專利名稱：Set基因rna干擾重組載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種可以在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的 SET基因RNA干擾重組載體及其該載體的表達(dá)方法。
背景技術(shù)：
癌蛋白SET又稱I2PP2A、TAF_Ii3，在細(xì)胞中廣泛存在，是體內(nèi)主要的絲-蘇氨酸蛋 白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A，PP2A)的胞內(nèi)抑制蛋白，具有特異性、非競爭性和熱 穩(wěn)定性，同時SET也是組蛋白分子伴侶。其在急性未分化型白血病中首次被鑒定，近年來的 研究表明，SET是一個多功能蛋白，涉及細(xì)胞凋亡、腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、核小體裝配、組蛋白 結(jié)合等方面。Madeira A等報道在Alzheimer，s疾病中SET蛋白參與了神經(jīng)元凋亡過程，為 此疾病機(jī)理提供了新的線索；PP2A活性的缺失或改變與腫瘤發(fā)生有一定聯(lián)系，許多細(xì)胞毒 素的促腫瘤作用與抑制PP2A的活性有關(guān)，PP2A被認(rèn)為可能是一個潛在的腫瘤抑制因子。而 SET蛋白作為PP2A的胞內(nèi)抑制蛋白，其與腫瘤發(fā)生也密切相關(guān)，如Wilm’ s腫瘤中SET mRNA 和蛋白表達(dá)都顯著上升，通過癌蛋白SET的磷酸化可促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞生長，肝細(xì)胞癌變 中觀察到I2PP2A/SET基因表達(dá)上調(diào)，PP2A活性受抑制；SET蛋白能誘導(dǎo)原癌基因C-Jun的 表達(dá)和影響轉(zhuǎn)錄因子AP-I的活性，同時也能增強(qiáng)激活蛋白-Kactivator protein-Ι)的轉(zhuǎn) 錄活性；SET作為組蛋白分子伴侶，能抑制組蛋白和核小體的乙?；?，從而導(dǎo)致組蛋白依賴 性轉(zhuǎn)錄的沉默和DNA去甲基化激活受阻。三氯乙烯(Trichloroethylene，TCE)為不飽和鹵代脂肪羥類化學(xué)物，是電子、制 革和五金行業(yè)常用的有機(jī)清洗溶劑，經(jīng)吸入和皮膚接觸后可引起肝臟、腎臟、心臟及皮膚的 損害。近年來，三氯乙烯中毒事件呈上升趨勢，死亡事件也時有報道。三氯乙烯中毒主要表 現(xiàn)為藥疹樣皮炎，但肝臟功能損害情況亦相當(dāng)嚴(yán)重。劉建軍等利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究三 氯乙烯刺激肝細(xì)胞后蛋白質(zhì)差異表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中的SET差異蛋白在TCE低劑量時表達(dá) 上調(diào)，并且隨著TCE劑量的增加，其表達(dá)繼續(xù)上升。自 1998 年 Fire 等人發(fā)現(xiàn) RNA 干擾(RNA interference, RNAi)現(xiàn)象以來，RNAi 技 術(shù)已被證實是一種特異、高效、經(jīng)濟(jì)的抑制基因表達(dá)的手段而受到極大的重視和歡迎。2001 年，RNAi技術(shù)被成功應(yīng)用于哺乳動物細(xì)胞，其應(yīng)用前景更加誘人，已經(jīng)成為疾病研究和治療 的熱點。研究者們可以利用這項技術(shù)對目標(biāo)基因或蛋白質(zhì)進(jìn)行特異性表達(dá)沉默，通過觀察 其表達(dá)被抑制的細(xì)胞或者生物體的從形態(tài)到各項生理生化指標(biāo)的變化，對該基因或蛋白質(zhì) 的功能及參與的信號網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行研究。這比傳統(tǒng)的基因敲除方法要簡單而且方便得多，因此 短短幾年，就有了很多突破性的成果，其中研究得最多的是與疾病相關(guān)的一些基因和蛋白。RNA干擾是與靶基因序列同源的雙鏈RNA (double-stranded RNA, dsRNA)所誘導(dǎo) 的一種特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象(post-transcriptional gene silencing，PTGS)。 外源性或內(nèi)源性的雙鏈RNA進(jìn)入細(xì)胞后，在三磷酸腺苷(ATP)依賴性RNA酶III (Dicer， DCR)的作用下被切割成3’端有2個突出堿基的21-23nt長度的小分子干擾RNA(small interference RNA, si RNA)；這些siRNA與RNAi特異性酶結(jié)合，形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex, RISC)；而后 RISC 在 siRNA 反義鏈的指導(dǎo)下與 siRNA 同源靶mRNA相結(jié)合，RISC中的重要組成成分Ago-2蛋白在近中點位置將其切割A(yù)，隨后靶 mRNA被細(xì)胞內(nèi)RNA酶降解，轉(zhuǎn)錄后的mRNA就不能翻譯出相對應(yīng)的蛋白，而RISC游離出來， 尋找新的目標(biāo)分子，從而達(dá)到抑制靶基因表達(dá)的作用?，F(xiàn)有技術(shù)中，沒有發(fā)現(xiàn)在肝細(xì)胞內(nèi)可穩(wěn)定表達(dá)，特異性抑制SET蛋白表達(dá)的shRNA 表達(dá)載體，而且現(xiàn)有的其它shRNA表達(dá)載體往往存在轉(zhuǎn)染效率低，干擾效果不穩(wěn)定，載體用 量大，而且通常都需要多次瞬時轉(zhuǎn)染等缺陷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于提供一種經(jīng)濟(jì)、快捷且可以穩(wěn)定表達(dá)的SET基因RNA干擾 重組質(zhì)粒載體，避免多次瞬時轉(zhuǎn)染造成繁瑣流程，能有效地抑制SET蛋白表達(dá)，可以用于制 備治療SET蛋白表達(dá)異常相關(guān)疾病的藥物中和SET基因的功能研究，解決現(xiàn)有技術(shù)存在的 缺陷。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種SET基因RNA干擾重組載體，其特征是包括表達(dá)載體的基本序列、抗性基 因序列、多克隆位點、啟動子序列、可表達(dá)的SET shRNA的寡核苷酸鏈模板序列，所述的可 表達(dá)的SET shRNA的寡核苷酸鏈模板序列正向插入表達(dá)載體的多克隆位點序列內(nèi)；所述 可表達(dá)的SET shRNA的寡核苷酸鏈模板序列依據(jù)SET mRNA靶序列設(shè)計；所述表達(dá)載體為 psiRNA-hHlneo 系列。優(yōu)選的是所述的多克隆位點包含Bbs I限制性酶切位點，所述寡核苷酸鏈包括 Sense+Loop+Antisense，并在兩端加上Bbs I限制性酶切位點；所述的Loop為TCAAGAG。更優(yōu)的是所述的SET mRNA 靶序列為 5' -AACAGCAAGAAGCGATTGAAC-3 ‘ (SQE ID No 1)；所述的寡核苷酸鏈模板序列包括寡核苷酸正義鏈序列和寡核苷酸反義鏈序列，所述 正義鏈序列為5 ‘ -TCCCAACAGCAAGAAGCGATTGAACTCAAGAGGTTCAATCGCTTCTTGCTGTTTT-3 ‘ (SQE ID No 3)；所述反義鏈序列為5 ‘ -CAAAAAACAGCAAGAAGCGATTGAACACTCTTGATGTTCAATCGCTTCTTGCTGT-3 ‘ (SQE ID No 4)。更優(yōu)的是所述的SET mRNA 靶序列為 5' -AAACGCAGAATAAAGCCAGCA-3 ‘ (SQE ID No 2)；所述的寡核苷酸鏈模板序列包括寡核苷酸正義鏈序列和寡核苷酸反義鏈序列，所述 正義鏈序列為5 ‘ -TCCCAAACGCAGAATAAAGCCAGCATCAAGAGTGCTGGCTTTATTCTGCGTTTTT-3 ‘ (SQE ID No 5)；所述反義鏈序列為5 ‘ -CAAAAAAAACGCAGAATAAAGCCAGCACTCTTGATGCTGGCTTTATTCTGCGTTT-3 ‘ (SQE ID No 6)。本發(fā)明的目的之二在于提供一種SET基因RNA干擾重組載體的構(gòu)建方法，包括步 驟
(A)依據(jù)Genbank的SET基因序列，根據(jù)shRNA設(shè)計原則選取SET mRNA靶序列，并 設(shè)計合成可表達(dá)的SETshRNA的寡核苷酸鏈模板序列；(B)將設(shè)計合成的SET shRNA的寡核苷酸鏈模板序列正向插入表達(dá)載體的多克隆 位點序列內(nèi)，構(gòu)建特異性抑制SET蛋白表達(dá)的shRNA表達(dá)載體。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點和有益效果本發(fā)明成功構(gòu)建針對人SET基因的RNA干擾真核質(zhì)粒載體，其能有效地抑制肝細(xì) 胞內(nèi)SET蛋白的表達(dá)，為深入研究SET蛋白在三氯乙烯致肝細(xì)胞毒性中的作用奠定了基礎(chǔ)。


圖1為本發(fā)明所述的psiRNA-hHl neo質(zhì)粒圖譜；圖2為本發(fā)明實施例shRNA重組質(zhì)粒酶切鑒定電泳示意圖；圖3為本發(fā)明實施例shRNA重組質(zhì)粒測序結(jié)果(部分)示意圖；圖4本發(fā)明實施例RNA干擾后L-02肝細(xì)胞中SET蛋白的表達(dá)Western blotting 檢測結(jié)果示意圖。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。實施例1靶向人SET的短發(fā)夾環(huán)RNA(shRNA)寡核苷酸鏈的設(shè)計與合成針對人SET mRNA序列(Genbank Accession NM_001122821)，根據(jù) shRNA設(shè)計原則 及www, simawizard. com上的在線設(shè)計軟件選擇兩條21nt靶序列，經(jīng)BLAST同源性比對分 析，兩條靶序列與人類其他基因編碼序列無同源性，分別起始于SET基因第119、553位點。 寡核苷酸鏈由Sense+Loop (TCAAGAG) +Antisense組成，并在兩端加上Bbs I酶切位點，分別 命名為siRNAl、siRNA2，另外設(shè)計對照序列siRNA c，不針對人任何基因，具體序列如表1。 寡核苷酸鏈由上海生工公司合成。表1靶向SET基因shRNA寡核苷酸鏈序列Table 1 the sequences of shRNA oligonucleotides targeting SET gene
權(quán)利要求
一種SET基因RNA干擾重組載體，其特征是包括表達(dá)載體的基本序列、抗性基因序列、多克隆位點、啟動子序列、可表達(dá)的SET shRNA的寡核苷酸鏈模板序列，所述的可表達(dá)的SET shRNA的寡核苷酸鏈模板序列正向插入表達(dá)載體的多克隆位點序列內(nèi)；所述可表達(dá)的SET shRNA的寡核苷酸鏈模板序列依據(jù)SET mRNA靶序列設(shè)計；所述表達(dá)載體為psiRNA hH1 neo。
2.如權(quán)利要求1所述的SET基因RNA干擾重組載體，其特征是所述的多克隆位點包 Bbs I限制性酶切位點，所述寡核苷酸鏈包括Sense+Loop+Antisense，并在兩端加上Bbs I 限制性酶切位點；所述的Loop為TCAAGAG。
3.如權(quán)利要求2所述的SET基因RNA干擾重組載體，其特征是所述的SETmRNA靶序 列為5' -AACAGCAAGAAGCGATTGAAC-3‘ (SQE ID No 1)；所述的寡核苷酸鏈模板序列包括 寡核苷酸正義鏈序列和寡核苷酸反義鏈序列，所述正義鏈序列為5' -TCCCAACAGCAAGAAGCGATTGAACTCAAGAGGTTCAATCGCTTCTTGCTGTTTT-3' (SQE ID No3)；所述反義鏈序列為5' -CAAAAAACAGCAAGAAGCGATTGAACACTCTTGATGTTCAATCGCTTCTTGCTGT-3' (SQE ID No4)。
4.如權(quán)利要求2所述的SET基因RNA干擾重組載體，其特征是所述的SETmRNA靶序 列為5' -AAACGCAGAATAAAGCCAGCA-3‘ (SQE ID No 2)；所述的寡核苷酸鏈模板序列包括 寡核苷酸正義鏈序列和寡核苷酸反義鏈序列，所述正義鏈序列為5' -TCCCAAACGCAGAATAAAGCCAGCATCAAGAGTGCTGGCTTTATTCTGCGTTTTT-3' (SQE ID No5)；所述反義鏈序列為5' -CAAAAAAAACGCAGAATAAAGCCAGCACTCTTGATGCTGGCTTTATTCTGCGTTT-3' (SQE ID No6)。
5.一種構(gòu)建權(quán)利要求1-4任一項所述SET基因RNA干擾重組載體的方法，包括步驟(A)依據(jù)Genbank的SET基因序列，根據(jù)shRNA設(shè)計原則選取SETmRNA靶序列，并設(shè)計 合成可表達(dá)的SET shRNA的寡核苷酸鏈模板序列；(B)將設(shè)計合成的SETshRNA的寡核苷酸鏈模板序列正向插入表達(dá)載體的多克隆位點 序列內(nèi)，構(gòu)建特異性抑制SET蛋白表達(dá)的shRNA表達(dá)載體。
6.權(quán)利要求1-4任一項所述的SET基因RNA干擾重組載體在制備治療SET蛋白表達(dá)異 常相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種SET基因RNA干擾重組載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，所述SET基因RNA干擾重組載體包括表達(dá)載體的基本序列、抗性基因序列、多克隆位點、啟動子序列、可表達(dá)的SET shRNA的寡核苷酸鏈模板序列，所述的可表達(dá)的SET shRNA的寡核苷酸鏈模板序列正向插入表達(dá)載體的多克隆位點序列內(nèi)；所述可表達(dá)的SET shRNA的寡核苷酸鏈模板序列依據(jù)SET mRNA靶序列設(shè)計；所述表達(dá)載體為psiRNA-hH1 neo系列。本發(fā)明成功構(gòu)建針對人SET基因的RNA干擾真核質(zhì)粒載體，其能有效地抑制肝細(xì)胞內(nèi)SET蛋白的表達(dá)，為深入研究SET蛋白在三氯乙烯致肝細(xì)胞毒性中的作用奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號A61P35/00GK101948858SQ20101025567
公開日2011年1月19日 申請日期2010年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月17日
發(fā)明者劉建軍, 周麗, 席仁榮, 彭朝瓊, 邢秀梅, 黃海燕 申請人:深圳市疾病預(yù)防控制中心