專利名稱：一種誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化為成骨細(xì)胞的方法
一種誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化為成骨細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化為成骨細(xì)胞的方法，具體而言，是一種使用具有半通透型支架隔離系統(tǒng)的培養(yǎng)小室，定向誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
近年來研究表明，成熟細(xì)胞在體外擴(kuò)增困難，并且會很快老化進(jìn)而失去增殖能力。 干細(xì)胞具有自我復(fù)制的能力以及向一種或多種成熟細(xì)胞分化的特征。因此體外培養(yǎng)干細(xì)胞可以作為組織工程學(xué)等生物研究種子細(xì)胞的新來源。干細(xì)胞分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞具有全能性，可以分化成各種類型的細(xì)胞，但存在倫理問題和瘤化風(fēng)險(xiǎn)，因此應(yīng)用受到了限制。成體干細(xì)胞取材方便、來源廣泛，也可以分化成多種類型的細(xì)胞，且培養(yǎng)誘導(dǎo)容易，因此更加適合作為臨床應(yīng)用的種子細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞作為成體干細(xì)胞的一種，因?yàn)槠浞蛛x培養(yǎng)技術(shù)最為成熟，目前應(yīng)用最為廣泛。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSC)是干細(xì)胞家族的重要成員，來源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層。MSC最初在骨髓中發(fā)現(xiàn)，因其具有多向分化潛能、造血支持和促進(jìn)干細(xì)胞植入、免疫調(diào)控和自我復(fù)制等特點(diǎn)而日益受到人們的關(guān)注。如間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)或體外特定的誘導(dǎo)條件下，可分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、神經(jīng)、肝、心肌、內(nèi)皮等多種組織細(xì)胞，連續(xù)傳代培養(yǎng)和冷凍保存后仍具有多向分化潛能，可作為理想的種子細(xì)胞用于衰老和病變引起的組織器官損傷修復(fù)。
目前，實(shí)現(xiàn)MSCs細(xì)胞的誘導(dǎo)分化主要包括采用化學(xué)因子誘導(dǎo)、添加特定的細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)入特定基因等方法。這些方法存在比較明顯的缺陷，添加的化學(xué)因子，對細(xì)胞有一定的毒副作用，使細(xì)胞生長減緩，細(xì)胞內(nèi)部產(chǎn)生一系列不易被檢測到的變化細(xì)胞因子成本較高，只是幾種細(xì)胞因子的組合，并不一定是最適的組合，同時(shí)由于細(xì)胞因子添加的比例不合適可能會引發(fā)眾多的不相關(guān)生化反應(yīng)；轉(zhuǎn)基因技術(shù)本身成本過高，同時(shí)，會在細(xì)胞內(nèi)引入多余的基因，改造過的細(xì)胞的安全性得不到保障。還有人使用如成骨細(xì)胞和MSCs直接共培養(yǎng)的方法來誘導(dǎo)分化，這種方法難于實(shí)現(xiàn)大規(guī)模誘導(dǎo)，誘導(dǎo)用細(xì)胞一次性消耗，需要不斷培養(yǎng)用于誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞，同時(shí)誘導(dǎo)出的細(xì)胞是混雜的細(xì)胞，沒辦法得到純化的誘導(dǎo)細(xì)胞。
對于細(xì)胞和細(xì)胞間的相互作用以及共培養(yǎng)誘導(dǎo)細(xì)胞定向分化的研究技術(shù)，本領(lǐng)域有很多相關(guān)的報(bào)道，例如，Transwell技術(shù)即是現(xiàn)有的較為常見的細(xì)胞共培養(yǎng)定向誘導(dǎo)技術(shù)，Transwell技術(shù)的核心是利用一類有通透性的杯狀的裝置,例如膜濾器(Membrane filters)、通透性的支架(permeable supports)等,研究不同細(xì)胞之間的相互作用，以及定向誘導(dǎo)的情況，該技術(shù)廣泛的應(yīng)用在如趨化性實(shí)驗(yàn)、腫瘤細(xì)胞的遷徙、侵潤的實(shí)驗(yàn)等具體的工作中。
但是，將這種這一技術(shù)應(yīng)用于間充質(zhì)干細(xì)胞的定向誘導(dǎo)或定向分化中，目前尚未見有系統(tǒng)性的研究工作。利用小室技術(shù)來誘導(dǎo)MSC細(xì)胞定向分化，需要確定以下問題在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中是否要添加細(xì)胞因子、激素、小分子化合物或特殊成分；還要確定最佳的誘導(dǎo)比例，即目標(biāo)細(xì)胞與MSC細(xì)胞的比例；誘導(dǎo)時(shí)間的長短。
本發(fā)明使用成骨細(xì)胞作為底層細(xì)胞，MSCs作為內(nèi)層細(xì)胞，利用Transwell小室進(jìn)行共培養(yǎng)，最大限度上的減少培養(yǎng)基中特異添加物，只需要共培養(yǎng)8-10天就可得到生長旺盛的誘導(dǎo)細(xì)胞。發(fā)明內(nèi)容
具體而言，本發(fā)明涉及一種通過transwell技術(shù)對間充質(zhì)干細(xì)胞的進(jìn)行定向誘導(dǎo)，促使其向成骨細(xì)胞分化的方法。
本發(fā)明所述的培養(yǎng)MSC細(xì)胞并將其誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞的方法中，所述的MSC細(xì)胞和誘導(dǎo)用成骨細(xì)胞可以是自體來源，也可以是異體來源。
具體而言，本發(fā)明所述的培養(yǎng)MSC細(xì)胞并將其誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞的方法為
步驟1、MSC細(xì)胞的獲取與穩(wěn)定培養(yǎng)。
無菌條件下，采健康人紅骨髓，等體積加入含肝素鈉(O. I I. 5mg/ml)的生理鹽水，充分混勻，輕輕加入到密度為I. 077g/mL的Ficol溶液上(Sigma，USA)，1500 2500r/ min，離心20 40min，收集離心管中部云霧狀的單個(gè)核層細(xì)胞層，用PBS (pH7. 2 7. 4)洗兩遍。
按照O. 5 2xl06cells/瓶，接種上述步驟中獲得的細(xì)胞到75cm2培養(yǎng)瓶中， DMEM(含10%胎牛血清FCS)，37°C 5% CO2，培養(yǎng)。培養(yǎng)傳代至P3代，流式檢測、鑒定MSC純度。
步驟2、成骨細(xì)胞的獲取與培養(yǎng)
取手術(shù)獲得的骨標(biāo)本，室溫?zé)o菌生理鹽水沖洗數(shù)次切下骨小梁，洗數(shù)次除去血污及脂肪，把骨小梁切成l_3mm3的碎塊，加入IOml Ham’s F12培養(yǎng)基，37°C 5% CO2，培養(yǎng)5_7 天，細(xì)胞長滿后可以去除組織塊，用胰酶消化收集細(xì)胞，傳代培養(yǎng)。
步驟3、誘導(dǎo)MSC定向分化為成骨細(xì)胞
Transwell 選用聚碳酯膜(PC),孔徑 O. 4 3. O μ m,優(yōu)選 3. O μ m, Transwell 嵌套直徑可根據(jù)實(shí)際需要設(shè)定，可以是適配96孔板、48孔板、24孔板、12孔板或6孔板的系統(tǒng)， 優(yōu)選適配6孔板的24_直徑，培養(yǎng)板也可根據(jù)實(shí)際需要設(shè)定，優(yōu)選為6孔板。(產(chǎn)品來自 Corning公司)。接種前先用培養(yǎng)基DMEM含10% FCS將小室浸潤37°C、Ih。
將上述步驟I獲得的P3代MSCs細(xì)胞接種于嵌套內(nèi)，接種細(xì)胞量根據(jù)實(shí)際的小室培養(yǎng)面積設(shè)定為O. 05 10xl04cell/孔,接種密度I 3xl05cell/ml,對于優(yōu)選的適配6孔板的transwell系統(tǒng)，MSCs細(xì)胞接種量為2 IOxlO4個(gè)/孔，優(yōu)選為4xl04個(gè)/孔，。
將上述步驟2獲得的成骨細(xì)胞接種于作為底層細(xì)胞外室，接種細(xì)胞量根據(jù)實(shí)際的培養(yǎng)孔培養(yǎng)面積設(shè)定為O. 05 10X104cell/孔，對于優(yōu)選的6孔板系統(tǒng)，優(yōu)選成骨細(xì)胞接種量為O. 5 2xl04個(gè)/孔。
MSCs與成骨細(xì)胞誘導(dǎo)比例為3 : 2 10 : I，初始誘導(dǎo)培養(yǎng)基為DMEM (含10% FCS)，培養(yǎng)溫度37°C，C025 %，在初始誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)第I天至第7天時(shí)(優(yōu)選為第3天)，向初始誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)，F(xiàn)GF濃度為I 100pg/ml，優(yōu)選IOpg/ ml ο
步驟(4)、繼續(xù)培養(yǎng)至第8 12天,優(yōu)選為第10天,收集Transwell內(nèi)室的細(xì)胞， 該細(xì)胞即為由MSCs誘導(dǎo)成的成骨細(xì)胞，對誘導(dǎo)分化后嵌套內(nèi)室中的細(xì)胞進(jìn)行性狀的鑒定
1、ALP活性鑒定
堿性磷酸酶(ALP)是成骨細(xì)胞分化的早期標(biāo)志物，分化早期開始出現(xiàn)，鈣化期達(dá)到峰值，可作成骨細(xì)胞鑒定的指標(biāo)，ALP是分泌型蛋白，在培養(yǎng)液中可以直接檢測。
P3代MSCs細(xì)胞與P3代成骨接種比例分別為I 1,2 1,3 1,4 1,5 1， 0:1。每一組重復(fù)3個(gè)孔。按照步驟3所述方法誘導(dǎo)成骨細(xì)胞，使用ALP試劑盒檢測培養(yǎng)液中的ALP活性。檢測結(jié)果見表I
表I :檢測不同細(xì)胞接種比例培養(yǎng)基中ALP含量
權(quán)利要求
1.一種成骨細(xì)胞的定向誘導(dǎo)方法，所述方法包括如下步驟 步驟(I)、MSCs細(xì)胞的獲取； 步驟(2)、誘導(dǎo)用成骨細(xì)胞的獲??； 步驟(3)、定向誘導(dǎo)MSC細(xì)胞為成骨細(xì)胞 選用聚碳酯膜(PC) Transwell系統(tǒng)，Transwell系統(tǒng)的孔徑0. 4 3. O ii m,優(yōu)選·3.Oum, Transwell系統(tǒng)可以是適配96孔板、48孔板、24孔板、12孔板或6孔板的系統(tǒng),優(yōu)選為適配6孔板的24mm直徑的Transwell系統(tǒng)，接種前先用培養(yǎng)基DMEM含10%胎牛血清(FCS)將小室浸潤37°C、lh ； 將上述步驟(I)獲得的P3代MSCs細(xì)胞接種于Transwell嵌套內(nèi)，接種細(xì)胞量為0.05 10xl04cell/ 孔，接種密度 I 3xl05cell/ml ； 將上述步驟(2)獲得的成骨細(xì)胞接種于作為底層細(xì)胞外室，接種細(xì)胞量為0.05 10xl04cell/孔，MSCs與成骨細(xì)胞接種比例為MSCs :成骨細(xì)胞=3 2 10 1，優(yōu)選為MSCs 成骨細(xì)胞=4:1; 初始誘導(dǎo)培養(yǎng)基為DMEM (含10 % FCS)，培養(yǎng)溫度37°C，C025 %，在初始誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)第I 7天時(shí)，優(yōu)選為第3天時(shí)，向初始誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)，F(xiàn)GF濃度為I 100pg/ml,優(yōu)選10pg/ml ； 步驟(4)、繼續(xù)培養(yǎng)至第8 12天,優(yōu)選為第10天,收集Transwell內(nèi)室的細(xì)胞,該細(xì)胞即為由MSCs誘導(dǎo)成的成骨細(xì)胞，根據(jù)需要，進(jìn)行鑒定。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟(I)的MSCs細(xì)胞的獲取步驟為 無菌條件下，采健康人紅骨髓，等體積加入含肝素鈉(0. I I. 5mg/ml)的生理鹽水，充分混勻，輕輕加入到密度為I. 077g/mL的Ficol溶液上，1500 2500r/min,離心20 40min，收集離心管中部云霧狀的單個(gè)核層細(xì)胞層，用PBS (pH7. 2 7. 4)洗兩遍； 按照0. 5 2xl06cells/瓶，接種上述步驟中獲得的細(xì)胞到75cm2培養(yǎng)瓶中，DMEM (含10%胎牛血清FCS)，37°C 5% CO2，培養(yǎng)。培養(yǎng)傳代至P3代，流式檢測、鑒定MSC純度。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)誘導(dǎo)用成骨細(xì)胞的獲取步驟為 取手術(shù)獲得的骨標(biāo)本，室溫?zé)o菌生理鹽水沖洗數(shù)次切下骨小梁，洗數(shù)次除去血污及脂肪，把骨小梁切成l_3mm3的碎塊，加入IOml Ham’s F12培養(yǎng)基，37°C 5% CO2，培養(yǎng)5_7天，細(xì)胞長滿后可以去除組織塊，用胰酶消化收集細(xì)胞，傳代培養(yǎng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述MSCs和成骨細(xì)胞是自體來源或異體來源。
5.權(quán)利要求1-4所述的方法在制備自體或異體骨組織中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求1-4所述的方法在臨床骨組織誘導(dǎo)和移植中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種使用具有半通透型支架隔離系統(tǒng)的培養(yǎng)小室，定向誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞的方法，使用Transwell支架培養(yǎng)系統(tǒng)，在嵌套內(nèi)室接種MSCs，在外室接種成骨細(xì)胞，通過控制兩種細(xì)胞的合理比例，以及適當(dāng)時(shí)間加入特定的細(xì)胞因子，快速的誘導(dǎo)MSCs分化為成骨細(xì)胞。
文檔編號A61L27/38GK102978157SQ201210535530
公開日2013年3月20日 申請日期2012年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月13日
發(fā)明者安沂華, 董健伸 申請人:安沂華