍量20%硫酸，于水浴上加熱3小時(shí)，過(guò)濾，濾
餅水洗至近中性后7ox:干燥。取干燥后粉末用乙酸乙酯分?jǐn)?shù)次加熱回流提盡
總游離蒽醌，回收乙酸乙酯液得總游離蒽醌580g，以丙酮溶解，將其與600 克硅膠(100-200目)拌樣，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干溶劑，取出，60C干燥， 研細(xì)，過(guò)80目篩，上硅膠短粗柱(1.2kg硅膠，100-200目，干法裝柱)，用 氯仿快速洗脫，回收氯仿，得大黃酚和大黃素甲醚混合物230克。產(chǎn)品分析 使用島津髙效液相色譜儀，LC-10ATvp溶劑輸送泵，SPD-10Avp紫外-可見(jiàn) 檢測(cè)器。HW-2000色譜工作站(上海千譜軟件有限公司)。色譜柱Shim-pack VP-ODS柱(150X4.6mm, 5拜)；甲醇-水(85:15);檢測(cè)波長(zhǎng)254nrn: 流速1.0ml/mhi;靈敏度0.02AUFS。樣品進(jìn)樣濃度約O.lmg/ml,進(jìn)樣量 為lOlil，采用外標(biāo)法進(jìn)行定量分析，結(jié)果測(cè)得混合物中大黃酚含量為68.1%、大黃素甲醚含量為20.6%
實(shí)施例2 大黃酚和大黃素甲醚的常壓硅膠柱層析分離 取實(shí)施例1制備的大黃酚和大黃素甲醚混合物50克，以氯仿溶解，將 其與50克硅膠(100-200目)拌樣，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干溶劑，取出，60 'C干燥，研細(xì)，過(guò)80目，備用。另取200-300目的硅膠2kg,與石油醚(60 90° )攪拌均勻，去除氣泡后濕法裝柱，用石油醚(60 90° )洗脫平衡， 上樣，先用石油醚洗脫極性小于大黃酚的雜質(zhì)，再用石油醚(60 90° ) / 醋酸丁酯，比例為100/0.5 30/1梯度洗脫，硅膠薄層層析跟蹤檢測(cè)，展開(kāi) 劑為石油醚(60 90° ):醋酸丁酯(20: 1)，日光下檢視，相同流份合并， 依次分離得到大黃酚與大黃素甲醚，大黃酚用醋酸乙酯結(jié)晶與重結(jié)晶，得金 黃色六角型片狀結(jié)晶純品26.3g,大黃素甲醚分別用甲醇與丙酮結(jié)晶與重結(jié) 晶，得金黃色針晶純品7.6g。純度檢測(cè)采用髙效液相色譜峰面積歸一化法測(cè) 定，具體色譜條件同實(shí)施例1,測(cè)得大黃純度為99.8%，大黃素甲醚純度為 99.2%。以上總共消耗石油醚(60 90° ) 15.5升(含可再次利用的石油醚/ 醋酸丁酯混合物6.5升)、醋酸丁酯500ml。所用時(shí)間為4天。 實(shí)施例3 大黃酚和大黃素甲醚的低壓硅膠柱層析分離 取實(shí)施例1制備的大黃酚和大黃素甲醚混合物10克，以氯仿溶解，將 其與10克硅膠(200-300目)拌樣，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干溶劑，取出，60 "干燥，研細(xì)，過(guò)100目篩，備用。另取500g硅膠H,與石油醚(60 90 ° )攪拌均勻，去除氣泡后濕法裝柱，用石油醚(60 90° )洗脫平衡，上 樣，球型加液球加入洗脫液，用氮?dú)馄考訅?，壓力? 3kPa，先用石油醚 洗脫極性小于大黃酚的雜質(zhì)，再改用石油醚(60 90° )/醋酸丁酯，比例為 100/1 20/1梯度洗脫，硅膠薄層層析跟蹤檢測(cè)，展開(kāi)劑為石油醚(60 90 ° ):醋酸丁酯(20: 1)，日光下檢視，相同流份合并，依次分離得到大黃 酚與大黃素甲醚，大黃酚用丙酮結(jié)晶與重結(jié)晶，得金黃色六角型片狀結(jié)晶純 品5.5g,大黃素甲醚用丙酮結(jié)晶與重結(jié)晶，得金黃色針晶純品1.4g。純度檢 測(cè)采用高效液相色譜峰面積歸一化法測(cè)定，具體色譜條件同實(shí)施例l，測(cè)得 大黃純度為99.5%，大黃素甲醚純度為99.4%。以上總共消耗石油醚(60 90° )6升(含可再次利用的石油醚/醋酸丁酯混合物1.5升)、醋酸丁酯250ml。 所用時(shí)間為3天。實(shí)施例4 大黃酚和大黃素甲醚的真空減壓硅膠柱層析分離 取實(shí)施例1制備的大黃酚和大黃素甲醚混合物5克，以氯仿溶解，將其 與5克硅膠(200-300目)拌樣，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干溶劑，取出，60'C干 燥，研細(xì)，過(guò)100目篩，備用。另取200g硅膠H,與石油醚(60 90° ) 攪拌均勻，裝入500ml垂容漏斗內(nèi)，置抽濾瓶上，抽濾瓶以橡皮管連接真空 泵，真空減壓抽干溶劑，壓實(shí)，硅膠表面壓平后上樣，樣品上平鋪20克200-300 目的硅膠，壓實(shí)，加一張大小適宜的圓型濾紙，先用石油醚真空減壓洗脫極 性小于大黃酚的雜質(zhì)，再分別用石油醚(60 90° )/醋酸丁酯，100: 1、 50: 1、 30: 1、 20: l真空減壓梯度洗脫，硅膠薄層層析跟蹤檢測(cè)，展開(kāi)劑為石 油醚(60 90° ):醋酸丁酯(10: 1)，日光下檢視，相同流份合并，依次 分離得到大黃酚與大黃素甲醚，大黃酚用乙酸乙酯結(jié)晶與重辮晶，得金黃色 六角型片狀結(jié)晶純品2.2g,大黃素甲醚用丙酮結(jié)晶與重結(jié)晶，得金黃色針晶 純品0.65g。純度檢測(cè)采用髙效液相色譜峰面積歸一化法測(cè)定，具體色譜條 件同實(shí)施例l,測(cè)得大黃純度為99.4%，大黃素甲醚純度為99.1%。以上總 共消耗石油醚(60 90° ) 2000ml、醋酸丁酯100ml。從裝柱至樣品全部洗 脫完畢僅用時(shí)6小時(shí)。
權(quán)利要求
1.一種硅膠柱層析分離大黃酚和大黃素甲醚的方法，包括將硅膠裝柱，或取商品硅膠填充柱，將含大黃酚與大黃素甲醚混合物的樣品用溶劑溶解與硅膠拌樣，并揮干溶劑后上樣，或用低極性溶劑溶解直接進(jìn)樣，在適宜壓力下，先用石油醚洗脫極性小于大黃酚的雜質(zhì)，再用石油醚/醋酸丁酯，比例為100/0.1～10/1洗脫大黃酚與大黃素甲醚，薄層層析跟蹤檢測(cè)，相同流份合并，依次分離得到大黃酚與大黃素甲醚，分別經(jīng)結(jié)晶與重結(jié)晶得到純品。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的硅膠柱層析分離大黃酚和大黃素甲醚的方法， 其特征在于適宜壓力為常壓、低壓、中壓、真空減壓。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種硅膠柱層析分離大黃酚和大黃素甲醚的方法，包括將硅膠裝柱，或取商品硅膠填充柱，將含大黃酚與大黃素甲醚混合物的樣品用溶劑溶解與硅膠拌樣，并揮干溶劑后上樣，或用低極性溶劑溶解直接進(jìn)樣，在適宜壓力下，先用石油醚洗脫極性小于大黃酚的雜質(zhì)，再用石油醚/醋酸丁酯，比例為100/0.1～10/1洗脫大黃酚與大黃素甲醚，薄層層析跟蹤檢測(cè)，相同流份合并，依次分離得到大黃酚與大黃素甲醚，分別經(jīng)結(jié)晶與重結(jié)晶得到純品。本發(fā)明方法載樣量大，分離效率高，所采用洗脫劑安全、環(huán)保，可反復(fù)回收利用，成本低廉，既適用于試驗(yàn)室少量制備，又可實(shí)現(xiàn)大批量工業(yè)化生產(chǎn)，所得大黃酚和大黃素甲醚純度均達(dá)99％以上，可作為中藥化學(xué)對(duì)照品使用，或作為醫(yī)藥及化工原料應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61P35/00GK101560145SQ20091011542
公開(kāi)日2009年10月21日 申請(qǐng)日期2009年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月21日
發(fā)明者揚(yáng) 盧, 周一君, 增 楊, 石榮火, 榮 陸 申請(qǐng)人:雷允上藥業(yè)有限公司