專利名稱：制備免疫球蛋白組合物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備病毒安全的免疫球蛋白組合物的方法，以及能夠利用此方法制備的抗體制劑和藥物組合物。
背景技術(shù)：
從人類血漿制備的且適合于靜脈內(nèi)施用的免疫球蛋白組合物在本領(lǐng)域中是已知的，且數(shù)十年來在多種疾病的治療中起著重要作用。免疫球蛋白用于例如治療人體感染，并且可以分為具有不同生化和生理性質(zhì)的多種類別。免疫球蛋白G參與抵御病毒抗原，而IgM則主要在抗細菌和抗毒素的免疫應(yīng)答中具有活性。免疫球蛋白溶液包含占各種百分比的IgG、IgA和IgM，且不同的制劑具有不同的 治療應(yīng)用，例如，IgM百分比較高的制劑用于預(yù)防或治療細菌感染。與IgG制劑相比，IgM抗體易于在溶液中聚集。IgM制劑難以穩(wěn)定化，尤其是在其與血漿濃度相比有所富集且儲存在液體溶液中時。免疫球蛋白溶液通常從血漿或血清的組分(例如Cohn組分)中制得。隨后對這些組分進行多個純化步驟來除去包括病毒、變性蛋白、蛋白酶和脂質(zhì)在內(nèi)的污染物。用于組分分離的人類血清采集自數(shù)千供體，盡管對來源血漿進行了全面檢測，但仍可能含有病原體病毒。因此，為了獲得安全的用于醫(yī)藥應(yīng)用的產(chǎn)品，用于使病毒滅活或除去病毒的處理步驟必不可少。用于病毒滅活/去除的若干種技術(shù)在本領(lǐng)域中是已知的，例如化學(xué)處理、UVC光照射或納米過濾，實施這些技術(shù)是為了確?？傮w病毒安全性。然而，這些步驟可能對免疫球蛋白的活性具有負面影響；例如，過長的UVC照射時間可以使在最終免疫球蛋白溶液中所獲得的天然的具有活性的IgM的產(chǎn)率降低。通過使用生產(chǎn)過程的實驗室規(guī)模模型驗證了這些處理步驟的病毒去除或滅活能力，并且對每個步驟都確定了去除或滅活系數(shù)。滅活/去除系數(shù)的提高為藥物產(chǎn)品增添了額外的病毒安全性?，F(xiàn)今，來自主管機構(gòu)的準則要求在制造源自血漿的藥物時至少有兩個針對有包膜和無包膜的病毒的有效步驟。除了潛在的病毒以外，還有必要除去例如蛋白酶、蛋白聚集體和變性的免疫球蛋白等其他污染物，從而獲得耐受良好的產(chǎn)品。對患者而言，變性的免疫球蛋白尤其是潛在的風(fēng)險，因為其非特異性地激活補體的能力很高，從而在接受這些變性免疫球蛋白的患者中產(chǎn)生嚴重的副作用。該抗補體活性(ACA)通過《歐洲藥典(EuropeanPharmacopoeia)》中描述的標準化測試來測量。為了(I)在靜脈內(nèi)施用后使患者對產(chǎn)品耐受、(2)確保產(chǎn)品符合有關(guān)病毒污染的生物安全性準則、(3)使產(chǎn)物在長期儲存過程中穩(wěn)定和(4)產(chǎn)生所需的化合物混合物/藥物組合物，除去所有上述污染物是必須的。已使用經(jīng)典的Cohn血漿組分分離法或其公知的變形方法(例如Cohn/Oncley，Kistler/Nitschmann)對人IgM溶液進行了初步純化。使用冷乙醇沉淀法，將IgM組分回收在組分III或組分I/III (亦稱為B或B+I)中。已描述了用來從組分III或Ι/III開始對富集有IgM的蛋白溶液進行純化的方法。EP0013901描述了從組分III開始的純化方法，包括使用辛酸的步驟、使用β_丙內(nèi)酯的步驟和使用陰離子交換樹脂的吸附步驟。該方法用于生產(chǎn)Penmglobhi ——迄今為止唯一的市售靜脈內(nèi)IgM產(chǎn)品。EP0352500描述了通過以下方法制備具有降低的抗補體活性的用于靜脈內(nèi)應(yīng)用的IgM濃縮物使用陰離子交換層析、β-丙內(nèi)酯、UVC光照射，并在升高的溫度(40°C 60°C)下進行溫育步驟。丙內(nèi)酯是為了使?jié)撛诘牟《緶缁疃跍缇襟E中使用的公知化學(xué)物質(zhì)。由于β_丙內(nèi)酯是可引起蛋白化學(xué)修飾的反應(yīng)性很強的物質(zhì)，所以免疫球蛋白的抗病毒活性和抗細菌活性也會有大量損失。用該方法制造的制劑因所述化學(xué)修飾而在液體溶液中僅在有限的時間內(nèi)保持穩(wěn)定。IgM的濃度超過總免疫球蛋白含量的50%。在ΕΡ0413187 (Biotest,生物測試股份公司)和EP0413188 (Biotest,生物測試股份公司)中，已描述了未經(jīng)丙內(nèi)酯化學(xué)修飾的IgM富集的蛋白溶液的制備。這些方法包括從Cohn組分III或ΙΙ/ΙΙΙ開始對適合的蛋白溶液進行辛酸處理和陰離子交換層析。在專利ΕΡ0413187 (Biotest，生物測試股份公司)中，辛酸處理通過攪拌15分鐘來進行，以除去存在于Cohn組分III中的脂質(zhì)?！び捎谝蚧颊哽o脈內(nèi)施用大量的免疫球蛋白，所以必須獲得可耐受的藥物制劑。據(jù)已有描述，難以將IgM制劑制備成用于靜脈內(nèi)應(yīng)用。就天然性質(zhì)而言，IgM在結(jié)合抗原后是補體的強力活化劑。因此，對患者而言，變性的IgM分子的非特異性抗補體活性比變性的IgG分子要危險得多。EP0413187所述的制劑具有低抗補體活性，即O. 6 0.8CH50/mg蛋白，但是必須對其進行穩(wěn)定化和用β-丙內(nèi)酯進行病毒滅活。根據(jù)針對免疫球蛋白的EP專論，認為低抗補體活性為彡lCH50/mg蛋白。EP0413188B1 (Biotest，生物測試股份公司)描述了為了降低抗補體活性而使用陰離子交換層析來制備用于靜脈內(nèi)施用的富集有IgM的制劑。此外，還描述了在pH 4
4.5且在40°C 60°C、優(yōu)選50°C 54°C進行熱處理以降低抗補體活性。必須將該制劑凍干以確保該制劑持續(xù)數(shù)月的穩(wěn)定性。未能顯示出液體溶液的長期穩(wěn)定性。另一種方法描述了在pH 4.0 5.0和在401 621、優(yōu)選451 551通過利用對IgM制劑的溫和熱處理(EP0450412，Miles)來減少非特異性補體活化。在該專利申請中，將辛酸添加到Cohn組分III懸浮液中，從而通過離心除去前激肽釋放酶活化劑和脂蛋白。但是，該處理會導(dǎo)致IgM的抗原決定簇部分丟失。這可能會使產(chǎn)生新生抗原的風(fēng)險升高，從而導(dǎo)致人體內(nèi)免疫原性增加或活性喪失。EP0835880 (US 6136312, ZLB)中已描述了在辛酸沉淀步驟后使用蛋白酶處理(例如，用胃蛋白酶)來制備用于靜脈內(nèi)應(yīng)用的含IgM的蛋白溶液。蛋白酶處理使免疫球蛋白分子發(fā)生部分片段化，從而破壞了 Fab和Fe部分的完整功能活性。因此，經(jīng)蛋白酶處理的免疫球蛋白不能認為是未經(jīng)修飾的免疫球蛋白。此外，該制備方法會產(chǎn)生約5%的分子量小于IOOkD的片段。用來進行辛酸處理的已描述的方法(EP0413187和EP0835880)的缺點在于，辛酸處理在除去和滅活無包膜病毒方面并不有效，且不會除去幾乎全部的蛋白水解活性。在EP 0345543 (Bayer, Miles)中，公開了用于治療用途的含有至少33%IgM的高度濃縮的IgM制劑,該制劑基本不含同種凝集素效價(isoagglutinin titre)。在該專利申請中，通過添加辛酸來進行辛酸沉淀，并通過Synsorb親和層析來除去同種凝集素。最終制劑必須冷凍干燥?？傊绻没瘜W(xué)手段或酶手段對免疫球蛋白進行修飾，和/或通過層析進一步純化，和/或進行溫和熱處理，則可以制造出具有低抗補體活性的含IgM的制劑。但是，產(chǎn)生未修飾的免疫球蛋白制劑的現(xiàn)有技術(shù)的方法不能實現(xiàn)針對所有潛在病毒的病毒滅活能力。雖然若干種方法(例如溶劑/去垢劑處理、辛酸處理、納米過濾和熱處理)可有效地滅活或除去有包膜病毒，但是僅有幾種已知方法可滅活或除去無包膜病毒，例如細小病毒。這些無包膜病毒大部分都非常小，通常會穿過孔徑大于20nm的納米過濾器。而該孔徑對于直徑可高達30nm的IgM分子而言過小。無包膜病毒可被例如β-丙內(nèi)酯等化學(xué)物質(zhì)有效地滅活，但是，這也會產(chǎn)生功能受到破壞的經(jīng)修飾的免疫球蛋白。另一種有效的處理是UVC照射(ΕΡ1842561，CAF-DCF)。然而，已知的溶劑/去垢劑處理、辛酸處理和溫和熱處理對無包膜病毒基本沒有效果。因此，用現(xiàn)有技術(shù)的方法制得的具有低抗補體活性的所有含有未經(jīng)化學(xué)修飾的IgM的制劑對人的使用而言在無包膜病毒(例如細小病毒)方面都不安全。 綜上所述，分離出靜脈內(nèi)可耐受的含IgM制劑的現(xiàn)有技術(shù)方法具有一定缺點，例如，不能有效地滅活或除去無包膜病毒，在保持溶液中IgM的高產(chǎn)量的同時消除蛋白水解活性方面能力有限。(蛋白水解活性是指存在于制劑中的蛋白酶總和)。由于液體蛋白制劑必須能夠長期(例如2年)儲存，所以必須消除殘余的蛋白酶活性，因為這些活性可以使藥物制劑降解。 因此，本發(fā)明的目的是克服這些缺點。

發(fā)明內(nèi)容
在第一方面，本發(fā)明提供一種從包含免疫球蛋白的血漿組分中制備IgM免疫球蛋白組合物的方法，所述方法包括(a)提供血漿組分，作為含有免疫球蛋白的溶液；(b)將C7 C9的羧酸與所述溶液混合，并用振動攪拌器處理經(jīng)混合的溶液以使污染性蛋白沉淀；和(C)將沉淀出的蛋白從所述溶液中分離出，以產(chǎn)生含有IgM的免疫球蛋白組合物。申請人:出人意料地發(fā)現(xiàn)，在將免疫球蛋白溶液與羧酸混合的步驟中使用振動攪拌器極其有利。該方法步驟使得可以更有效地除去不需要的蛋白(包括蛋白酶)，并且產(chǎn)生了對用來制造免疫球蛋白藥物的下游加工步驟更適合的中間產(chǎn)物；該中間產(chǎn)物使得這些下游加工步驟效率更高。特別而言，從步驟(c)獲得的含有IgM免疫球蛋白的組合物可以與其他處理步驟組合，例如用溫和酸條件進行的處理和用UVC照射進行的處理，從而產(chǎn)生適合于靜脈內(nèi)施用的含有IgM的免疫球蛋白產(chǎn)品或抗體制劑，且所述免疫球蛋白產(chǎn)物或抗體制劑具有以下有利性質(zhì)(i)未經(jīng)化學(xué)修飾；(ii)是病毒安全的；(iii)具有低蛋白水解活性(并因此在長期儲存過程中穩(wěn)定)；(iv)具有低抗補體活性；和(V)保留了高水平的天然的具有活性的IgM。通過本文所述的方法實現(xiàn)的病毒安全水平是此前不能取得的。此外，使用本發(fā)明的方法可獲得具有此前未能取得的具有這些特征的組合的含IgM的免疫球蛋白產(chǎn)品或抗體制劑。特別而言，本發(fā)明的方法步驟實現(xiàn)了對病毒顆粒的更高水平的滅活和去除，尤其是對抗性非常高的無包膜病毒(例如細小病毒)尤其如此，這些病毒通常不易受到辛酸處理的影響。此外，與常規(guī)的攪拌相比，實現(xiàn)了改善的蛋白水解活性去除。這些特征是在保持高產(chǎn)率的未經(jīng)化學(xué)修飾的IgM的同時獲得的。上述發(fā)現(xiàn)與下述常規(guī)觀點相反辛酸處理并不是針對無包膜病毒的有效步驟，且改善的病毒安全性必須通過用更嚴厲的方法(例如β-丙內(nèi)酯處理)使病毒滅活來實現(xiàn)。此外，為人熟知的是，提高例如辛酸的濃度來完全除去蛋白水解活性會導(dǎo)致IgM的大量損失。本發(fā)明的結(jié)果通過使用振動模式的混合設(shè)備與辛酸處理結(jié)合而獲得。這特別出人意料，因為已知的是IgM非常易受剪切應(yīng)力的影響，這種剪切應(yīng)力會導(dǎo)致不合需要的高抗補體活性。因此，不會想到使用振動混合器來制備IgM組合物，且不會預(yù)料到在處理含IgM的溶液期間使用振動混合時會產(chǎn)生如此有利的效果。此外，使用本發(fā)明的方法，在使用振動混合設(shè)備時增強了通過步驟(C)所實現(xiàn)的分離，例如，通過過濾從步驟(b)獲得的經(jīng)辛酸處理的溶液來進行的澄清化。更容易地實現(xiàn)了分離，從而減少了處理時間和制造成本，且步驟(c)產(chǎn)生了清澈的溶液，這為下游加工提 供了優(yōu)勢。通過對經(jīng)辛酸處理的含IgM溶液的攪拌后產(chǎn)物進行過濾而得到的常規(guī)溶液呈乳白色或不透明。對從步驟(c)獲得的含IgM的組合物優(yōu)選進行用溫和酸條件(例如，pH4)處理和UVC照射步驟，從而進一步改善病毒安全性并使最終產(chǎn)品穩(wěn)定化。由于對從步驟(C)獲得的含IgM的免疫球蛋白組合物的澄清化有所增強，因此可以降低UVC的必需照射時間，從而使無包膜病毒的病毒滅活程度大于3或41og1(l。這在UVC處理過程中產(chǎn)生了更高產(chǎn)率的天然的具有活性的IgM。出人意料的是，這些步驟產(chǎn)生了含有未經(jīng)化學(xué)修飾和酶修飾的IgM的溶液，所述溶液具有更高產(chǎn)率的天然的具有活性的IgM，具有低的抗補體活性和低蛋白水解活性，且具有高的抗細菌和抗病毒活性，具有關(guān)于有包膜病毒和無包膜病毒的優(yōu)異的病毒安全性；這對于靜脈內(nèi)施用的藥物而言是關(guān)鍵特征。此外，經(jīng)處理的含IgM溶液具有改善的長期穩(wěn)定性，其在2°C 8°C下在液體溶液中持續(xù)超過12個月均非常穩(wěn)定。因此，在另一方面，本發(fā)明提供能夠用上文說明的本發(fā)明的方法獲得的抗體制劑，以及含有IgM且蛋白水解活性低于8U/1的抗體制劑。特別而言，該抗體制劑適合于人類靜脈內(nèi)施用，且包含IgG、IgA和IgM，其中，總免疫球蛋白的至少5%是IgM。另外，本發(fā)明還提供用于醫(yī)藥應(yīng)用的本發(fā)明的抗體制劑。在一個實施方式中，所述抗體制劑用于治療免疫紊亂性疾病和細菌感染。本發(fā)明的另一方面提供一種治療方法，所述方法包括向患者施用本發(fā)明的抗體制劑?，F(xiàn)將結(jié)合附圖
僅以舉例方式來更詳細地描述本發(fā)明。圖I提供了本發(fā)明的實施方式的總覽，其中示出了能夠用來形成適合于靜脈內(nèi)施用的抗體制劑的各步驟。突出顯示了采用振動混合器設(shè)備的辛酸處理步驟、PH4處理和UVC處理。起始材料從人血漿的標準冷乙醇沉淀過程獲得。
具體實施例方式如上所述，本發(fā)明提供一種從包含免疫球蛋白的血漿組分制備含IgM的免疫球蛋白組合物的方法。適合于制備藥物免疫球蛋白組合物的血漿組分及其制造方法在本領(lǐng)域中是公知的。特別而言，如果藥物免疫球蛋白組合物用于施用給人，則從人血漿獲得血漿組分。血漿組分優(yōu)選為沉淀的血漿組分，最優(yōu)選為通過Cohn組分分離方法或其公知的變形方法(例如Kistler-Nitschmann)獲得的沉淀的血衆(zhòng)組分。最優(yōu)選的是，所述組分為冷乙醇組分分離產(chǎn)生的組分Ι/ΠΙ或組分III (亦稱為組分B+I或組分B)。血漿組分的免疫球蛋白優(yōu)選包含至少5%的IgM。步驟(a)包括提供血漿組分，作為含免疫球蛋白的溶液。在許多情況下，包含免疫球蛋白的血漿組分會是固體或半固體形式。因此，該步驟的目的是確保或使得血漿組分的蛋白進入溶液，從而使得所述蛋白處在適合于在步驟(b)中與羧酸混合的狀態(tài)。該步驟可以包括將血漿組分與適合的緩沖液混合。所述緩沖液優(yōu)選為低摩爾濃度(即，低于1M)且pH為4. 5 5. 5，例如，pH為5. 05±0. I的O. IM乙酸鈉緩沖液?；旌峡梢允褂脴~混合器或振動攬祥器來完成。在步驟(b)中，使用振動攪拌器將步驟(a)中形成的溶液與C7 C9的羧酸混合，從而沉淀出污染性蛋白(例如，蛋白酶、病毒等)。所述羧酸可以具有支鏈和/或可以包含不會顯著改變步驟(b)的效果的取代基。所述羧酸優(yōu)選為辛酸。該酸優(yōu)選以至少O. 075kg/kg血衆(zhòng)組分的濃度添加,最多以O(shè). 2kg/kg的濃度添加。該酸更優(yōu)選以O(shè). 8kg/kg O. 15kg/kg血衆(zhòng)組分添加，最優(yōu)選以O(shè). 09kg/kg O. 13kg/kg添加?？梢杂萌魏伪憷哪枬舛鹊乃醽硖峁┱_的濃度?？梢允褂眠m合用于化工/制藥工業(yè)的任何類型的市售振動攪拌器。適合的振動攪拌器的實例可以從Graber+Pfenninger GmbH獲得。特別而言,“Labormode 11 Typ I”振動混合器可以用于實驗室規(guī)模的實驗，而“Industriemixer Typ 4”可以用于生產(chǎn)規(guī)模的制備?？梢愿鶕?jù)制造商的操作說明來使用振動混合器，特別是在被制造商描述為適合于混合含蛋白的溶液的設(shè)置下進行使用。例如，振動混合器通?？梢栽诘陀贗OOHz下以小于IOmm的振幅工作，例如，本發(fā)明人在使用230V電源時在50Hz下使用“Labormode 11 Typ I”進行了實驗室規(guī)模的振動混合?；旌线^程的振動振幅為O 3_不等，而對于IgM的制備，優(yōu)選使用3mm。使用了直徑為23mm 65mm的攪拌器板來進行實驗室規(guī)模的實驗。對于生產(chǎn)規(guī)模，使用了直徑為395mm的攪拌器板(孔直徑為13. 5mm和16mm)。在步驟(b)中，經(jīng)混合的溶液的pH優(yōu)選為4. 5 5. 5，更優(yōu)選為4. 8 5. 3。該步驟可以在乙酸鈉緩沖液中進行，例如，用約O. IM的乙酸鈉緩沖液。執(zhí)行步驟(b)的溫度優(yōu)選為10°C 35°C，更優(yōu)選為14°C 30°C。對使用振動攪拌器的混合時間沒有特別限制，但優(yōu)選為30分鐘至3小時，更優(yōu)選為40分鐘 110分鐘。低于30分鐘的溫育時間可以降低病毒滅活水平。在步驟(b)的一個實施方式中，將磷酸三鈣與步驟(b)中的溶液混合。優(yōu)選其以
O.01kg/kg 0. 02kg/kg血衆(zhòng)組分添加(在血衆(zhòng)組分為固體或半固體形式時)。磷酸三隹丐可以與羧酸同時添加、分開添加或依次添加。在優(yōu)選實施方式中，磷酸三鈣在添加羧酸后至少20分鐘添加。在步驟(C)中，將在步驟(b)中沉淀出的污染性蛋白從溶液中分離出，從而產(chǎn)生含有IgM的免疫球蛋白組合物(即，含免疫球蛋白的溶液)。對該分離步驟沒有特別限制，可以用本領(lǐng)域中已知的任何適合的方法來執(zhí)行該分離步驟。然而，該分離步驟優(yōu)選使用過濾，更優(yōu)選使用超濾來執(zhí)行，因此，步驟(C)的產(chǎn)物是經(jīng)過濾的溶液。如上所述，本發(fā)明的方法在生產(chǎn)方面具有優(yōu)勢，因為其顯示出更高效地沉淀出了污染性蛋白，且步驟(C)因此更容易進行。當(dāng)對步驟(b)產(chǎn)生的混合物進行分離時，獲得了透明清晰的溶液，即含IgM的免疫球蛋白組合物。因此過濾更快且更容易。需要進一步的加工步驟來將從步驟(C)獲得的含IgM的免疫球蛋白組合物轉(zhuǎn)化為適合于靜脈內(nèi)施用的免疫球蛋白制劑。因此，在優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的方法包括下述額外步驟以溫和的酸條件處理從步驟(c)獲得的含IgM的免疫球蛋白組合物，并進一步對經(jīng)酸處理的組合物進行UVC照 射。在用溫和酸條件進行處理時，在pH為3. 5 4. 5、優(yōu)選為3. 8 4. 2下溫育從步驟(c)獲得的含IgM的免疫球蛋白組合物，從而形成經(jīng)溫育的溶液。溫和酸條件可以通過向含IgM的免疫球蛋白組合物中添加適合的酸來獲得,例如,可以通過添加O. 2M的HCl來調(diào)節(jié)pH。該溫育步驟優(yōu)選在32°C 42°C下、更優(yōu)選在35°C 39°C下進行。溫育時間優(yōu)選為2小時至24小時，更優(yōu)選為9小時至16小時。在照射步驟中，對于從上述溫和酸處理中獲得的經(jīng)溫育的溶液用UVC光進行處理，從而形成經(jīng)UVC照射的溶液。該步驟可以使用市售的設(shè)備來進行,例如IjVivatecw設(shè)備(Bayer Technology Services)。為了使?jié)撛诘牟《竞偷鞍酌高M一步滅活,優(yōu)選以200J/m2 500J/m2、更特別以200J/m2 300J/m2在254 ± IOnm處理所述經(jīng)溫育的溶液。已注意至IJ，通常要求的在溫和條件下的UVC處理僅對通過振動混合進行的辛酸處理后本發(fā)明所獲得的水澄清濾液可行。標準攪拌技術(shù)所通常得到的更乳白或更不透明的溶液會需要更長的照射時間，這將導(dǎo)致IgM活性的更多變性及更低的病毒滅活率。除了溫和酸處理和UVC照射外，用來獲得靜脈內(nèi)施用的免疫球蛋白制劑的額外步驟還可以可選地包括一個或多個過濾步驟。在一個實施方式中，可以使處理中的蛋白溶液吸附到DEAE-交聯(lián)葡聚糖凝膠上，隨后通過深度過濾使之與交聯(lián)葡聚糖凝膠分離。例如，可以進一步在pH 5. 8下以75mg/kg蛋白DEAE交聯(lián)葡聚糖凝膠對所述蛋白溶液進行分批吸附，從而除去不需要的伴隨性血漿銅藍蛋白。在特別優(yōu)選的實施方式中，使從溫和酸處理中獲得的經(jīng)溫育的溶液對DEAE-交聯(lián)葡聚糖凝膠進行吸附，隨后通過深度過濾使之與交聯(lián)葡聚糖凝膠分離，然后進行UVC照射處理。在另一個實施方式中，處理中的免疫球蛋白溶液可以通過納米過濾器來過濾。在處理過程中的各個階段，可以使用孔徑為75±5nm 35±5nm的過濾器或具有75nm 35nm標稱孔徑的過濾器(例如Pall Ultipor DV50)。(舉例而言,50nm的標稱孔徑意味著對大小為50nm以上的病毒的截留率彡41og10)。在優(yōu)選實施方式中，使從上文所述的DEAE-交聯(lián)葡聚糖凝膠步驟中獲得的溶液過濾通過O. 2 μ m過濾器，隨后再進行UVC照射。在另一優(yōu)選實施方式中，對UVC照射后得到的免疫球蛋白溶液進行納米過濾，優(yōu)選通過孔徑為40nm 50nm的過濾器。優(yōu)選的是，該步驟應(yīng)當(dāng)在無菌條件下進行。由上述方法獲得的最終抗體制劑(即，經(jīng)處理的含IgM的免疫球蛋白溶液)可以直接在無菌條件下填充到容器中。作為另一選擇，可以將該抗體制劑與穩(wěn)定劑(例如甘氨酸)配制在一起。特別而言，可以將該制劑配制在pH為4 5. 5、優(yōu)選為4. I 4. 5的含甘氨酸的緩沖液中。還可以將該抗體制劑稀釋至蛋白濃度為40g/L 80g/L、優(yōu)選為55g/L 70g/L。本發(fā)明的方法優(yōu)選不包括涉及對制劑中的抗體的化學(xué)修飾、對抗體的酶修飾或?qū)贵w的熱處理(例如,在40°C以上的溫度對抗體進行10分鐘以上的處理)中的一項或多項的步驟。更特別而言，本發(fā)明的方法不包括使抗體與β_丙內(nèi)酯和/或胃蛋白酶接觸的步驟。本發(fā)明還提供通過上述方法獲得的免疫球蛋白制劑或抗體制劑。該免疫球蛋白制劑為多克隆的，且包含至少5%IgM、優(yōu)選包含至少15%IgM且更優(yōu)選包含至少20%IgM。其他免疫球蛋白為IgG和IgA。優(yōu)選的是，該免疫球蛋白制劑包含5% 30% (更優(yōu)選15% 30%)的IgM、5% 30%(更優(yōu)選15% 30%)的IgA和40% 70%(更優(yōu)選45% 70%)的IgG。在最優(yōu)選的產(chǎn)品中，IgG含量為約50%，IgM和IgA的含量各自為約25%。這些值是指 占IgG+IgA+IgM之和的百分比，例如IgM占IgG+IgA+IgM之和的百分比。但是，也可以用公知的方法(例如陰離子交換層析)來進一步富集IgM。這些值可以通過濁度測定法或通過《歐洲藥典(Ph. Eur.)》(當(dāng)前版本(2010)2. 9. 17)的免疫沉淀來確定。特別而言，該免疫球蛋白制劑中的免疫球蛋白未經(jīng)化學(xué)修飾。該免疫球蛋白制劑在其制造過程中未用化學(xué)物質(zhì)(例如β_丙內(nèi)酯)進行處理來對產(chǎn)品進行滅菌。類似地，該制劑未用添加的蛋白酶(例如胃蛋白酶)進行處理來對產(chǎn)品進行滅菌。因此，該免疫球蛋白基本為天然狀態(tài)。該抗體制劑的蛋白水解活性低于現(xiàn)有技術(shù)中描述的抗體制劑。特別而言，當(dāng)該制劑儲存在2°C 8°C下時，在其中檢測不到蛋白水解活性。蛋白水解活性可以用本領(lǐng)域中已知的標準化測試方法來測量，例如使用下文實施例6中所述的顯色底物的方法。在此類方法中，蛋白水解活性通過以下方法來估算于37°C將顯色底物(特別是對至少一種絲氨酸蛋白酶敏感的顯色底物)與抗體制劑樣品(通常稀釋在緩沖液中以達到測定的線性范圍)混合，隨后使用分光光度計監(jiān)測吸收動力學(xué)。該樣品的蛋白水解活性通過使用等式C(U/L)=SX AAbs/分鐘XF(C=蛋白水解活性；S=與顯色底物的特定吸收變化相關(guān)的轉(zhuǎn)換因子；F=稀釋因子)由起始吸收差(AAbs/分鐘)計算得到。根據(jù)制造商的操作說明來使用該底物。特別而言，蛋白水解活性可以通過以下步驟來估算(a)將 25mg 底物 S-2288 (Chromogenix)溶解在 7. 2ml 注射用水中；(b)將抗體制劑樣品稀釋在緩沖液(IOOmM Tris. HCl，pH 8. 4，106mM NaCl)中，以達到測定的線性范圍，并將溫度調(diào)節(jié)至37°C ；(c)將經(jīng)稀釋的抗體制劑與已溶解的底物以等量(例如200 μ I)混合；(d)使用分光光度計在405nm處于37°C測量吸收動力學(xué)I分鐘 3分鐘；(e)通過使用等式C(U/L) =313X AAbs/分鐘XF(C=蛋白水解活性；F=稀釋因子)由起始吸收差(AAbs/分鐘)計算出樣品的蛋白水解活性。該方法的定量測定極限是8U/1 ;使用本發(fā)明的抗體制劑的樣品，檢測不到蛋白水解活性。因此，本發(fā)明的最終產(chǎn)品中的蛋白水解活性水平低于8U/1。與本領(lǐng)域已知的制劑一樣，本發(fā)明的抗體制劑可以儲存在5 ± 3°C下。然而，由于用本發(fā)明的方法進行了高效的純化，該抗體制劑的穩(wěn)定性極佳。液體形式的最終產(chǎn)品在2°C 8°C下穩(wěn)定至少3個月、優(yōu)選至少6個月且最優(yōu)選至少兩年,這意味著在HPSEC測定中IgM的片段化或聚合不超過5%，蛋白水解活性沒有增加，針對大腸桿菌的IgM抗體活性和針對肺炎球菌糖(Pneumococcus saccharide)的IgM抗體活性的下降不超過25%,且抗補體活性的增加不超過25%，保持低于lCH50/mg蛋白。此外，用相同的標準估算，通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的液體形式的最終產(chǎn)品在室溫(23°C 27°C)下穩(wěn)定至少3個月、優(yōu)選至少6個月且最優(yōu)選至少一年。
本發(fā)明的方法還提供了比現(xiàn)有技術(shù)的方法更高水平的病毒去除，從而獲得了比現(xiàn)有技術(shù)的抗體制劑更安全的抗體制劑，特別是就有活性的無包膜病毒(例如細小病毒)而言尤其如此。本發(fā)明的方法能夠除去/滅活病毒，特別是無包膜病毒，其除去/滅活程度超過31og1(l、優(yōu)選超過41og1(l且最優(yōu)選超過51og1(l。由此得到了基本不含病毒、特別是基本不含無包膜病毒(即，病毒安全)的抗體制劑。另外，本發(fā)明的方法能夠在不顯著影響活性IgM的量或抗體制劑的抗補體活性的情況下實現(xiàn)上述水平的病毒顆粒去除/滅活。因此，能夠獲得在有包膜病毒和無包膜病毒方面均為病毒安全的抗體制劑，其包含至少15%、更優(yōu)選至少20%的水平的IgM，且抗補體活性彡lCH50/mg蛋白。本發(fā)明的抗體制劑適合于醫(yī)藥應(yīng)用，并且可以用于治療免疫紊亂性疾病和感染，特別是IgM缺陷疾病和細菌感染。與多價免疫球蛋白G制劑相比，可用本發(fā)明的方法制備的用于靜脈內(nèi)施用的富集有人IgM的多價免疫球蛋白制劑包含更高的針對臨床相關(guān)的革蘭氏陰性及革蘭氏陽性細菌的抗體效價、更高的針對革蘭氏陰性細菌的內(nèi)毒素和革蘭氏陰性及革蘭氏陽性細菌的外毒素的抗體效價。特別而言，本發(fā)明的抗體制劑適合于向患者靜脈內(nèi)施用，特別適合于對人進行靜脈內(nèi)注射。本發(fā)明還提供患者的治療方法，所述治療方法包括向該患者施用本發(fā)明的抗體制劑的步驟。特別而言，所述患者可以患有免疫紊亂性疾病或細菌感染。 現(xiàn)將僅以示例方式來進一步描述本發(fā)明。對用于確定抗補體活性的測試方法的說明根據(jù)《歐洲藥典》中所描述的方法(方法2. 6. 17，歐洲藥典，第6版，2008)來進行確定抗補體活性的測定。補體使經(jīng)過溶血素預(yù)處理的綿羊紅血球發(fā)生溶血。憑借樣品中的補體結(jié)合性抗體，溶血得到了抑制。確定了被Img免疫球蛋白結(jié)合(滅活)了的補體的量。將一定量的免疫球蛋白(IOmg)與豚鼠的補體混合，并對游離的補體進行滴定。將抗補體活性表示為相對于參照溶液中所用補體的已用補體。補體活性的溶血單位(CH5tl)是導(dǎo)致最佳緩沖條件中的5 X IO8個紅血球總量中的2. 5 X IO8個最佳制備的紅血球發(fā)生溶血的補體的量。最佳制備的紅血球(8ml來自綿羊的穩(wěn)定化紅血球，用白明膠-巴比妥緩沖液清洗了三次，最后將Iml紅血球沉積物懸浮在24ml白明膠-巴比妥緩沖液中)通過以下方法制得將20ml紅血球懸浮液與20ml溶血素(調(diào)節(jié)至2MHE/ml_最小溶血單位)混合,并于37°C溫育15分鐘。將IOmg當(dāng)量的免疫球蛋白稀釋在白明膠-巴比妥緩沖液(1L pH 7. 3的巴比妥緩沖液含Ig白明膠，5倍的巴比妥緩沖溶液83克氯化鈉、10. 192g巴比妥鈉于2升水中，pH
7.3)中。將200 μ I補體100CH5(l/ml添加至Iml的最終體積中。將試管在37°C下振蕩溫育I小時。稀釋樣品，并針對最佳制備的紅血球?qū)悠愤M行滴定。在37°C下溫育I小時后，離心樣品，并使用分光光度計在541nm處確定光密度。實施例I一從組分I/III制備富集有IgM的制劑將源自人血漿的冷乙醇組分分離過程的180kg Cohn組分I/III懸浮在720L O. IM的乙酸鈉緩沖液(pH 5. 05)中，并在達到懸浮液溫度(22±4°C )后混合15分鐘 30分鐘。通過在室溫下添加19. 8kg辛酸(O. 110kg/kg所用的糊狀物I/III)來對上述溶液進行處理，隨后用振動混合器(V \^1'011化狀1'"\規(guī)格4, Graber+Pfenniger GmbH,將振動混合器調(diào)節(jié)至2 3級)將蛋白溶液進一步混合80分鐘。歷時30分鐘緩慢添加辛酸。
添加約3kg磷酸三I丐((Ca3(PO4)2),隨后再混合蛋白溶液至少15分鐘。利用過濾器壓力通過澄清過濾來除去沉淀。進行另外的0.2μπι過濾，并用IOkD膜對蛋白溶液進行超濾。以0.04Μ NaCl溶液為背景對蛋白溶液進行滲濾，之后將蛋白溶液調(diào)節(jié)至蛋白濃度為40g/L。在使用注射用水進行1+1稀釋后,在pH 4. 0±0. I下處理蛋白溶液。pH調(diào)節(jié)通過使用IM HCl來進行，并于37°C ±2°C溫育蛋白溶液9小時。在pH 4下溫育之后，用IM NaOH將蛋白溶液調(diào)節(jié)至PH 5.8。對于所得到的蛋白溶液，通過分批添加DEAE交聯(lián)葡聚糖凝膠(75g DEAE交聯(lián)葡聚糖凝膠/kg蛋白)來進行進一步純化。在攪拌下于室溫溫育蛋白溶液60分鐘以上。通過澄清過濾來除去DEAE交聯(lián)葡聚糖凝膠。對蛋白溶液進行O. 2μπι過濾。使蛋白溶液過濾通過O. Iym過濾器和Pall，Ultipor VF DV50，20〃過濾器。使用流動通過式UVivatec 處理設(shè)備(Bayer Technology Services/Sartorius Stedim)以240J/m2的UVC劑量在254nm處對濾液進行進一步的UVC光處理。使用制造商的操作說明來計算通過UVC反應(yīng)器的流速。通過超濾將經(jīng)照射的蛋白溶液濃縮至蛋白濃度為50g/l 70g/l，并對其進行滲濾(IOkD膜，使用O. 32M pH=4. 3的甘氨酸緩沖液)。使最終產(chǎn)物過濾通過O. 2 μ m過濾器，并在2°C 8°C儲存。實施例2—對辛酸處理步驟中的條件的研究對于辛酸處理，使用實施例I中描述的方法檢測了以下實驗范圍，并且還測試了其相互間的組合(結(jié)果未示出)。-辛酸量0.09kg/kg O. 13kg/kg(與每kg所用組分I/III對應(yīng)的辛酸量)(I2OmM I8OmM 辛酸)-辛酸處理的pHpH4. 8 5· 3-反應(yīng)的溫度范圍14°C 30°C-溫育時間40分鐘 110分鐘所有經(jīng)檢測的條件都產(chǎn)生了易于澄清以用于后續(xù)處理的中間體，并且蛋白水解活性從懸浮的Cohn組分I/III中的數(shù)千U/L發(fā)生了大幅度下降。這些中間體產(chǎn)生了蛋白水解活性低于8U/1 (按下文實施例6所述進行計算得到)的最終產(chǎn)品，8U/1為定量測定的極限。實施例3—通過使用振動混合器的病毒消減一對使用和不使用振動混合器的辛酸處理確定病毒去除系數(shù)
在pH 5. 05和22°C下，對250ml懸浮的組分I/III進行30分鐘的勻質(zhì)。將2. 6ml病毒原液摻入上述懸浮液中。添加辛酸(110g/kg)，并使用振動混合器勻質(zhì)60分鐘。在平行實驗中，通過標準攪拌對同樣的混合物進行勻質(zhì)。60分鐘后，添加磷酸三鈣(O. 15g/kg辛酸)，并攪拌懸浮液15分鐘。通過使用濾片進行深度過濾來使懸浮液澄清。濾片用70ml 80ml緩沖液預(yù)先沖洗過。過濾后，用80ml緩沖液沖洗濾器。將濾液和洗液合并，并提取樣品進行病毒滴定。在針對SV40、Reo和PPV的適合的指示細胞(CV-1、CCL. 7. I和PK13)上確定了在添加辛酸前和進行過濾后所采集的樣品中的病毒效價。最后，按照目前用于病毒驗證研究的準則計算出去除系數(shù)。在病毒驗證研究中，諸如SV40和Reo等無包膜病毒分別以大于41og1(l和大于51og10的量級被有效去除。此外，超過31og1(l的PPV被去除。這些值比在無振動混合的標準攪拌條件下進行相同的辛酸處理時高出超過10倍至1000倍。表I :對使用及不使用振動混合器時辛酸處理的病毒消減系數(shù)(Iogltl)的比較。
權(quán)利要求
1.一種從包含免疫球蛋白的血漿組分中制備含有IgM的免疫球蛋白組合物的方法，所述方法包括 (a)提供血漿組分，作為含有免疫球蛋白的溶液； (b)將C7 C9的羧酸與所述溶液混合，并用振動攪拌器處理經(jīng)混合的溶液以使污染性蛋白沉淀；和 (c)將沉淀出的蛋白從所述溶液中分離出，以產(chǎn)生所述含有IgM的免疫球蛋白組合物。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其中，在步驟(b)中所述C7 C9的羧酸的濃度為至少O. 075kg/kg血漿組分。
3.如權(quán)利要求I或2所述的方法，其中，在步驟(b)中所述經(jīng)混合的溶液的pH為4.5 5.5o
4.如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中，在步驟(b)中所述經(jīng)混合的溶液的溫度為10°C 35°C。
5.如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中，在步驟(b)中將所述C7 C9的羧酸與含有免疫球蛋白的所述溶液溫育至少30分鐘。
6.如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中，所述C7 C9的羧酸是辛酸。
7.如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中，所述血漿組分的免疫球蛋白包含至少5% 的 IgM。
8.如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中，所述血漿組分是Cohn組分Ι/III或者Kistler/Nitschmann 組分 B 或 B+I 的沉淀物。
9.如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中，步驟(c)包括超濾，并且所述免疫球蛋白組合物包含經(jīng)過濾的溶液。
10.如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，所述方法還包括在pH3. 5 4. 5溫育來自步驟(c)的所述含有IgM的免疫球蛋白組合物以形成經(jīng)溫育的溶液的步驟。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中，溫育來自步驟(c)的所述含有IgM的免疫球蛋白組合物的所述步驟在32°C 42°C進行。
12.如權(quán)利要求10或11所述的方法，所述方法還包括使所述經(jīng)溫育的溶液對DEAE-交聯(lián)葡聚糖凝膠進行吸附的步驟，和通過深度過濾將所述DEAE-交聯(lián)葡聚糖凝膠與所述溶液分尚的步驟。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，所述方法還包括對來自所述深度過濾的濾液進行納米過濾的步驟。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中，所述納米過濾用具有35nm 75nm標稱孔徑、優(yōu)選具有40nm 50nm標稱孔徑的過濾器進行。
15.如權(quán)利要求10 14中任一項所述的方法，所述方法還包括用UVC照射對權(quán)利要求10或11中的所述經(jīng)溫育的溶液或者權(quán)利要求12 14中任一項中的濾液進行處理以形成經(jīng)UVC照射的溶液的步驟。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中，用200J/m2 500J/m2、優(yōu)選200J/m2 300J/m2的UVC照射來處理所述經(jīng)溫育的溶液或所述濾液。
17.如權(quán)利要求15或16所述的方法，所述方法還包括在無菌條件下過濾所述經(jīng)UVC照射的溶液以產(chǎn)生適于靜脈內(nèi)施用的抗體制劑的步驟。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，所述方法還包括將所述抗體制劑配制在pH為4 5.5的含甘氨酸的緩沖液中。
19.如權(quán)利要求15 18中任一項所述的方法，所述方法還包括在無菌條件下將權(quán)利要求15或16中的所述經(jīng)UVC照射的溶液或者權(quán)利要求17或18中的所述抗體制劑填充到容器中的步驟。
20.如權(quán)利要求15 19中任一項所述的方法，其中，權(quán)利要求15或16中的所述經(jīng)UVC照射的溶液或者權(quán)利要求17或18中的所述抗體制劑具有低于8U/1的蛋白水解活性。
21.如權(quán)利要求15 20中任一項所述的方法，所述方法提供對無包膜病毒的大于31og10的去除。
22.—種抗體制劑，所述抗體制劑包含能夠用權(quán)利要求17 21中任一項所述的方法獲得的免疫球蛋白。
23.—種適合于人類靜脈內(nèi)施用的抗體制劑,所述抗體制劑包含免疫球蛋白IgG、IgA和IgM，具有低于8U/1的蛋白水解活性，并且其中總免疫球蛋白的至少5%是IgM。
24.如權(quán)利要求23所述的含有IgM的抗體制劑，所述抗體制劑在2°C 8°C儲存時穩(wěn)定至少2年。
25.如權(quán)利要求22 24中任一項所述的抗體制劑，其中，所述制劑含有至少15%的IgM。
26.如權(quán)利要求25所述的抗體制劑，其中，所述制劑含有至少20%的IgM。
27.如權(quán)利要求26所述的抗體制劑，其中，所述制劑含有20% 30%的IgM。
28.如權(quán)利要求22 27中任一項所述的抗體制劑，所述制劑還包含穩(wěn)定劑。
29.如權(quán)利要求28所述的抗體制劑，其中，所述穩(wěn)定劑是甘氨酸。
30.如權(quán)利要求22 29中任一項所述的抗體制劑，其中，所述免疫球蛋白未受到化學(xué)修飾。
31.一種含有IgM的免疫球蛋白組合物，所述免疫球蛋白組合物能夠通過權(quán)利要求I 9中任一項所述的方法獲得。
32.如權(quán)利要求22 30中任一項所述的抗體制劑，所述抗體制劑用于醫(yī)藥應(yīng)用。
33.如權(quán)利要求32所述的抗體制劑，所述抗體制劑用于治療免疫紊亂性疾病和細菌感染。
34.如權(quán)利要求33所述的抗體制劑，其中，所述免疫紊亂性疾病是IgM缺陷疾病。
35.權(quán)利要求22 30中任一項所述的抗體制劑在制造用于治療免疫紊亂性疾病和細菌感染的藥物中的應(yīng)用。
36.一種患者的治療方法，所述治療方法包括施用權(quán)利要求22 30中任一項所述的抗體制劑。
37.如權(quán)利要求36所述的治療方法，其中，所述患者患有免疫紊亂性疾病或細菌感染。
全文摘要
本發(fā)明提供一種從包含免疫球蛋白的血漿中制備免疫球蛋白組合物的方法，以及用該方法制得的抗體制劑。
文檔編號A61L2/10GK102939111SQ201180029338
公開日2013年2月20日 申請日期2011年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月22日
發(fā)明者W·莫勒爾, D·魯?shù)履峥? O·曼尼格, M·羅德梅爾, H·德切特穆勒爾, E·費爾切塞格 申請人:生物測試股份公司