專利名稱：攜帶抗腫瘤化療藥物的蛋白微納米球及其制法的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于抗腫瘤藥物領域，特別涉及一種攜帶抗腫瘤化療藥物的蛋白微納米球及其制法。
背景技術：
微納米球，是指藥物分散或被吸附在高分子、聚合物基質(zhì)中而形成的，大小在IO-1OOOnm的納米級分散體系，按照載體的不同可分為聚氰基丙烯酸酯毫微粒、白蛋白毫微粒、聚乳酸類毫微粒、脂質(zhì)納米粒等不同類型。將蛋白質(zhì)或多肽制成微納米球系統(tǒng)給藥，不僅能有效防止藥物在體內(nèi)很快降解，還可能靶向送達體內(nèi)有效部位，達到緩釋長效目的。但是蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性差、包封率低、載藥量小、易聚集而使生物活性降低，及可能引起免疫反應、體內(nèi)外釋放時具有明顯突釋效應等問題嚴重影響著這類制劑的發(fā)展。制備多肽及蛋白類藥物微納米球的常用方法包括復乳溶媒蒸發(fā)/萃取法、噴霧冷凍干燥法、相分離法、噴霧干燥法等，但是各種方法都有缺陷。比如復乳溶媒蒸發(fā)/萃取法制備微納米球時，蛋白質(zhì)易在油水界面聚集而變性。又比如可生物降解聚合物PELA，親脂性強，對水溶性多肽、蛋白質(zhì)及疫苗的親和力不高?，F(xiàn)有技術中，也有用膜乳化技術的制備蛋白質(zhì)微納米球的報道。膜乳化法 被認為是獲得高質(zhì)量單分散穩(wěn)定乳液的有效方法，可用于功能性單分散微納米球和微囊的制備。但是由于影響膜乳化過程的參數(shù)主要包括膜微的徑和分布、膜的孔隙率、膜表面類型、乳化劑類型及含量、分散相流量、連續(xù)相速度和操作壓差等非常多，很多用膜乳化法制得的蛋白質(zhì)微納米球無法實際應用，特別是對于應用較廣的HSA-DOC(人血白蛋白-紫杉醇)微納米球來說，現(xiàn)有技術中還沒有用膜乳化技術成功得到HSA-DOC的報道。腫瘤壞死因子超家族(tumornecrosis factor superfamily ；TNFSF)屬 II 型跨膜蛋白，其胞外區(qū)C端含長約150個氨基酸的序列(THD)，包含芳香族和疏水性殘基的保守骨架。以TRAIL為代表的TNFSF蛋白可以特異性地誘導多種腫瘤細胞凋亡，也可以與其他腫瘤化療藥物聯(lián)合應用。比如吳剛等在中國科技論文在線(WWW.paper, edu.cn)上發(fā)表的“TRAIL及聯(lián)合阿霉素治療骨肉瘤的動物實驗研究”;樂箐華等發(fā)表在安徽醫(yī)藥(2009，12 ；13 (12))的“TRAIL聯(lián)用化療藥物抗婦科腫瘤的研究進展”。劉征等發(fā)表在華中科技大學學報(醫(yī)學版)(第36卷第3期第352頁)的“紫杉醇聯(lián)合腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體對前列腺癌細胞的抑制作用”。仇波等發(fā)表在中國腫瘤生物治療雜志(Feb.2013, Vol.20，N0.1)上的“TRAIL聯(lián)合紫杉醇對人腦膠質(zhì)瘤U87細胞的抑制效應及其可能的機制”。劉言厚等發(fā)表在山東醫(yī)藥(2011年第51卷第17期)的“紫杉醇對TRAIL誘導胃癌SGC7901細胞凋亡的影響”，還有英文文獻如Avi Ashkenazi等發(fā)表在JOURNAL 0FCLINICAL0NC0L0GY(VOLUME 26 NUMBER 21 JULY 20 2008)的“Ligand-Based Targeting of Apoptosis inCancer:The Potential of Recombinant Human Apoptosis Ligand 2/Tumor NecrosisFactor - Related Apoptosis-1nducing Ligand (rhApo2L/TRAIL)，，以及 Frank A.E.Kruyt發(fā)表在Cancer Letters 263 (2008) 14 - 25 的“TRAIL and cancer therapy”。以上的聯(lián)合應用的方法，涉及到了 TRAIL與化療藥物在骨肉瘤、婦科腫瘤、前列腺癌、腦膠質(zhì)瘤、胃癌等的聯(lián)合應用，共同的給藥方式均是屬于聯(lián)合用藥，也就是TRAIL與化療藥物分屬于不同的藥劑學單元，臨床應用時臨時組合在一起。雖然普通技術人員根據(jù)上述文獻，可能會將TRAIL與難溶性化療藥物制成一個制劑單位，但由于TRAIL為水溶性的，將其與難溶性藥物混合在一起制成復方藥物幾乎無法實現(xiàn)。雖然對于難溶性的抗腫瘤化療藥物，普通技術人員可以考慮制成納米球，可以供制備混懸液供注射或口服用。比如中國專利CN101352420B所公開的以聚乳酸包合羥基喜樹堿。但現(xiàn)有技術中尚沒有將TNFSF蛋白與難溶性的抗腫瘤藥物制成合適的微納米球的報道。另外，TRAIL為代表的TNFSF蛋白還存在半衰期過短的缺陷，從而導致影響藥物的體內(nèi)藥代動力學特征。紫杉醇為代表的抗腫瘤化療藥物，需要進入細胞內(nèi)才能發(fā)揮最佳療效，研究如何增強局部紫杉醇類藥物濃度進而使紫杉醇為代表的抗腫瘤化療藥物更多進入靶向細胞具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術中的諸多技術問題，提供了一種利用膜乳化技術制得的能夠攜帶抗腫瘤化療藥物的蛋白微納米球。具體地說，本發(fā)明的第一個目的是提供了一種能夠攜帶抗腫瘤化療藥物的TNFSF蛋白微納米球，該微納米球能夠發(fā)揮TNFSF蛋白在體內(nèi)與相應受體結合，發(fā)揮抗癌作用的同時，也能夠攜帶難溶性的抗腫瘤化療藥物到達體內(nèi)，發(fā)揮了協(xié)同作用。本發(fā)明的第二個目的是提供了一種利用膜乳化能夠攜帶紫杉醇的HSA蛋白微納米球。本發(fā)明的第三個目的是提供了上述能夠攜帶抗腫瘤化療藥物的蛋白微納米球的制備方法。·本發(fā)明的一種攜帶抗腫瘤化療藥物的蛋白微納米球，優(yōu)選的第一種蛋白為TNFSF蛋白，并且抗腫瘤化療藥物為難溶性藥物，組合物包括由所述TNFSF蛋白形成的基本上完全封閉的殼體，以及位于殼體內(nèi)部的含有抗腫瘤化療藥物的內(nèi)核，殼體的最大直徑小于500nmo本發(fā)明優(yōu)選的粒子粒徑范圍在340nm-400nm，最優(yōu)選的粒子粒徑范圍在200nm以下。本發(fā)明的攜帶抗腫瘤化療藥物的蛋白微納米球，優(yōu)選的難溶性的抗腫瘤化療藥物，包括但不限于鉬類、長春堿類、紫杉醇類、喜樹堿類、阿霉素、環(huán)磷酰胺、放線菌素、博萊霉素、柔紅霉素、表阿霉素、絲裂霉素、甲氨喋呤、氟尿嘧啶、卡氮芥、依托泊苷、干擾素、苯芥膽甾醇、激素類、他莫昔芬；長春堿類包括長春花堿、長春新堿及其他類似于長春堿的藥物；紫杉醇類包括紫杉醇及其衍生物、紫杉醇前體藥物、紫杉烷以及其它類似于紫杉醇的藥物；喜樹堿類包括喜樹堿及其類似物、輕基喜樹堿及其類似物；鉬類包括卡鉬、順鉬；激素類包括雌激素、孕激素。特別需要指出的是，本發(fā)明的蛋白微納米球非常適合攜帶紫杉醇。本發(fā)明的攜帶抗腫瘤化療藥物的蛋白微納米球，TNFSF蛋白包括EDA-Al、TNFSFl、TNFSF2、TNFSF3、TNFSF3L、TNFSF4、TNFSF5 4、TNFSF6、TNFSF7、TNFSF8、TNFSF9、TRAIL、TNFSF11、TNFSF12、TNFSF13、TNFSF13B、TNFSF14、TNFSF15、TNFSF18 之中的一種或幾種的野生型及變構型。特別優(yōu)選的是，TNFSF蛋白為 TRAIL。TRAIL(TNF - related apop tosis inducingligand)是一個重要的凋亡調(diào)節(jié)蛋白，TRAIL分子以轉(zhuǎn)錄本形式存在于人體的大多數(shù)器官和細胞，更重要的是被激活的T、B淋巴細胞和NK細胞也表達TRAIL蛋白。成熟的TRAIL蛋白主要以II型跨膜蛋白或可溶性的形式存在。其胞外區(qū)由747個氨基酸組成。TRAIL胞外區(qū)與其特異性受體結合，能迅速地誘導多種腫瘤細胞系的凋亡，而對正常組織細胞無凋亡誘導作用。本發(fā)明特別意外的發(fā)現(xiàn)了一種攜帶抗腫瘤化療藥物的蛋白微納米球的制法，包括如下步驟:a.將抗腫瘤化療藥物溶于有機溶劑作為油相；b.將蛋白溶于水作為水相；c.采用膜乳化方法將水相和油相制得膜乳化液；d.將膜乳化液的固化制得微納米球；e.將微納米球冷凍干燥。第一種對蛋白微納米球的制法的改進為，當?shù)鞍诪門NFSF蛋白時，按如下步驟制備:a.將抗腫瘤化療藥物溶于有機溶劑作為油相；b.將TNFSF蛋白水溶液作為水相；c.將油相與水相制成油/水初乳液；d.將油/水初乳液進行膜乳化，得膜乳化液；e.將膜乳化液的固化制得微納米球；f.將微納米球冷凍干燥。在此實驗中不用連續(xù)相沖刷，一次打出產(chǎn)品。原理為初乳液是顆粒較大的水包油體系，通過膜后被擠壓成納米級的水包油結構，進而固化形成顆粒更進一步說，當抗腫瘤藥物為紫杉醇、并且TNFSF蛋白為TRAIL，由如下步驟制得:a.將20-40重量份的紫杉醇溶于乙酸乙酯作為油相；b.將50重量份TRAIL水溶液作為水相；c.在冰水浴條件下，采用超聲破碎將油相分散于水相中制備油/水初乳液；d.將初乳液倒入快速膜乳化裝置中，于常溫下，以0.5-1.0MPa氮氣壓力下，將初乳液反復壓過膜孔進行膜乳化，得膜乳化液；e.將膜乳化液在常溫下磁力攪拌揮發(fā)去除有機溶劑使其固化制得微納米球；f.將固化后的微納米球用去離子水離心洗滌5次，并冷凍干燥制成所述組合物。令人驚奇的是，在乙酸乙酯與水的 重量份配比為20: 50時，效果最為理想。第二種對蛋白微納米球的制法的改進為，當?shù)鞍诪門NFSF蛋白時，也可按如下步驟制備:a.將抗腫瘤化療藥物溶于有機溶劑作為油相；b.將TNFSF蛋白水溶液作為水相；
c.將油相作為分散相，將水相作為連續(xù)相進行膜乳化，得膜乳化液；d.將膜乳化液的固化制得微納米球；e.將微納米球冷凍干燥。第三種的蛋白微納米球的制法，是當?shù)鞍诪镠SA蛋白并且抗腫瘤化療藥物為紫杉醇，包括如下步驟:a.將紫杉醇溶于有機溶劑作為油相；b.將HAS蛋白溶于水作為水相；c.將油相與所述水相制成油/水初乳液；d.將油/水初乳液進行膜乳化，得膜乳化液；e.將膜乳化液的固化制得微納米球；
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f.將微納米球冷凍干燥。本發(fā)明的人血清白蛋白(Human Serum Albumin,簡稱HSA)是人血衆(zhòng)中的蛋白質(zhì)，其非糖基化的單鏈多肽包含585個氨基酸，分子量為66kD。在血漿中其濃度為42g/L，約占血漿總蛋白的60%。在體液中人血清白蛋白可以運輸脂肪酸、膽色素、氨基酸、類固醇激素、金屬離子和許多治療分子等:同時維持血液正常的滲透壓。本發(fā)明的有益效果在于，提供了一種基于膜乳化技術的制備可以攜帶難溶性抗腫瘤藥物的蛋白微納米球，特別是提供了以TRAIL為代表的TNFSF蛋白、HSA蛋白的蛋白微納米球的制備方法，該方法的包封率高、合理的控制了突釋效應。下面以TRAIL為例幫助理解說明本發(fā)明的有益效果，但不應受此舉例限制本發(fā)明的有益效果，TRA-DOC微納米球能夠在聯(lián)合抗癌產(chǎn)生協(xié)同作用的同時，又具備如下特點:1、TRA-DOC是微納米球，可以制成單一制劑；而“TRAIL-紫杉醇聯(lián)合應用”只是臨用現(xiàn)配，不是單一制劑；2、TRA-DOC是靶向給藥，而且能夠?qū)⑺幬飵霂Т嬖赥RA受體(死亡受體Deathreceptor)的細胞中，而“TRAIL-紫杉醇聯(lián)合應用”無此作用；3、TRA-DOC微納米球解決難溶性化療藥物不易溶解的問題，發(fā)揮TRI和DOC的雙重療效，而“TRAIL-紫杉醇聯(lián)合應用”中紫杉醇需要其他高分子材料包合。4、TRA-DOC微納米球的協(xié)同作用，要高于“TRAIL-紫杉醇聯(lián)合應用”的協(xié)同作用。5、TRA-DOC微納米球的半衰期較單獨的TRAIL為代表的TNFSF延長約20%_200%。下面通過試驗例進一步說明本發(fā)明。試驗例1:H460細胞細胞毒性試驗試驗方法:H460細胞接種于96孔板，置于培養(yǎng)箱24h后，待細胞附壁后小心吸出各孔內(nèi)培養(yǎng)液。設置空白組即H460細胞未加任何藥物，對照組分別為TRA-1BU (TRA為TRAIL, IBU為布洛芬)，HSA-DOC (HSA人血清白蛋白，DOC為紫杉醇，非本發(fā)明的膜乳化技術HAS-D0C)，實驗組為TRA-D0C。將供試品(以DOC計算，初始濃度為lmg/mL)以及對照組加入至96孔版中，每組藥品分別稀釋為100倍、1000倍、4000、16000、64000倍。試驗結果:該納米粒子在各個濃度上均對H460細胞呈現(xiàn)出顯著的抑制作用，且均好于對照組效果。其中以稀釋4000倍時殺傷效果最優(yōu)，如圖7，TRA-DOC對H460的抑制率為 87.4± 1.6%,明顯好于 HSA-DOC 組 65.4± 1.3%、TRA-1BU 組 31.1 ±0.6%。試驗例2:L929細胞細胞毒性試驗
試驗方法同試驗例I。試驗結果:該納米粒子在各個濃度上均對L929細胞呈現(xiàn)出顯著的抑制作用，且均好于對照組效果。其中以稀釋4000倍時殺傷效果最優(yōu)，如圖8，TRA-DOC對L929的抑制率為 49.1 ±2.2%,明顯好于 HSA-DOC 組 5.3± 1.8%、TRA-1BU 組 7.0± 1.3%。試驗例3對S180腹水瘤小鼠抑制作用試驗方法:無菌條件下取S180腹水瘤小鼠瘤液，配制細胞懸液，以IX IO6/只的濃度接種于實驗小鼠右側腋后皮下。次日，將動物隨機分組，每組10只。設陰性對照組、對照組HSA-DOC (非本發(fā)明的膜乳化技術HAS-D0C)和試驗組TRA-DOC,以10mg/kg/日劑量腹腔注射；以相同劑量(10mg/kg)相同體積(0.2ml/20g)與實驗觀察樣品同時給藥。連續(xù)給藥7次。待陰性對照組動物腫瘤生長至一定體積結束觀察。實驗結束時，秤體重，剝離腫瘤，秤瘤重，用t檢驗法比較各組動物腫瘤重量的統(tǒng)計學差別。腫瘤生長抑制率的計算公式為:
權利要求
1.一種攜帶抗腫瘤化療藥物的蛋白微納米球，其特征在于，所述蛋白為TNFSF蛋白，所述抗腫瘤化療藥物為難溶性藥物，所述組合物包括由所述TNFSF蛋白形成的基本上完全封閉的殼體，以及位于所述殼體內(nèi)部的含有所述抗腫瘤化療藥物的內(nèi)核，所述殼體的最大直徑小于500nm。
2.如權利要求I所述的攜帶抗腫瘤化療藥物的蛋白微納米球，其特征在于，所述難溶性的抗腫瘤化療藥物，包括鉬類、長春堿類、紫杉醇類、喜樹堿類、阿霉素、環(huán)磷酰胺、放線菌素、博萊霉素、柔紅霉素、表阿霉素、絲裂霉素、甲氨喋呤、氟尿嘧啶、卡氮芥、依托泊苷、干擾素、苯芥膽留醇、激素類、他莫昔芬；所述長春堿類包括長春花堿、長春新堿及其他類似于長春堿的藥物；所述紫杉醇類包括紫杉醇及其衍生物、紫杉醇前體藥物、紫杉烷以及其它類似于紫杉醇的藥物；所述喜樹堿類包括喜樹堿及其類似物、羥基喜樹堿及其類似物；所述鉬類包括卡鉬、順鉬；所述激素類包括雌激素、孕激素。
3.如權利要求2所述的攜帶抗腫瘤化療藥物的蛋白微納米球，其特征在于，所述難溶性的抗腫瘤化療藥物為紫杉醇。
4.如權利要求I所述的攜帶抗腫瘤化療藥物的蛋白微納米球，其特征在于，所述TNFSF蛋白包括 EDA-A1、TNFSFU TNFSF2、TNFSF3、TNFSF3L、TNFSF4、TNFSF54、TNFSF6、TNFSF7、TNFSF8、TNFSF9、TRAIL、TNFSF11、TNFSF12、TNFSF13、TNFSF13B、TNFSF14、TNFSF15、TNFSF18之中的一種或幾種的野生型及變構型。
5.如權利要求4所述的攜帶抗腫瘤化療藥物的蛋白微納米球，其特征在于，所述TNFSF蛋白為TRAIL。
6.一種攜帶抗腫瘤化療藥物的蛋白微納米球的制法，其特征在于，包括如下步驟 a.將所述抗腫瘤化療藥物溶于有機溶劑作為油相； b.將所述蛋白溶于水作為水相； c.采用膜乳化方法將所述水相和所述油相制得膜乳化液； d.將膜乳化液的固化制得微納米球； e.將微納米球冷凍干燥。
7.如權利要求6所述的蛋白微納米球的制法，其特征在于，所述蛋白為TNFSF蛋白，包括如下步驟 a.將所述抗腫瘤化療藥物溶于有機溶劑作為油相； b.將所述TNFSF蛋白水溶液作為水相； c.將所述油相與所述水相制成油/水初乳液； d.將油/水初乳液進行膜乳化，得膜乳化液； e.將膜乳化液的固化制得微納米球； f.將微納米球冷凍干燥。
8.如權利要求6所述的蛋白微納米球的制法，其特征在于，所述蛋白為TNFSF蛋白，包括如下步驟 a.將所述抗腫瘤化療藥物溶于有機溶劑作為油相； b.將TNFSF蛋白水溶液作為水相； c.將所述油相作為分散相，將所述水相作為連續(xù)相進行膜乳化，得膜乳化液； d.將膜乳化液的固化制得微納米球；e.將微納米球冷凍干燥。
9.如權利要求6所述的蛋白微納米球的制法，其特征在于，所述蛋白為HSA蛋白，所述抗腫瘤化療藥物為紫杉醇，包括如下步驟 a.將紫杉醇溶于有機溶劑作為油相； b.將HAS蛋白溶于水作為水相； c.將所述油相與所述水相制成油/水初乳液； d.將油/水初乳液進行膜乳化，得膜乳化液； e.將膜乳化液的固化制得微納米球； f.將微納米球冷凍干燥。
10.如權利要求7所述的蛋白微納米球的制法，其特征在于，所述抗腫瘤藥物為紫杉醇，所述TNFSF蛋白為TRAIL，包括如下步驟 a.將20-40重量份的紫杉醇溶于乙酸乙酯作為油相； b.將50重量份TRAIL水溶液作為水相； c.在冰水浴條件下，采用超聲破碎將油相分散于水相中制備油/水初乳液； d.將所述初乳液倒入快速膜乳化裝置中，于常溫下，以O.5-1. OMPa氮氣壓力下，將所述初乳液反復壓過膜孔進行膜乳化，得膜乳化液； e.將所述膜乳化液在常溫下磁力攪拌揮發(fā)去除有機溶劑使其固化制得微納米球； f.將固化后的所述微納米球用去離子水離心洗滌5次，并冷凍干燥制成所述組合物。
11.如權利要求7所述的制備微納米球的方法，其特征在于，所述乙酸乙酯與水的重量份配比為20 50。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種攜帶抗腫瘤化療藥物的蛋白微納米球,優(yōu)選的當?shù)鞍诪門NFSF蛋白并且抗腫瘤化療藥物為難溶性藥物時，該組合物包括由TNFSF蛋白形成的基本上完全封閉的殼體，以及位于所述殼體內(nèi)部的含有所述抗腫瘤化療藥物的內(nèi)核，殼體的最大直徑小于500nm。本發(fā)明的有益效果在于，提供了一種基于膜乳化技術的制備可以攜帶難溶性抗腫瘤藥物的蛋白微納米球，特別是提供了以TRAIL為代表的TNFSF蛋白、HSA蛋白的蛋白微納米球的制備方法。
文檔編號A61K47/42GK103251573SQ20131017434
公開日2013年8月21日 申請日期2013年5月13日 優(yōu)先權日2013年5月13日
發(fā)明者不公告發(fā)明人 申請人:李偉, 崔琬悅