專利名稱：免疫刺激性寡核糖核苷酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一般而言，本發(fā)明涉及免疫學(xué)領(lǐng)域，更具體地涉及免疫刺激性分子。更特別地，本發(fā)明涉及具有免疫刺激活性的核糖核酸(RNA)分子，包括寡核糖核苷酸。
背景技術(shù)：
Toll樣受體(TLR)是高度保守的模式識(shí)別受體(PRR)多肽家族，其識(shí)別與病原體結(jié)合的分子模式(PAMP)，在哺乳動(dòng)物的先天免疫(innate immunity)中起關(guān)鍵作用。目前已經(jīng)鑒定出了至少十個(gè)家族成員，它們被命名為TLR1-TLR10。多種TLR的胞漿結(jié)構(gòu)域特征在于 jToll-白介素 1 受體(TIR)結(jié)構(gòu)域。Medzhitov R et al. (1998)Mol Cell 2 :253_8。 TLR對(duì)微生物侵入的識(shí)別引發(fā)信號(hào)級(jí)聯(lián)放大的激活，這在果蠅(Drosophila)和哺乳動(dòng)物中是保守的。已經(jīng)報(bào)導(dǎo)含IlR結(jié)構(gòu)域的適體蛋白MyD88與TLR結(jié)合，將與白介素1受體結(jié)合的激酶(IRAK)和腫瘤壞死因子(TNF)受體結(jié)合的因子6(TRAF6)募集至TLR。人們認(rèn)為， MyD88-依賴性的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑導(dǎo)致NF-κ B轉(zhuǎn)錄因子和c-Jim NH2末端激酶(Jnk)促有絲分裂劑(mitogen)-激活的蛋白激酶(MAPK)的活化，這是免疫激活中及炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生的關(guān)鍵步驟。綜述參閱 Aderem A et al. (2000)Nature 406 :782-87和Akira S et al. (2004) Nat Rev Immunol 4 :499-511。已經(jīng)鑒定出了大量的特異性TLR配體。TLR2的配體包括肽聚糖和脂肽。Yoshimura A et al. (1999) J Immunol 163 1-5 ；Yoshimura A et al. (1999) J Immunol 163:1—5; Aliprantis AO et al. (1999) Science 285 :736_9。脂多糖(LPS)是TLR4 的配體。Poltorak A et al. (1998)Science 282 :2085-8 ；Hoshino K et al. (1999)J Immunol 162 :3749_52。 細(xì)菌鞭毛蛋白是 TLR5 的配體。Hayashi F et al. (2001)Nature 410:1099-1103。已經(jīng)報(bào)導(dǎo)肽聚糖不僅是TLR2的配體，而且還是TLR6的配體。Ozinsky A et al. (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97 :13766-71 ；Takeuchi 0 et al. (2001)Int Immunol 13 :933—40。 最近報(bào)導(dǎo)某些低分子量合成化合物咪唑喹啉咪喹莫德(imidazoquinolines imiquimod, R-837)和瑞喹莫德(resiquimod，R-848)是 TLR7 和 TLR8 的配體。Hemmi H et al. (2002) Nat Immunol 3 :196-200 Jurk M et al. (2002)Nat Immunol 3 :499。從近來發(fā)現(xiàn)未甲基化的細(xì)菌DNA及其合成的類似物(CpG DNA)是TLR9的配體 (Hemmi H et al. (2000)Nature 408 :740-5 ；Bauer S et al. (2001)Proc Natl Acad Sci USA 98,9237-42)開始，已經(jīng)有報(bào)導(dǎo)某些TLR的配體包括某些核酸分子。目前已經(jīng)報(bào)導(dǎo)某些類型的RNA以序列非依賴性或序列依賴性形式是免疫刺激性的。另外，已經(jīng)報(bào)導(dǎo)這些多種免疫刺激性RNA能刺激TLR3、TLR7或TLR8
發(fā)明內(nèi)容
一般而言，本發(fā)明涉及含有某些免疫刺激性RNA基序的免疫刺激性的寡核糖核苷酸(ORN)，以及含有這類免疫刺激性O(shè)RN的相關(guān)免疫刺激性組合物，和這類免疫刺激性O(shè)RN 和組合物的使用方法。本發(fā)明的免疫刺激性O(shè)RN適用于任何用于刺激或增強(qiáng)免疫應(yīng)答的裝置(setting)或應(yīng)用中。如下文所公開的，本發(fā)明的免疫刺激性O(shè)RN尤其適用于制備含有佐劑、疫苗、和其它藥劑的藥物組合物，所述藥物組合物用于治療多種病癥，包括感染、癌癥、變態(tài)反應(yīng)和哮喘。因此，本發(fā)明在某些方面涉及含有本發(fā)明的免疫刺激性O(shè)RN的免疫刺激性組合物，以及它們的使用方法。如下文所公開的，本發(fā)明的免疫刺激性O(shè)RN和免疫刺激性組合物尤其適用于下述方法中，所述方法用于激活免疫細(xì)胞，疫苗接種受試者，治療患有免疫系統(tǒng)缺陷的受試者，治療患有感染的受試者，治療患有自身免疫疾病的受試者， 治療患有癌癥的受試者，治療患有變應(yīng)性病癥的受試者，治療患有哮喘、氣道重建(airway remodeling)、促進(jìn)表位擴(kuò)展和抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)的受試者。如下文更詳細(xì)地公開的，本發(fā)明的免疫刺激性O(shè)RN的特征在于它們包含至少一種序列依賴性的免疫刺激性RNA基序。序列依賴性的免疫刺激性RNA基序通常是短的RNA序列，盡管在某些實(shí)施方案中該基序也可以含有修飾，例如經(jīng)修飾的核苷酸間磷酸聯(lián)接、經(jīng)修飾的核堿基(nuclecAase)、經(jīng)修飾的糖、核苷酸類似物或其任何組合。如下文更詳細(xì)地描述的，在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫刺激性RNA基序存在于本發(fā)明的較長免疫刺激性O(shè)RN的環(huán)境中。免疫刺激性RNA基序也可以存在于嵌合的DNA:RNA核酸分子的環(huán)境中。序列依賴性的免疫刺激性RNA基序和加入有了這些基序的免疫刺激性O(shè)RN被公開為TLR8的激動(dòng)劑。更具體地，至少某些序列依賴性免疫刺激性RNA基序、免疫刺激性O(shè)RN 和免疫刺激性DNA: RNA核酸分子被公開為是TLR8的激動(dòng)劑而不是TLR7的激動(dòng)劑。根據(jù)本發(fā)明一些方面的免疫刺激性RNA基序是N-U-R1-I^N是核糖核苷酸，并且N不包括U。在一些實(shí)施方案中，N為腺苷或胞嘧啶(C)或其衍生物。U是尿嘧啶或其衍生物。R是核糖核苷酸，其中隊(duì)和&至少之一是腺苷(A)或胞嘧啶或其衍生物。R不是 U,除非N-U-R1-K含有至少兩個(gè)A。本發(fā)明的ORN含有至少一個(gè)以及在一些實(shí)施方案中含有多于一個(gè)(即2、3或4個(gè)) 免疫刺激性基序N-U-R1-I^ ORN不含有TLR7/8基序。ORN優(yōu)選長度為4-100，并任選地含有至少一處主鏈修飾。在一些實(shí)施方案中N-U-R1-Ii2可含有至少3個(gè)As或至少2個(gè)Cs。任選地，N-U-R1-Ii2 含有至少一個(gè)G或C。在一些實(shí)施方案中，ORN不是 ACCCAUCUAUUAUAUAACUC (SEQ ID NO 89)。在其它一些實(shí)施方案中，ORN基序通過非核苷酸接頭與5’核糖核苷酸分隔。還在其它一些實(shí)施方案中，ORN基序通過非核苷酸接頭與3’核糖核苷酸分隔。任選地，ORN基序通過非核苷酸接頭與5’和3’核糖核苷酸分隔。ORN還包含可藥用的運(yùn)載體，其任選地是脂質(zhì)運(yùn)載體如N- [1- (2，3_ 二油酰氧)丙基]-N，N, N三甲基銨甲基硫酸酯(DOTAP)。在其它一些實(shí)施方案中，ORN不與DOTAP復(fù)合。ORN可以是單鏈或雙鏈的。在其它一些實(shí)施方案中，ORN含有至少一個(gè)AU。還在其它一些實(shí)施方案中，ORN含有至少一個(gè)⑶。在一些實(shí)施方案中，ORN為以下之一A*U*A*G*G*C*A*C(SEQ ID NO :4)、G*C*C*
A氺C氺C氺G氺A氺G氺C氺C氺G氺A氺A氺U氺A氺U氺A氺OKC(SEQ ID NO :11)、A氺U氺A氺U氺A氺U氺A氺U氺A氺U氺A氺U氺A氺 (SEQ ID NO : 12)、U氺U氺A氺U氺U氺A氺U氺U氺A氺U氺U氺A氺U氺U氺A氺U氺U氺A氺U氺U (SEQ ID NO 13)、A氺A氺U氺A氺A氺U氺A氺A氺U氺A氺A氺U氺A氺A氺U氺A氺A氺U氺A氺A (SEQ ID NO 16)、A氺A氺A氺U氺A氺A氺A 氺U氺A氺A氺A氺U氺A氺A氺A氺U氺A氺A氺A氺U(SEQ ID NO 17) >A氺A氺A氺A氺U氺A氺A氺A氺A氺U氺A氺A氺A氺A氺U氺A氺A氺
A*A*U(SEQ ID NO :1 、C*U*A*C*U*A*C*U*A*C*U*A*C*U*A*C*U*A*C*U(SEQ ID NO :24)、
(SEQ ID NO 30),(SEQ ID NO :3 、
U*U*A*C*C*C (SEQ ID NO :幼)、C*C*G*A*G*C*C*G*A*U*U*G*A*A*C*C (SEQ ID NO :76)、C*C*
G氺A氺G氺C氺C氺G氺A氺A氺U氺A氺C氺C氺C氺C(SEQ ID NO :42)、C氺C氺G氺A氺G氺C氺C氺A氺U氺A氺U氺A氺U氺A氺U氺C(SEQ
ID NO 39)、C*C*G*A*G*C*C*G*A*U*A*U*U*A*C*C(SEQ ID NO 65)、C*C*G*A*G*C*C*G*A*A* U*C*C*C*C*C (SEQ ID NO :44)、C*C*G*A*G*C*C*G*C*C*U*A*C*C*C*C (SEQ ID NO :47)、C*C*
(SEQ ID NO 38) >(SEQ
ID NO 37)、C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*U*A*A*C*C*C(SEQ ID NO :40)、C*C*G*A*G*C*C*G*C*U* A*U*C*C*C*C(SEQ ID NO 55)、C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*G*G*U*A*C*C(SEQ ID NO 82)、C*C*
G氺A氺G氺C氺C氺G氺A氺A氺G氺A氺U氺A氺C氺C(SEQ ID NO :85)、C氺C氺G氺A氺G氺C氺C氺G氺A氺A氺U氺G氺U氺A氺C氺C(SEQ
ID NO 63)、C*C*G*A*G*C*C*G*C*C*U*A*A*C*C*C(SEQ ID NO 43)、C*C*G*A*G*C*C*G*C*A* U*A*U*C*C*C(SEQ ID NO :36)、C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*G*C*U*A*C*C(SEQ ID NO :87)、C*C*
(SEQ ID NO 45) >(SEQ
ID NO 41)、C氺C氺G氺A氺G氺C氺C氺G氺A氺A氺G氺G氺U氺G氺C氺C (SEQ ID NO 83)、C氺C氺G氺A氺G氺C氺C氺G氺C氺A氺 U*C*C*C*C*C(SEQ ID NO :46)、C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*G*C*U*G*C*C(SEQ ID NO 88)、C*C* G*A*G*OOG*OOG*OOOOC (SEQ ID NO 35) >(SEQ
ID NO :84)，或 C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*G*G*C*A*C*C(SEQ ID NO :56)。ORN特別排除TLR7/8基序。TLR7/8基序可含有例如選自以下的核糖核苷酸序列(i)5' -C/U-U-G/U-U-3‘，(ii)5' -R-U-R-G-Y-3‘，(iii)5' -G-U-U-G-B-3‘，(iv)5' -G-U-G-U-G/U-3 ‘，禾口(ν) 5' -G/C-U-A/C-G-G-C-A-C-3‘，其中C/U為胞嘧啶(C)或尿嘧啶(U)，G/U為鳥嘌呤(G)或U，R為嘌呤，Y為嘧啶， B為U、G或C，G/C為G或C，且A/C為腺嘌呤㈧或C。在多種實(shí)施方案中，5‘ -C/U-U-G/U-U-3 ‘為 CUGU、CUUU, UU⑶或 UUUU。在多種實(shí)施方案中，5'-R-U-R-G-Y-3 ‘為 GUAGU、GUAGC、⑶GGU、⑶GGC、AUAGU、 AUAGC, AUGGU或AUGGC。在一個(gè)實(shí)施方案中，堿基序列為GUA⑶⑶。在多種實(shí)施方案中，5' -G-U-U-G-B-3‘為⑶UGU、⑶UGG或GUUGC。在多種實(shí)施方案中，5' -G-U-G-U-G/U-3'為GUGUG或GUGUU。在一個(gè)實(shí)施方案中， 堿基序列為GUGUUUAC。在多種實(shí)施方案中，5'-G/C-U-A/C-G-G-C-A-C-3 ‘為 GUAGGCAC、GUCGGCAC、 CUAGGCAC 或 CUCGGCAC。
本發(fā)明的一個(gè)方面提供了包含本發(fā)明免疫刺激性O(shè)RN和佐劑的免疫刺激性組合物。在多種實(shí)施方案中，佐劑為產(chǎn)生儲(chǔ)存作用(depot effect)的佐劑、免疫刺激性佐劑、或產(chǎn)生儲(chǔ)存作用并刺激免疫系統(tǒng)的佐劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明該方面的免疫刺激性組合物是免疫刺激性O(shè)RN和佐劑的綴合物。在根據(jù)本發(fā)明該方面的一個(gè)實(shí)施方案中，免疫刺激性O(shè)RN與佐劑共價(jià)連接。在其它一些實(shí)施方案中它們不綴合。在一個(gè)實(shí)施方案中， 佐劑是TLR9的激動(dòng)劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，佐劑是免疫刺激性的CpG核酸。本發(fā)明的組合物可任選地含有抗原。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面提供了下述疫苗，其中所述疫苗含有本發(fā)明的免疫刺激性O(shè)RN和抗原。本發(fā)明的一個(gè)方面提供了一種疫苗，所述疫苗含有本發(fā)明的免疫刺激性O(shè)RN和抗原的綴合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明該方面的綴合物含有與抗原共價(jià)連接的免疫刺激性0RN。在其它一些實(shí)施方案中，它們不綴合。在多個(gè)實(shí)施方案中，抗原可以是抗原本身?？乖梢允侨魏慰乖?，包括癌癥抗原、微生物抗原或變應(yīng)原。本發(fā)明的一個(gè)方面提供了免疫刺激性組合物，所述組合物含有本發(fā)明的免疫刺激性O(shè)RN與親脂部分的綴合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫刺激性的ORN與親脂部分共價(jià)連接。 在一個(gè)實(shí)施方案中，親脂部分選自膽固醇基、棕櫚基和脂肪?；?。在一個(gè)實(shí)施方案中，親脂部分是膽固醇的衍生物，例如膽固醇基。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫刺激性O(shè)RN含有至少一個(gè)脫氧核糖核苷酸。所述至少一個(gè)脫氧核糖核苷酸通?？梢猿霈F(xiàn)在免疫刺激性RNA基序之外的任何地方。在多個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一個(gè)脫氧核糖核苷酸為 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、 19、20、21、22、23或M個(gè)連續(xù)的脫氧核糖核苷酸。本發(fā)明也考慮了包含非連續(xù)的脫氧核糖核苷酸的免疫刺激性0RN。在多個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)脫氧核糖核苷酸是免疫刺激性O(shè)RN 的5’端、3’端或5’和3’兩端。所述至少一個(gè)脫氧核糖核苷酸也對(duì)應(yīng)于嵌合的DNA:RNA分子的DNA部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，嵌合的DNA: RNA分子的DNA組分包括CpG核酸，即TLR9 激動(dòng)劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，嵌合的DNA: RNA分子的DNA和RNA部分通過核苷酸間磷酸鍵共價(jià)連接。在另一實(shí)施方案中，嵌合的DNA: RNA分子的DNA和RNA部分通過接頭(例如非核苷酸接頭)共價(jià)連接。本發(fā)明的一個(gè)方面提供了免疫刺激性組合物，所述組合物包含共價(jià)閉合的、部分單鏈的、 鈴形的核酸分子，其中該分子的至少一個(gè)單鏈部分包含本發(fā)明的免疫刺激性RNA基序。本發(fā)明的一個(gè)方面提供了包含本發(fā)明前述任何方面的組合物和任選的可藥用運(yùn)載體的藥物組合物，所述組合物與選自以下的遞送媒介物結(jié)合陽離子脂質(zhì)、脂質(zhì)體、螺旋狀的(cochleate)、病毒顆粒、免疫刺激性復(fù)合物(ISCOM)、微粒、微球、毫微球、單層囊泡 (LUV)、多層囊泡、水包油乳劑、油包水乳劑、乳體(emulsome)和聚陽離子肽。在根據(jù)本發(fā)明該方面的一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物包含抗原?？梢栽趪婌F器或吸入器中配制0RN，例如定量吸入器(metered dose inhaler)或干粉吸入器。在一些實(shí)施方案中，ORN還包含額外的組合物，例如化學(xué)治療劑、抗病毒劑或可藥用運(yùn)載體?？伤幱眠\(yùn)載體可以被配制為用于注射或粘膜施用。另外，根據(jù)本發(fā)明的這些方面和其它方面，在多種實(shí)施方案中，免疫刺激性O(shè)RN可任選包含至少一個(gè)5' -5'核苷酸間聯(lián)接、至少一個(gè)3' -3'核苷酸間聯(lián)接、至少一個(gè)包含接頭部分的5' -5'核苷酸間聯(lián)接、至少一個(gè)包含接頭部分的3' -3'核苷酸間聯(lián)接，或其任何組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，接頭部分是非核苷酸接頭部分。另外，還根據(jù)本發(fā)明的這些方面和其它方面，在多種實(shí)施方案中，免疫刺激性 ORN可任選包含至少一個(gè)2' -2'核苷酸間聯(lián)接、至少一個(gè)2' -3'核苷酸間聯(lián)接、至少 2' -5'核苷酸間聯(lián)接或其任何組合。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述至少一個(gè)2' -2'核苷酸間聯(lián)接、至少一個(gè)2' -3'核苷酸間聯(lián)接、或至少2' -5'核苷酸間聯(lián)接存在于免疫刺激性 RNA基序之外。還根據(jù)本發(fā)明的這些和其它方面，在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫刺激性O(shè)RN包含至少一個(gè)倍增單元(multiplier unit)。因此，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫刺激性O(shè)RN 可以具有分支結(jié)構(gòu)。分支的組合物可以包含任意組合的3' -5'、5' -5'、3' -3'、 2' -2'、2' -3'或2' -5'核苷酸間鍵。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫刺激性O(shè)RN包含至少兩個(gè)倍增單元，產(chǎn)生所謂的樹狀聚體(dendrimer)。另外，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫刺激性O(shè)RN可包含兩個(gè)或更多的免疫刺激性RNA基序，其例如在分支結(jié)構(gòu)的不同臂上沿線性O(shè)RN隨機(jī)排列，或均沿線性O(shè)RN隨機(jī)排列并位于分支結(jié)構(gòu)的不同臂上。分支結(jié)構(gòu)(包括樹狀聚體)可任選的包含至少一個(gè)免疫刺激性的CpG核酸，例如作為分支結(jié)構(gòu)的獨(dú)立臂。還根據(jù)本發(fā)明的這些和其它方面，在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫刺激性O(shè)RN不包含CG DNA或RNA 二核苷酸。本發(fā)明的一個(gè)方面提供了用于下調(diào)免疫抑制性CD4+調(diào)節(jié)(Treg)細(xì)胞的方法。根據(jù)本發(fā)明該方面的方法包括下述步驟將CD4+Treg細(xì)胞與有效量的含本發(fā)明的TLR8-特異性免疫刺激ORN的組合物接觸，以降低⑶4+Treg細(xì)胞的抑制作用。在一個(gè)實(shí)施方案中，組合物包含TLR8-特異性O(shè)RN和免疫刺激性CpG核酸，其中TLR8-特異性O(shè)RN和免疫刺激性 CpG核酸未連接。在一個(gè)實(shí)施方案中，組合物含有TLR8-特異性O(shè)RN和免疫刺激性CpG核酸，其中TLR8-特異性的ORN和免疫刺激性CpG核酸作為綴合物存在。本發(fā)明另一方面提供了用于調(diào)控受試者中免疫應(yīng)答的方法。根據(jù)本發(fā)明該方面的方法包括對(duì)受試者施用有效量的本發(fā)明組合物的步驟。在一些實(shí)施方案中，ORN可以被遞送給受試者，以在受試者中治療自身免疫疾病或氣道重建。ORN可以單獨(dú)或與抗原一起被施用給受試者。任選地，以例如口、鼻、舌下、靜脈內(nèi)、皮下、粘膜、呼吸、直接注射和經(jīng)皮的途徑遞送ORN。ORN可以以有效量遞送給受試者以誘導(dǎo)細(xì)胞因子表達(dá)，例如TNFa、IL_10、IL_6、 IFN-γ、MCPl 禾口 IL-12。本發(fā)明的一個(gè)方面提供了對(duì)受試者疫苗接種的方法。根據(jù)本發(fā)明該方面的方法包括對(duì)受試者施用抗原和本發(fā)明的免疫刺激性O(shè)RN的步驟。本發(fā)明的一個(gè)方面提供了用于治療受試者的方法，所述受試者患有傳染性疾病或具有患傳染性疾病的風(fēng)險(xiǎn)。根據(jù)本發(fā)明該方面的方法包括對(duì)受試者施用有效量的本發(fā)明組合物的步驟。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括對(duì)受試者施用有效量的本發(fā)明免疫刺激性O(shè)RN 的步驟。在一個(gè)實(shí)施方案中，受試者患有病毒感染。病毒感染可以是例如乙型肝炎或丙型肝炎。也可以對(duì)受試者施用抗病毒劑。任選地，抗病毒劑與ORN連接。本發(fā)明的一個(gè)方面提供了用于治療受試者的方法，所述受試者患有癌癥或具有患癌癥的風(fēng)險(xiǎn)。根據(jù)本發(fā)明該方面的方法包括對(duì)受試者施用有效量的本發(fā)明組合物的步驟。 在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括對(duì)受試者施用有效量的本發(fā)明免疫刺激性O(shè)RN的步驟。在一個(gè)實(shí)施方案中，也對(duì)受試者施用化學(xué)治療或輻射。本發(fā)明的一個(gè)方面提供了用于治療受試者的方法，所述受試者患有癌癥或具有患癌癥的風(fēng)險(xiǎn)。根據(jù)本發(fā)明該方面的方法包括對(duì)受試者施用有效量的組合物的步驟，所述組合物含有本發(fā)明的TLR8-特異性免疫刺激性O(shè)RN以降低CD4+Treg細(xì)胞的抑制作用。在一個(gè)實(shí)施方案中，組合物包含TLR8-特異性O(shè)RN和免疫刺激性CpG核酸，其中TLR8-特異性O(shè)RN 和免疫刺激性CpG不連接。在一個(gè)實(shí)施方案中，組合物包含TLR8-特異性O(shè)RN和免疫刺激性CpG核酸，其中TLR8-特異性O(shè)RN和免疫刺激性CpG核酸作為綴合物存在。本發(fā)明的一個(gè)方面提供了用于治療受試者的方法，所述受試者患有變應(yīng)性病癥或具有患變應(yīng)性病癥的風(fēng)險(xiǎn)。根據(jù)本發(fā)明該方面的方法包括對(duì)受試者施用有效量的本發(fā)明組合物的步驟。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括對(duì)受試者施用有效量的本發(fā)明免疫刺激性O(shè)RN 的步驟。在一個(gè)實(shí)施方案中，受試者患有變應(yīng)性鼻炎。本發(fā)明的一個(gè)方面提供了用于治療受試者的方法，所述受試者患有哮喘或具有患哮喘的風(fēng)險(xiǎn)。根據(jù)本發(fā)明該方面的方法包括對(duì)受試者施用有效量的本發(fā)明組合物的步驟。 在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括對(duì)受試者施用有效量的本發(fā)明免疫刺激性O(shè)RN的步驟。在一個(gè)實(shí)施方案中，哮喘是被病毒感染加重的哮喘。ORN可以單獨(dú)或與變應(yīng)原一起被施用。本發(fā)明的另一方面提供了用于治療患有氣道重建的受試者的方法。根據(jù)本發(fā)明該方面的方法包括對(duì)受試者施用有效量的本發(fā)明免疫刺激性O(shè)RN的步驟。本發(fā)明的一個(gè)方面提供了用于提高抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)的方法。根據(jù)本發(fā)明該方面的方法包括下述步驟對(duì)需要增加的ADCC的受試者施用有效量的本發(fā)明的免疫刺激性O(shè)RN和抗體，以增加ADCC。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體是對(duì)癌癥抗原或癌細(xì)胞表達(dá)的其它抗原特異的抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體為IgG抗體。本發(fā)明的一個(gè)方面提供了用于增強(qiáng)表位擴(kuò)展的方法。根據(jù)本發(fā)明該方面的方法包括下述順序步驟將免疫系統(tǒng)的細(xì)胞與抗原接觸，隨后將該細(xì)胞與至少兩份劑量的本發(fā)明的免疫刺激性O(shè)RN接觸。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法體內(nèi)進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括下述步驟以能有效誘導(dǎo)多重表位特異性免疫應(yīng)答的量對(duì)受試者施用包含抗原和佐劑的疫苗，隨后對(duì)受試者施用至少兩份劑量的本發(fā)明的免疫刺激性0RN。該方法在一個(gè)實(shí)施方案中涉及應(yīng)用治療方案，所述方案導(dǎo)致受試者中的免疫系統(tǒng)抗原暴露，然后以能有效誘導(dǎo)多重表位特異性免疫應(yīng)答的量對(duì)受試者施用至少兩份劑量的本發(fā)明的免疫刺激性0RN。 在多種實(shí)施方案中，治療方案為手術(shù)、輻射、化學(xué)治療、其它癌癥藥劑、疫苗或癌癥疫苗。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少兩份劑量的免疫刺激性O(shè)RN彼此隔開至少一天到一周被施用。 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少兩份劑量的免疫刺激性O(shè)RN彼此隔開至少一周到一個(gè)月被施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少兩份劑量的免疫刺激性O(shè)RN彼此隔開至少一個(gè)月到六個(gè)月被施用。一方面，本發(fā)明是通過將表達(dá)TLR8的細(xì)胞與下述用量的包含N-U-R1-I的RNA寡核糖核苷酸(ORN)接觸，其中N是核糖核苷酸且N不包括U，U是尿嘧啶或其衍生物，R是核糖核苷酸，其中札和&至少之一是腺苷(A)或胞嘧啶或其衍生物，其中R不是U，除非 N-U-R1-R2含有至少兩個(gè)A，其中所述ORN不包含TLR7/8基序，并且其中所述ORN長度為 4-100，所述用量有效刺激前炎性細(xì)胞因子生產(chǎn)并且其中應(yīng)答于ORN的IFN-α生產(chǎn)相對(duì)于背景而言不被顯著誘導(dǎo)。在一些實(shí)施方案中，應(yīng)答于ORN的IFN-α生產(chǎn)少于300pg/ml。在一個(gè)實(shí)施方案中，ORN 不是 ACCCAUCUAUUAUAUAACUC (SEQ ID NO 89)。ORN 可以與 N_[l_(2， 3-二油酰氧)丙基]-N，N，N三甲基銨甲基硫酸酯(DOTAP)復(fù)合或不復(fù)合。在一些實(shí)施方案中，表達(dá)TLR8的細(xì)胞是單核細(xì)胞或mDC。還在其它一些實(shí)施方案中，表達(dá)TLR8的細(xì)胞是體外的或體內(nèi)的。本發(fā)明的這些和其它特征將在發(fā)明詳述部分被更詳細(xì)地描述。附圖概述

圖1是描述在PBMC刺激時(shí)由ORN誘導(dǎo)的細(xì)胞因子生產(chǎn)。通過測(cè)量IFN-α和TNF-α 細(xì)胞因子生產(chǎn)，觀察到TLR8和TLR7/8之間的差異。在完全滴定曲線上用與D0TAP(25y g/ ml，1/3稀釋度)復(fù)合的指定0RM2yM，l/3稀釋度)或用R-848 O μ M，1/3稀釋度)刺激人 PBMC0 16小時(shí)后收集上清液，并通過ELISA測(cè)量IFN- α (圖Ia)和TNF- α (圖lb)。數(shù)據(jù)顯示了至少三份獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的三個(gè)血供體的均值。DOTAP單獨(dú)不顯示作用。ORN可與DOTAP復(fù)合， R-848不復(fù)合。DOTAP單獨(dú)是對(duì)照。在圖Ic中，用與DOTAP O. 2 μ g/ml)或與R-848 O μ Μ) 復(fù)合的0. 2 μ M指定的ORN刺激人PBMC。16小時(shí)后收集上清液并通過ELISA測(cè)量IFN-α (左圖)和TNF-α (右圖)。數(shù)據(jù)顯示了 3個(gè)供體的均值(士SEM)。圖2是一組柱狀圖，其描述了經(jīng)分離的pDC(圖2a)、單核細(xì)胞(圖2b)和mDC(圖 2c)刺激時(shí)由ORN誘導(dǎo)的細(xì)胞因子生產(chǎn)。用與10μ g/mlD0TAP、0. 5μΜ CpG ODN或DOTAP 復(fù)合的0. 5 μ M ORN或單獨(dú)的培養(yǎng)基刺激細(xì)胞，并測(cè)量IFN- α (圖加)、TNF- α (圖2c)和 IL-12p40(圖 2c)。圖3是一組柱狀圖，其闡述了 PBMC刺激時(shí)由ORN誘導(dǎo)的細(xì)胞因子生產(chǎn)。用與10 μ g/ml DOTAP復(fù)合的指定ORN(0. 5 μ M 0RN)刺激人PBMC,并通過ELISA技術(shù)測(cè)量 IFN-α (圖3Α)和TNF-α (圖3Β)和通過Luminex技術(shù)測(cè)量細(xì)胞因子生產(chǎn)。圖4是闡述指定ORN的(圖4a)和TNF- α (圖4b)最大活性比較的柱狀圖。用與 DOTAP (從25 μ g/ml開始，稀釋度1/3)復(fù)合的ORN(7種濃度，從2 μ g/ml開始，1/3稀釋度) 刺激人PBMC，并對(duì)兩份單獨(dú)實(shí)驗(yàn)中0. 6 μ M處3-6個(gè)血供體的平均最大活性進(jìn)行了測(cè)定。圖5是闡述IFN- α最大活性(圖5a)與IFN- α EC50 (圖5b)比較的柱狀圖。用于DOTAP復(fù)合的ORN刺激人PBMC并測(cè)量IFN- α。圖6 是一組圖，其比較了帶有 TLR8 (SEQ ID NO :13)或 TLR7/8 (SEQ ID NO :21)的 ORN對(duì)3個(gè)血供體的PBMC、經(jīng)分離的pDC或經(jīng)分離的單核細(xì)胞的滴定曲線。用與DOTAP (從 25 μ g/ml開始，1/4稀釋度)復(fù)合的ORN (4種濃度，從1 μ g/ml開始，1/4稀釋度)刺激細(xì)胞。 16小時(shí)后收集上清液并通過Luminex技術(shù)測(cè)量細(xì)胞因子生產(chǎn)。圖顯示SEQ ID NO =21(0, 3μΜ)細(xì)胞因子生產(chǎn)百分比。圖7-1到7-4顯示了一組柱形圖，其闡述在任何濃度的3個(gè)血供體對(duì)PMBC、經(jīng)分離的單核細(xì)胞、經(jīng)分離的PDC和⑶14-⑶123-PBMC的平均最大活性。用與DOTAP (從25 μ g/ml 開始，1/4稀釋度)復(fù)合的ORN(4種濃度，從1 μ g/ml開始，1/4稀釋度)刺激細(xì)胞。16小時(shí)后收集上清液并通過Luminex技術(shù)測(cè)量細(xì)胞因子生產(chǎn)。紅色正方形指示在DOTAP和培養(yǎng)基的背景上的陽性反應(yīng)。圖 8 是一組柱形圖，其顯示了 TLR8 (SEQ ID NO 13)和 TLR7/8 (SEQ ID NO 21) ORN 之間的差異。用與DOTAP (從25 μ g/ml開始，1/4稀釋度)復(fù)合的0RM4種濃度，從1 μ g/ ml開始，1/4稀釋度)刺激細(xì)胞。16小時(shí)后收集上清液并通過Luminex技術(shù)測(cè)量細(xì)胞因子生產(chǎn)。圖表顯示測(cè)量的任何濃度下的平均最大細(xì)胞因子生產(chǎn)，其表示為TLR8 ORN(SEQ ID NO 13)比TLR7/8 ORN (SEQ ID NO 21)的百分比。針對(duì)經(jīng)分離的pDC、PBMC、經(jīng)分離的單核細(xì)胞和CD123-CD14-PBMC顯示。
圖9是一組圖和曲線，其顯示了經(jīng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HEK-293細(xì)胞中通過TLR8作用的 TLR8 ORN(SEQ ID NO 13)和TLR7/8 ORN(SEQ ID NO 21)的反應(yīng)。用指定的ORN將HEK-293 細(xì)胞刺激16小時(shí)，所述HEK-293細(xì)胞用NF κ B-螢光素酶讀出報(bào)告子和人TLR8穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。 16個(gè)小時(shí)后去除上清液，將細(xì)胞裂解并測(cè)量螢光素酶活性或細(xì)胞因子水平。圖9a和9b顯示了刺激后NFK B-螢光素酶的倍數(shù)誘導(dǎo)。圖9c顯示了存在抑制劑時(shí)刺激后NF κ B-螢光素酶的倍數(shù)誘導(dǎo)。圖9d顯示了通過螢光素酶測(cè)定測(cè)量的刺激后的IP-10刺激。
圖10是一組圖表，其顯示了用富含AU或富含⑶的ORN刺激的人pDC上的表面標(biāo)記物表達(dá)。用與25 μ g/ml DOTAP復(fù)合的1 μ M ORN或單獨(dú)用DOTAP (圖IOa)，或指定量的與 DOTAP復(fù)合的ORN或單獨(dú)用DOTAP (圖IOb-IOc)孵育CD123+經(jīng)純化的pDC(圖IOa和IOb) 或經(jīng)分離的單核細(xì)胞(圖IOc)。16小時(shí)后收集細(xì)胞并用⑶123、⑶Ilc和HLA-DR抗體(圖 IOa 和 IOb)或 CD14 和 CD19 (圖 IOc)染色。通過 CD86 (圖 IOa 和 IOb)或 CD80 (圖 IOc)表達(dá)測(cè)量細(xì)胞表面標(biāo)記物激活。圖IOa顯示FACS分析，其證明了富含AU的0RN(SEQ ID NO 13)和富含⑶的ORN(SEQ ID NO 21)在pDC刺激時(shí)的⑶86表面標(biāo)記物表達(dá)中顯示差異。 圖IOb是闡述人pDC刺激時(shí)的⑶86表面標(biāo)記物表達(dá)是劑量依賴性的。圖IOc是顯示以下內(nèi)容的圖富含AU的ORN(SEQ ID NO 13)和富含GU的ORN(SEQ ID NO 21)在人PBMC (數(shù)據(jù)未顯示)和⑶14-陽性細(xì)胞刺激時(shí)在⑶80表面標(biāo)記物表達(dá)中顯示無差異。
圖 11 是一組柱形圖，其顯示了 TLR8 ORN(SEQ ID NO :13)和 TLR7/80RN(SEQ ID NO 21)之間的差異。使用SEQ ID NO 5 ORN作為對(duì)照。將牛PBMC與10 μ g/ml ORN(HD) 或2. 5 μ g/ml ORN(LD)孵育48小時(shí)。收集上清液并用ELISA分析。圖lla_c分別顯示了 IL-12、IFN- γ 和 TNF- α 的水平。
圖12是一組展示出下述內(nèi)容的圖表鼠細(xì)胞體內(nèi)或體外不應(yīng)答于富含AU的ORN SEQ ID NO: 13。使用的細(xì)胞是小鼠巨噬細(xì)胞系RaW64. 7細(xì)胞(圖12a)、J774細(xì)胞(圖 12b)、經(jīng)純化的小鼠CDllc+細(xì)胞(svU9小鼠)(圖12c-12g)和體內(nèi)小鼠細(xì)胞。通過ELISA 評(píng)價(jià)細(xì)胞因子濃度。
圖13是展示下述內(nèi)容的圖表大鼠脾細(xì)胞不應(yīng)答于富含AU的ORN SEQ ID N0:13。 將來自3只Sprague-Dawley大鼠的脾細(xì)胞合并，并用指定濃度的SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :13(均與 62. 5 μ g/ml DOTAP 復(fù)合，1/5 稀釋度)、R_848 或 DOTAP 單獨(dú)(62. 5 μ g/ml_>l/5 稀釋度)刺激。20小時(shí)后收集上清液并通過ELISA測(cè)量TNF-α水平。
發(fā)明詳述
本發(fā)明的一部分涉及本發(fā)明的發(fā)明人對(duì)大量序列特異性的免疫刺激性RNA基序的發(fā)現(xiàn)。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)含有免疫刺激性RNA基序的分子(單獨(dú)或與某些其它成分組合) 是重要的免疫刺激性化合物，其在用于治療患有病癥或具有患病癥風(fēng)險(xiǎn)的受試者的大量方法中有用，所述病癥中誘導(dǎo)、增加或更改免疫應(yīng)答會(huì)是有利的。在一個(gè)實(shí)施方案中，本文所使用的本發(fā)明的免疫刺激性組合物是本發(fā)明的免疫刺激性0RN。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)某些序列特異性RNA基序是免疫刺激性的，其通過TLR8作用，與作用于 TLR7和TLR8的其它基序(富含GU和富含CU)相反。RNA寡核苷酸(RON)(優(yōu)選含有富含AU的序列)通過TLR8刺激免疫應(yīng)答。已經(jīng)在不同種類的ORN (例如含有含AU和含⑶重復(fù)的0RN)中觀察到IFN- α、TNF- α、IFN- γ和IL-12生產(chǎn)之間的差異。有趣的是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的免疫刺激性O(shè)RN生產(chǎn)強(qiáng)的前炎性細(xì)胞因子應(yīng)答，而IFN-α和IFN-α相關(guān)的分子除外。用這些新穎的ORN刺激時(shí)IFN-α生產(chǎn)減少或缺乏。根據(jù)本發(fā)明一些方面的免疫刺激性RNA基序?yàn)镹-U-R1-I^N是核糖核苷酸，并且N不包括U。在一些實(shí)施方案中，N為腺苷或胞嘧啶(C)或其衍生物。U是尿嘧啶或其衍生物。R是核糖核苷酸，其中隊(duì)和&至少之一是腺苷(A)或胞嘧啶或其衍生物。R不是 U,除非N-U-R1-K含有至少兩個(gè)Α。本發(fā)明的ORN含有至少一個(gè)和在一些實(shí)施方案中含有多于一個(gè)(即2、3或4個(gè)) 免疫刺激性基序N-U-R1-I^ ORN不含有TLR7/8基序。ORN是寡核苷酸。任選地，該寡核苷酸長度為4-100。ORN長度也可以是例如8_40、 15-25或20-30個(gè)核苷酸。ORN任選地含有至少一個(gè)主鏈修飾。在一些實(shí)施方案中N-U-R1-R2可含有至少3個(gè)As或至少2個(gè)Cs。任選地，N-U-R1-R2 含有至少一個(gè)G或C。在一些實(shí)施方案中，ORN不是 ACCCAUCUAUUAUAUAACUC (SEQ ID NO 89)。ORN還可包含可藥用的運(yùn)載體，其任選地是脂質(zhì)運(yùn)載體如N- [1- (2，3_ 二油酰氧) 丙基]-N，N, N三甲基銨甲基硫酸酯(DOTAP)。在其它一些實(shí)施方案中，ORN不與DOTAP復(fù)合。在其它一些實(shí)施方案中可藥用運(yùn)載體可以是肽，如聚陽離子肽。聚陽離子肽包括例如多重的多聚賴氨酸、多聚精氨酸和多聚肽(其在多于5個(gè)、特別是多于8個(gè)氨基酸殘基的范圍內(nèi)含有多于50%的堿性氨基酸、特別是精氨酸或賴氨酸殘基)或其混合物，并可例如含有天然存在的昆蟲抗菌蛋白質(zhì)。在其它一些實(shí)施方案中，ORN含有至少一個(gè)AU。除了是序列特異性的以外，作為單鏈RNA、部分雙鏈RNA或完全雙鏈RNA的免疫刺激性RNA基序是有效的。對(duì)本發(fā)明的ORN和具有TLR7/8基序(即含⑶的重復(fù))的ORN而言，觀察到IFN-α 和IFN-α相關(guān)分子和其它前炎性細(xì)胞因子如TNF-α、IFN-γ、IL-10、IL_6和IL-12的生產(chǎn)之間的清晰差異。具有N-U-R1-I基序的本發(fā)明的0RN，例如那些含有AU或AUU重復(fù)(SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 13)的ORN在PBMC和pDC刺激時(shí)顯示無IFN-α細(xì)胞因子生產(chǎn)。相反，具有一列中三個(gè)或更多U(SEQ ID NO :14, SEQ ID NO :15)的ORN誘導(dǎo)IFN-α生產(chǎn)，盡管存在As。有趣的是，使用相同的、單室用A交換G的ORN組時(shí)，觀察到PBMC刺激時(shí)的強(qiáng) IFN-α生產(chǎn)。本文存在的數(shù)據(jù)強(qiáng)烈地提示兩個(gè)不同ORN種類的存在一種作用于表達(dá)TLR8 的細(xì)胞，如單核細(xì)胞和 mDC (SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 13, SEQ ID NO :16_SEQ ID NO :18)、 含本發(fā)明的N-U-R1-I基序的0RN，另一種作用于表達(dá)TLR7/8 二者的細(xì)胞，例如含有⑶、⑶ 和 GUU 序列的單核細(xì)胞、mDC 和 pDC (SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID N0:19_SEQ ID NO 23)。因此，本發(fā)明的ORN具有誘導(dǎo)免疫應(yīng)答而不誘導(dǎo)相對(duì)于背景的顯著量IFN-α或 IFN-α相關(guān)分子的能力。相對(duì)于背景的顯著量的IFN-a或IFN-α相關(guān)分子優(yōu)選是相對(duì)于背景的IFN-α或IFN-α相關(guān)分子水平改變少于20 %。在一些實(shí)施方案中，其少于 15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%。在其它一些實(shí)施方案中，被誘導(dǎo)的 IFN-α或相關(guān)分子等于背景或少于背景水平。還在其它一些實(shí)施方案中，被本發(fā)明ORN誘導(dǎo)的IFN-α少于或等于被TLR7/8 ORN誘導(dǎo)的IFN-α的20%。被本發(fā)明的ORN誘導(dǎo)的 IFN-α在體外測(cè)試中可任選的少于300pg/ml，或可以具有大于1. 5μΜ的EC50。
本文使用的IFN-a相關(guān)分子是與IFN-α表達(dá)相關(guān)的細(xì)胞因子或因素。這些分子包括但不限于MIPl- β、ΙΡ-10和MIPl- a。
目前報(bào)導(dǎo)⑶4+Treg細(xì)胞表達(dá)TLR8，且這些細(xì)胞中的TLR8信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)降低或逆轉(zhuǎn)了它們的免疫刺激性功能。Peng G et al. (2005) Science309 1380-4。在患有多種類型癌癥的患者中觀察到增加的⑶4+Treg細(xì)胞種群，其中免疫抑制可有助于免疫“逃逸”和下調(diào)這些癌癥的生長。因此，預(yù)計(jì)Treg-介導(dǎo)的抑制的反轉(zhuǎn)在治療癌癥中是有利的。
PRN特別排除TLR7/8基序。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)TLR7/8基序可以產(chǎn)生顯性結(jié)果，其屏蔽了本發(fā)明ORN的獨(dú)特的免疫刺激特性。TLR7/8基序包括例如核糖核苷酸序列，如5 ‘ -C/U-U-G/ U-U-3 ‘、5 ‘ -R-U-R-G-Y-3 ‘、5 ‘ -G-U-U-G-B-3 ‘、5 ‘ -G-U-G-U-G/U-3 ‘或 5 ‘ -G/ C-U-A/C-G-G-C-A-C-3'。C/U是胞嘧啶(C)或尿嘧啶(U)，G/U是鳥嘌呤(G)或U，R是嘌呤， Y是嘧啶，B是U、G或C，G/C是G或C，A/C是腺嘌呤(A)或C。5' -C/U-U-G/U-U-3‘可以是 CU⑶、CUUU、UU⑶或 UUUU。在多個(gè)實(shí)施方案中，5' -R-U-R-G-Y-3‘是 GUA⑶、GUAGC、⑶GGU、 GUGGC、AUA⑶、AUAGC、AUG⑶或AUGGC。在一個(gè)實(shí)施方案中，堿基序列是GUAGUGU。在多個(gè)實(shí)施方案中，5' -G-U-U-G-B-3‘是GUU⑶、GUUGG或⑶UGC。在多個(gè)實(shí)施方案中，5' -G-U-G-U-G/ U-3'是GUGUG或GUGUU。在一個(gè)實(shí)施方案中，堿基序列是GUGUUUAC。在多個(gè)實(shí)施方案中， 5 ‘ -G/C-U-A/C-G-G-C-A-C-3 ‘是 GUAGGCAC、GUCGGCAC、CUAGGCAC 或 CUCGGCAC。
一般而言，本發(fā)明涉及免疫刺激性寡核糖核苷酸，其包含一個(gè)或多個(gè)免疫刺激性 RNA基序、含有一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的免疫刺激性O(shè)RN的免疫刺激性組合物，和本發(fā)明的免疫刺激性O(shè)RN和免疫刺激性組合物的使用方法。
本文使用的術(shù)語“RNA”和等效的“天然RNA”旨在表示通過3' -5'磷酸二酯鍵共價(jià)連接在一起的兩個(gè)或更多的核糖核苷酸(即每個(gè)分子包含與磷酸基和嘌呤或嘧啶核堿基(例如鳥嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶)連接的一個(gè)核糖)。
免疫刺激性的RNA基序可以存在于免疫刺激性O(shè)RN的末端(當(dāng)免疫刺激性O(shè)RN具有游離末端時(shí))。例如，具有游離末端的免疫刺激性O(shè)RN和位于免疫刺激性O(shè)RN末端的免疫刺激性RNA基序可以作為XaM或作為M)(b存在，其中M表示免疫刺激性RNA基序，Xa和)(b 各自獨(dú)立地表示免疫刺激性O(shè)RN除免疫刺激性RNA基序外的一個(gè)或多個(gè)相同或不同的核苷酸。
或者，免疫刺激性RNA基序可以在其兩側(cè)末端連接有免疫刺激性O(shè)RN的至少一個(gè)額外的核苷酸，無論該免疫刺激性O(shè)RN是否具有游離末端。例如，具有游離末端和免疫刺激性RNA基序側(cè)翼的核苷酸的免疫刺激性O(shè)RN可以作為XaMXb存在，其中M表示免疫刺激性 RNA基序，Xa和)(b各自獨(dú)立地表示免疫刺激性O(shè)RN除免疫刺激性RNA基序外的一個(gè)或多個(gè)相同或不同的核苷酸。
在不同的實(shí)施方案中，包含免疫刺激性RNA基序的免疫刺激性O(shè)RN可含有單個(gè)基序或多于一個(gè)的免疫刺激性RNA基序。單個(gè)免疫刺激性O(shè)RN中具有兩個(gè)或更多免疫刺激性RNA基序被認(rèn)為可能是有利的，例如如果基序被隔開使得免疫刺激性O(shè)RN能夠結(jié)合兩個(gè)或更多的TLR的時(shí)候。例如，免疫刺激性O(shè)RN可以結(jié)合兩個(gè)或更多的TLR8受體，從而擴(kuò)增或修飾得到的免疫刺激作用。當(dāng)免疫刺激性O(shè)RN包含多于一個(gè)免疫刺激性RNA基序時(shí)，在一個(gè)實(shí)施方案中免疫刺激性O(shè)RN可作為M1XM2存在，其中M1和M2各自獨(dú)立地表示免疫刺激性RNA基序，X表示免疫刺激性O(shè)RN除免疫刺激性RNA基序外的一個(gè)或多個(gè)相同或不同的核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，X包含本文所述的非核苷酸接頭。在一個(gè)實(shí)施方案中，X包含本文所述的分支單元。當(dāng)免疫刺激性O(shè)RN中存在多于一個(gè)免疫刺激性RNA基序時(shí)，該基序一般可以在沿著免疫刺激性O(shè)RN的任何位置發(fā)生。例如，當(dāng)存在兩個(gè)基序時(shí)，它們可各自存在于免疫刺激性O(shè)RN的末端?；蛘撸粋€(gè)基序可以存在于一個(gè)末端，一個(gè)基序可以通過免疫刺激性O(shè)RN的至少一個(gè)外的核苷酸包圍在其兩側(cè)末端。還在另一實(shí)施方案中，各基序可以通過免疫刺激性O(shè)RN的至少一個(gè)額外的核苷酸包圍在其兩側(cè)末端。免疫刺激性O(shè)RN包括但不限于以下，以從左到右讀出5，到3，顯示在一些實(shí)施方案中，ORN是下表1和表2顯示的活性O(shè)RN之一，例如以下 U*U*A*G*G*C*A*C(SEQ ID NO :2)、A*U*A*G*G*C*A*C(SEQ ID NO :4)、G*C*C*A*C*C*G*A*G*C
氺OKG氺A氺A氺U氺A氺U氺A氺OKC (SEQ ID NO :11)、A氺U氺A氺U氺A氺U氺A氺U氺A氺U氺A氺U氺A氺U氺A氺U氺A氺U氺A氺U (SE
Q ID NO :1 、U*U*A*U*U*A*U*U*A*U*U*A*U*U*A*U*U*A*U*U(SEQ ID NO 13), A*A*U*A*A*
U氺A氺A氺U氺A氺A氺U氺A氺A氺U氺A氺A氺U氺A氺A(SEQ ID NO :16)、A氺A氺A氺U氺A氺A氺A氺U氺A氺A氺A氺U氺A氺A氺A氺U氺A (SEQ ID NO 17)、A氺A氺A氺A氺U氺A氺A氺A氺A氺U氺A氺A氺A氺A氺U氺A氺A氺A氺A氺U(SEQ ID NO 18)> C
ID NO 24),(SEQ ID NO:
30)、U*A*U*A*U*A*U(SEQ ID NO 33)、C*C*G*A*G*C*C*G*C*A*U*U*A*C*C*C(SEQ ID NO 幼)、C*C*G*A*G*C*C*G*A*U*U*G*A*A*C*C(SEQ ID NO :76)、C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*U*A*C*C *C*C(SEQ ID NO :4 、C*C*G*A*G*C*C*A*U*A*U*A*U*A*U*C(SEQ ID NO :3 、C*C*G*A*G*C *C*G*A*U*A*U*U*A*C*C(SEQ ID NO :6 、C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*U*C*C*C*C*C(SEQ ID NO: 44)、C*C*G*A*G*C*C*G*C*C*U*A*C*C*C*C(SEQ ID NO :47)、C*C*G*A*G*C*C*A*U*A*U*A*U*C *C*C(SEQ ID NO 38)、C*C*G*A*G*C*C*G*C*U*A*U*A*C*C*C(SEQ ID NO :37)、C*C*G*A*G*C *C*G*A*A*U*A*A*C*C*C(SEQ ID NO :40)、C*C*G*A*G*C*C*G*C*U*A*U*C*C*C*C(SEQ ID NO: 5 、C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*G*G*U*A*C*C(SEQ ID NO :8 、C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*G*A*U*A *C*C(SEQ ID NO 85)、C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*U*G*U*A*C*C (SEQ ID NO 63)、C*C*G*A*G*C *C*G*OOU*A*A*OOC (SEQ ID NO :4 、OOG*A*G*OOG*OA*U*A*U*OOC (SEQ ID NO: 36)、C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*G*C*U*A*C*C(SEQ ID NO :87)、C*C*G*A*G*C*C*G*C*A*U*A*C*C *C*C(SEQ ID NO 45)、C*C*G*A*G*C*C*G*C*A*U*A*A*C*C*C (SEQ ID NO :41)、C*C*G*A*G*C *C*G*A*A*G*G*U*G*C*C (SEQ ID NO :8 、OOG*A*G*OOG*OA*U*OOOOC (SEQ ID NO: 46)、C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*G*C*U*G*C*C(SEQ ID NO :8 、C*C*G*A*G*C*C*G*C*C*G*C*C*C *C*C(SEQ ID NO :3 、C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*G*C*U*C*C*C(SEQ ID NO :84)或 C*C*G*A*G* C*C*G*A*A*G*G*C*A*C*C(SEQ ID NO :56)。如上所述，RNA是通過3’ -5’磷酸二酯鍵連接的核糖核苷酸的多聚物。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫刺激性O(shè)RN是RNA。然而，本發(fā)明的免疫刺激性O(shè)RN不限于RNA，如下文將描述的。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫刺激性O(shè)RN可以包含兩個(gè)或更多經(jīng)修飾的核堿基，即A、C、G和U的衍生物。這些經(jīng)修飾的核堿基的特定實(shí)施方案包括但不限于5-取代的胞嘧啶(例如5-甲基-胞嘧啶、5-氟-胞嘧啶、5-氯-胞嘧啶、5-溴-胞嘧啶、5-碘-胞嘧啶、5-羥基-胞嘧啶、5-羥甲基-胞嘧啶、5-二氟甲基-胞嘧啶，和未取代的或取代的 5-炔基-胞嘧啶)、6_取代的胞嘧啶，N4-取代的胞嘧啶(例如N4-乙基-胞嘧啶)、5_氮雜-胞嘧啶、2-巰基-胞嘧啶、異胞嘧啶、假異胞嘧啶、帶有稠環(huán)系統(tǒng)的胞嘧啶類似物(例如N，N’ -丙烯胞嘧啶或吩噁嗪)，和尿嘧啶及其衍生物(例如5-氟-尿嘧啶、5-溴-尿嘧啶、5-溴乙烯基-尿嘧啶、4-硫代-尿嘧啶、5-羥基-尿嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶)，胸腺嘧啶衍生物(例如2-硫代胸腺嘧啶、4-硫代胸腺嘧啶、6-取代的胸腺嘧啶)，鳥苷衍生物 (7-脫氮鳥嘌呤、7-脫氮-7-取代的鳥嘌呤(例如7-脫氮-7-(C2-C6)炔基鳥嘌呤)、7_脫氮-8-取代的鳥嘌呤、次黃嘌呤、N2-取代的鳥嘌呤(例如N2-甲基-鳥嘌呤)、8_取代的鳥嘌呤(例如8-羥基鳥嘌呤和8-溴代鳥嘌呤)和6-硫代鳥嘌呤)或腺苷衍生物(5-氨基-3-甲基-3H，6H-噻唑基[4，5-d]嘧啶-2，7- 二酮、2，6- 二氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、嘌呤、 吲哚、腺嘌呤、取代的腺嘌呤(例如N6-甲基-腺嘌呤、8-氧-腺嘌呤))。堿基也可以被通用堿基(例如4-甲基-吲哚、5-硝基-吲哚、3-硝基吡咯、P-堿基和K-堿基)、芳環(huán)(例如苯并咪唑或二氯-苯并咪唑、1-甲基-1H-[1，2，4]三唑-3-羧酸胺)、芳環(huán)系統(tǒng)(例如氟苯或二氟聯(lián)二苯)或氫原子(dSpacer)取代。優(yōu)選的堿基修飾是尿嘧啶和7_脫氮-鳥嘌呤。這些經(jīng)修飾的U核堿基和它們對(duì)應(yīng)的核糖核酸可從商業(yè)供應(yīng)商得來。
經(jīng)修飾的G核堿基的特定實(shí)施方案包括N2-二甲基鳥嘌呤、7-脫氮鳥嘌呤、8-氮雜鳥嘌呤、7-脫氮-7-取代的鳥嘌呤、7-脫氮-7-(C2-C6)炔基鳥嘌呤、7-脫氮-8-取代的鳥嘌呤、8-羥基鳥嘌呤、6-硫代鳥嘌呤和8-氧代鳥嘌呤。在一個(gè)實(shí)施方案中，經(jīng)修飾的G核堿基是8-羥基鳥嘌呤。這些經(jīng)修飾的G核堿基和它們相應(yīng)的核糖核苷可得自商業(yè)供應(yīng)商。
在某些實(shí)施方案中，至少一個(gè)β-核糖單元可以被β-D-脫氧核糖或經(jīng)修飾的糖單元置換，其中經(jīng)修飾的糖單元例如選自β-D-核糖、α-D-核糖、β-L-核糖(如 iSpiegelmers'中)、α -L-核糖、2’ -氨基_2’ -脫氧核糖、2’ -氟_2’ -脫氧核糖、 2'-0-(Cl-C6)烷基核糖，優(yōu)選2' -0-(Cl-C6)烷基核糖為2' -O-甲基核糖、2’-0-(C2-C6) 鏈烯基核糖、2’ -[O-(C1-C6)烷基-0-(Cl-C6)烷基]核糖、LNA 和 α-LNA(Nielsen P et al. (2002) Chemistry-Α European Journal8 :712-22)、β-D-木-呋喃糖、α -阿拉伯呋喃糖、2’ -氟代阿拉伯呋喃糖和碳環(huán)和/或開環(huán)糖類似物(描述于例如Vandendriessche et al. (1993)Tetrahedron49 :7223中)和/或雙環(huán)糖類似物(描述于例如Tarkov M et al. (1993)Helv Chim Acta 76 :481 中)。
或者，本發(fā)明的免疫刺激性O(shè)RN的各核糖核苷酸和核糖核苷可以通過非核酸的接頭連接，尤其是脫堿基接頭(abasic linkers (dSpacers))、三乙二醇單元或六乙烯基乙二醇(hexaethylene glycol)單元。其它接頭為烷氨基(alkylamino)接頭，例如C3、C6和 C12氨基接頭，以及烷基硫醇(alkylthiol)接頭，例如C3或C6硫醇接頭?；蛘?，本發(fā)明的免疫刺激性O(shè)RN的個(gè)體核苷酸和核糖核苷可以通過芳香族殘基連接，所述芳香族殘基還可被烷基或取代的烷基取代。
RNA是通過3’ -5’磷酸二酯聯(lián)接而連起來的核糖核苷酸的多聚物。本發(fā)明的免疫刺激性O(shè)RN的核苷酸也可以通過3’ -5’磷酸二酯聯(lián)接連起來。然而，本發(fā)明也包括具有異常核苷酸間聯(lián)接的0RN，特異地包含5' -5'、3' -3'、2' -2'、2' -3'和2' -5'核苷酸間鍵。在一個(gè)實(shí)施方案中，這類異常聯(lián)接被排除在免疫刺激性RNA基序外，盡管一個(gè)或多個(gè)這種聯(lián)接可存在于免疫刺激性O(shè)RN的別處。對(duì)于具有游離末端的免疫刺激性O(shè)RN而言， 包含一個(gè)3’ -3’核苷酸間聯(lián)接可導(dǎo)致免疫刺激性O(shè)RN具有兩個(gè)游離的5’端。相反，對(duì)于具有游離末端的免疫刺激性O(shè)RN而言，包含一個(gè)5’ -5’核苷酸間聯(lián)接可導(dǎo)致免疫刺激性的 ORN具有兩個(gè)游離的3’末端。本發(fā)明的免疫刺激性組合物可含有兩個(gè)或更多的免疫刺激性RNA基序，其可以通過分支的單元連接。核苷酸間聯(lián)接可以是3' -5'、5' -5'、3' -3'、2' -2'、2' -3' 或2' -5'聯(lián)接。其中，名稱2’-5’根據(jù)核糖的碳原子選擇。異常核苷酸間聯(lián)接可以是磷酸二酯聯(lián)接，但是其也可以被修飾為硫代磷酸酯或本文所述的任何其它經(jīng)修飾的聯(lián)接。下式通過核苷酸分支單元顯示本發(fā)明的分支的免疫刺激性O(shè)RN的一般結(jié)構(gòu)。其中NUl、Nu2和恥3可以通過 3' -5'、5' -5'、3' -3'、2' -2'、2' -3'或 2' -5'-聯(lián)接來連接。免疫刺激性O(shè)RN的分支也可以涉及非核苷酸接頭和脫堿基間隔的使用。在一個(gè)實(shí)施方案中， Nu1^Nu2和Nu3表示相同或不同的免疫刺激性RNA基序。在另一實(shí)施方案中，Nu1、Nu2和Nu3 包含至少一個(gè)免疫刺激性RNA基序和至少一個(gè)免疫刺激性CpG DNA基序。
權(quán)利要求
1.SEQ ID NO 21的寡核苷酸。
2.SEQ ID N0:21的寡核苷酸在制造用于在受試者中調(diào)控免疫應(yīng)答的藥劑中的用途。
3.權(quán)利要求2所述的用途，其中所述寡核苷酸以能誘導(dǎo)細(xì)胞因子表達(dá)的有效量遞送給受試者。
4.權(quán)利要求2所述的用途，其中所述細(xì)胞因子選自IL-6、IL-10、IL-12,TNF-α和 IFN- γ ο
5.組合物，其包含處于可藥用的運(yùn)載體中的SEQID Ν0:21的寡核苷酸。
6.權(quán)利要求5所述的組合物，其還包含下述抗原，其中所述抗原任選地與所述寡核苷酸綴合。
7.權(quán)利要求5或6所述的組合物，其中所述可藥用的運(yùn)載體被配制為用于注射。
8.權(quán)利要求5或6所述的組合物，其中所述可藥用的運(yùn)載體被配制為用于口服施用、鼻施用、舌下施用、粘膜施用、呼吸施用或經(jīng)皮施用。
全文摘要
本發(fā)明涉及免疫刺激性寡核糖核苷酸。本發(fā)明提供了免疫刺激性組合物以及這些化合物在藥物制備以及體外用途中的用途，所述藥物用于治療疾病。本發(fā)明的組合物尤其包括加入了序列依賴性免疫刺激性序列基序的免疫刺激性寡核糖核苷酸。本發(fā)明提供了涉及磷酸聯(lián)接、核苷酸類似物、加合物及其組合的特定修飾?？梢匀芜x地含有抗原的本發(fā)明組合物能夠單獨(dú)使用，或與其它治療一起用于刺激或增強(qiáng)免疫應(yīng)答。本發(fā)明還提供了適用于治療下述受試者的方法，所述受試者患有感染、癌癥、變應(yīng)性病癥、哮喘、氣道再造或免疫缺陷。本發(fā)明的免疫刺激性寡核糖核苷酸被認(rèn)為能刺激Toll樣受體8(TLR8)。
文檔編號(hào)A61K31/7115GK102517292SQ20111043092
公開日2012年6月27日 申請(qǐng)日期2006年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月25日
發(fā)明者亞歷山大·福斯巴赫, 格雷森·B·利浦福德, 約爾格·沃爾梅爾 申請(qǐng)人:科勒制藥股份公司, 科勒制藥集團(tuán)公司