專利名稱：用陽離子脂質(zhì)體形成金納米球殼構(gòu)建基因藥物共載體系及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及以陽離子脂質(zhì)體為模板形成金納米球殼結(jié)構(gòu)，以金納米球殼結(jié)構(gòu)為載體，構(gòu)建藥物和基因的共載體系，所載藥物為阿霉素等抗癌藥物，所載基因為SiRNA等。
背景技術(shù)：
陽離子脂質(zhì)體被比較廣泛的應(yīng)用于藥物載體和基因載體，但是脂質(zhì)體是亞穩(wěn)的結(jié)構(gòu)，在體液中不夠穩(wěn)定，在體內(nèi)循環(huán)時間比較短，可以對陽離子脂質(zhì)體進(jìn)行修飾，改善其穩(wěn)定性。金納米材料具有比較獨(dú)特的物理化學(xué)特性，金納米球殼結(jié)構(gòu)因為表面等離子體共振效應(yīng)，在近紅外區(qū)吸收峰。研究者已有利用脂質(zhì)體為模板，在表面沉積金，形成納米空心 球結(jié)構(gòu)，并利用脂質(zhì)體載鹽酸阿霉素等抗癌藥物，用脈沖激光照射金納米球殼，可以達(dá)到控制藥物釋放的目的。金納米球殼也被廣泛用于基因的載體，利用巰基與金的反應(yīng)，將陽離子性聚合物修飾在金納米空心球的表面，利用靜電吸附效應(yīng)，將基因吸附在金納米空心球表面，從而構(gòu)建基因載體，或者將需要投遞的基因一端修飾上巰基，再利用巰基與金的結(jié)合作用，達(dá)到投遞基因的目的。研究表明，在腫瘤治療過程中，基因與藥物聯(lián)合治療有很好的治療效果，構(gòu)建一個基因和藥物的共載體系成為藥物和基因聯(lián)合治療一個重要的內(nèi)容?，F(xiàn)在很多構(gòu)建藥物基因共載的方法是將藥物和基因利用化學(xué)的方法接在一起，進(jìn)行的化學(xué)反應(yīng)的過程比較復(fù)雜，反應(yīng)過后雜質(zhì)不易去除，并且基因十分不穩(wěn)定，操作過程，稍有不慎，會造成基因的分解；也有的研究者實現(xiàn)了藥物和基因的共載，但是當(dāng)載體攜帶藥物和基因進(jìn)入細(xì)胞后，藥物和基因并不能釋放到細(xì)胞質(zhì)中，而藥物和基因必須在細(xì)胞中能夠釋放才能起作用，因此需要要一個簡單快捷的方法來構(gòu)建一個基因和藥物的共載體系，并且能夠很好的實現(xiàn)藥物和基因的釋放。此發(fā)明利用金納米空心球構(gòu)建基因和藥物的共載體系是一個比較好的方法，金納米球殼結(jié)構(gòu)本身毒性小，并且具有良好的光學(xué)性能，研究已表明，近紅外區(qū)的脈沖激光照射，會使球殼結(jié)構(gòu)破裂，從而可以釋放藥物和基因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于利用以陽離子為模板形成的金納米球殼結(jié)構(gòu)，構(gòu)建一個基因藥物的共載體系，為基因和藥物的共投遞提供一個優(yōu)良載體。本發(fā)明的原理是利用陽離子性脂質(zhì)體進(jìn)行載藥，在脂質(zhì)體溶液中加入氯金酸和還原劑，在脂質(zhì)體的表面沉積一層金納米空心球殼。將要投遞的目標(biāo)基因的一端修飾上巰基，再利用巰基與金的結(jié)合作用將基因接在金納米球殼的表面，從而形成一個藥物和基因的共載體系。
本發(fā)明的制備方法如下a.將二棕櫚酰磷脂酰膽堿和單棕摘酰磷脂酰膽堿按照重量比在I :1和1:0之間進(jìn)行投料，加入修飾有1，2-雙(二苯基膦)乙烷的聚乙二醇2000，1，2-雙(二苯基膦)乙烷的聚乙二醇2000的質(zhì)量占總質(zhì)量的5%，將上述物質(zhì)溶解在磷酸氫鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液，使得磷脂濃度濃度為40-60nM，加入鹽酸阿霉素，使得鹽酸阿霉素濃度為5-10nM。循環(huán)冷凍融化，通過IOOnm的聚碳酸酯膜擠出，形成載藥的陽離子脂質(zhì)體；取上述制備的脂質(zhì)體溶液lmL，加入7-18uL濃度為IOOnM氯金酸溶液，再加入10. 5uL_27uL濃度為500nM的抗壞血酸溶液，形成金納米球殼結(jié)構(gòu)；b.將50nmol的單鏈小干擾RNA (siRNA)在pH=3. 8的緩沖溶液中還原得到帶巰基單鏈siRNA,加入到Iml金納米球殼溶液中，在6000rpm條件下離心10分鐘,在30mM輕乙基哌嗪乙硫磺酸100mM、pH=7. 5醋酸鈉溶液中重分散三次，形成藥物基因共載的金納米球殼。氯金酸和抗壞血酸的體積加入不同，形成的金殼厚度不同，吸收峰也不同。

本發(fā)明所載基因為帶巰基的基因，可以將帶有二硫鍵的基因還原，5' -H0-(CH2)6-SS- (CH2) 6-spacer 18-ACCCUGMGUU-CAUCUGCACCACdCdG- (C-H2) 6-NH2 — SH- (CH2) 6-spacer18-ACCCUGAAGUU-CAUCUGCACCACdCdG-(C-H2)6-NH2 將 50nmol 的單鏈 siRNA 在 ρΗ=3· 8 的緩沖溶液中還原得到帶巰基單鏈siRNA,加入到Iml金納米球殼溶液中,在6000rpm條件下離心10分鐘，在30mM羥乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)，IOOmM醋酸鈉(pH=7. 5)中重分散三次，形成藥物基因共載的金納米球殼；也可以直接訂做帶巰基的基因，例如SH-miR-21，將帶巰基的基因溶解在TE緩沖溶液中，濃度為2umol/L，按照與金納米球殼溶液體積比在64:1與2:1的范圍內(nèi)混合，形成藥物基因共載的金納米球殼。本發(fā)明的優(yōu)點是利用成熟的脂質(zhì)體載藥體系形成無毒的金納米空心球，以金納米空心球為基礎(chǔ)構(gòu)建了基因和藥物的共載體系，為基因和藥物的共投遞提供了方法說明書附I :以陽離子脂質(zhì)體為模板形成的金納米球殼結(jié)構(gòu)的TEM照片；圖2 :藥物基因共載體系不意圖
具體實施例方式下面通過例子對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的闡述。實施例I :a.陽離子脂質(zhì)體的制備DPPC，MPPC, DPPE-PEG2000按照重量比40:40:10的比例溶解在PBS溶液中(pH=7. 4)，形成60nM的脂類溶液，加入鹽酸阿霉素，使得的鹽酸阿霉素的濃度為5nM，將溶液按照標(biāo)準(zhǔn)的循環(huán)冷凍冷凍-融化方法制脂質(zhì)體，在通過IOOnm的聚碳酸酯膜中擠出形成脂質(zhì)體。將制備好的脂質(zhì)體在PBS溶液中透析，除去多余的鹽酸阿霉素。b.金納米殼的形成取ImL上述制備的脂質(zhì)體溶液，加入18uL IOOnM的氯金酸溶液和27uL 500nM的抗壞血酸溶液，形成的金納米球殼吸收峰為1064nm ;制好的樣品重新在PBS溶液中，透析12h。c. siRNA與金納米球殼的連接選取的siRNA為綠色熒光蛋白沉默基因，正義鏈的核苷酸序列為 5’ -HO-(CH2)6-SS-(CH2)6-spacerl8-ACCCUGAAGUU-CAUCUGCACCACdCdG-(C-H2)6-NH2,寡核苷酸首先進(jìn)行強(qiáng)穩(wěn)定作用，50nmol寡核苷酸在60°C的pH=3. 8的緩沖溶液中孵化30min,把RNA溶解在50uL水中，加入pH=7. O的Tris (2-carboxyethyl)phosphineHCl (TCEP，O. 5M)，IOmin后，加入氯仿萃取，取水層，得到巰基化的RNA。將新還原的帶巰基的RNA(3uM in 5mM TCEP，pH=7. 00)加入步驟b中制備的金納米球殼溶液ImL中，超聲，在4°C條件下隔夜放置。在6000rpm條件下離心10分鐘，在30mM HEPES, IOOmM醋酸鈉(pH=7. 5)中重分散三次。得到單鏈siRNA與金納米球殼的復(fù)合物，從而構(gòu)建了藥物與基因的共載體系。實施例2 a.陽離子脂質(zhì)體的制備DPPC，MPPC, DPPE-PEG2000重量比為90:0:10，加入PBS 溶液，加入鹽酸阿霉素，使得鹽酸阿霉素的濃度為ΙΟηΜ，其余實施步驟與實施例I中陽離子性脂質(zhì)體的制備過程相同。b.金納米殼的形成氯金酸溶液和抗壞血酸溶液加的濃度不同，形成的金殼厚度和粒徑都不同，等離子體共振效應(yīng)產(chǎn)生的吸收峰也不同。實施例I中形成的金納米球殼吸收峰為1064nm，在此例中加入7uL氯金酸溶液和10. 5uL抗壞血酸溶液，形成金納米球殼吸收峰為655nm。制好的樣品重新在PBS溶液中透析12h。c. siRNA與金納米球殼的連接選取的siRNA為綠色熒光蛋白沉默基因，正義鏈的核苷酸序列為 5’ -HO-(CH2)6-SS-(CH2)6-spacerl8-ACCCUGAAGUU-CAUCUGCACCACdCdG-(C-H2)6-NH2,寡核苷酸首先進(jìn)行強(qiáng)穩(wěn)定作用，50nmol寡核苷酸在60°C的pH=3. 8的緩沖溶液中孵化30min,把RNA溶解在50uL水中，加入pH=7. O的Tris (2-carboxyethyl)phosphineHCl (TCEP, O. 5M)，IOmin后，加入氯仿萃取，取水層，得到巰基化的RNA。將新還原的帶巰基的RNA(3uM in 5mM TCEP，pH=7. 00)加入步驟b中制備的金納米球殼溶液ImL中，超聲，在4°C條件下隔夜放置。在6000rpm條件下離心10分鐘，在30mM HEPES, IOOmM醋酸鈉(pH=7. 5)中重分散三次。得到單鏈siRNA與金納米球殼的復(fù)合物，從而構(gòu)建了藥物與基因的共載體系。實施例3 a.陽離子脂質(zhì)體的制備DPPC，MPPC, DPPE-PEG2000重量比為90:0:10，其余實施步驟與實施例I中陽離子性脂質(zhì)體的制備過程相同。b.金納米殼的形成加入18uL IOOnM的氯金酸溶液和27uL 500nM的抗壞血酸溶液，形成的金納米球殼吸收峰為1064nm ;加入7uL氯金酸溶液和10. 5uL抗壞血酸溶液，形成金納米球殼吸收峰為655nm。制好的樣品重新在PBS溶液中透析12h。c.基因與金納米球殼的連接將SH-miR-21(20ymol/L)用TE緩沖液(10mmol/L，PH=8. O的Tris-HCL，lmmol/L EDTA)稀釋至一定的濃度，帶巰基的miR-21濃度為2 μ mol/L,根據(jù)預(yù)先設(shè)計好的體積比例(64:1、16:1、2:1)，將相同量的SH_miR-21與金納米球殼在TE緩沖溶液中混合，室溫孵育20分鐘后得到兩者的復(fù)合物，從而構(gòu)建了藥物與基因的共載體系。實施例4:a.陽離子脂質(zhì)體的制備DPPC，MPPC，DPPE-PEG2000重量比為 45:45:10，其余實施步驟與實施例I中陽離子性脂質(zhì)體的制備過程相同。b.金納米殼的形成氯金酸溶液和抗壞血酸溶液加的濃度不同，形成的金殼厚度和粒徑都不同，等離子體共振效應(yīng)產(chǎn)生的吸收峰也不同。實施例I中形成的金納米球殼吸收峰為1064nm，在此例中加入7uL氯金酸溶液和10. 5uL抗壞血酸溶液，形成金納米球殼吸收峰為655nm。制好的樣品重新在PBS溶液中透析12h。c.基因與金納米球殼的連接將SH-miR-21(20ymol/L)用TE緩沖液(10mmol/L，PH=8. O的Tris-HCL，lmmol/L EDTA)稀釋至一定的濃度，帶巰基的miR-21濃度為2 μ mol/L,根據(jù)預(yù)先設(shè)計好的體積比例(64:1、16:1、2:1)，將相同量的SH_miR-21與金納米球殼在TE緩沖溶液中混合，室溫孵育20分鐘后得到兩者的復(fù)合物，從而構(gòu)建了藥物與基因的共載體系。實施例5:a.陽離子脂質(zhì)體的制備DPPC，MPPC，DPPE-PEG2000重量比為 45:45:10，其余實施步驟與實施例I中陽離子性脂質(zhì)體的制備過程相同。b.金納米殼的形成氯金酸溶液和抗壞血酸溶液加的濃度不同，形成的金殼厚度 和粒徑都不同，等離子體共振效應(yīng)產(chǎn)生的吸收峰也不同。實施例I中形成的金納米球殼吸收峰為1064nm，在此例中加入7uL氯金酸溶液和10. 5uL抗壞血酸溶液，形成金納米球殼吸收峰為655nm。制好的樣品重新在PBS溶液中透析12h。c.將 SH-miR-21 (20 μ mol/L)用 TE 緩沖液(10mmol/L，ΡΗ=8· O 的 Tris-HCL，ImmoI/LEDTA)稀釋至一定的濃度，帶巰基的miR-21濃度為2 μ mol/L,根據(jù)預(yù)先設(shè)計好的體積比例(64:1、16:1、2:1)，將相同量的SH-miR-21與金納米球殼在TE緩沖溶液中混合，室溫孵育20分鐘后得到兩者的復(fù)合物，從而構(gòu)建了藥物與基因的共載體系。實施例6:a.陽離子脂質(zhì)體的制備DPPC，MPPC, DPPE-PEG2000重量比為45:45:10，加入的PBS溶液，形成濃度為60nM的脂質(zhì)溶液，加入鹽酸阿霉素，使得鹽酸阿霉素濃度為10nM，其余實施步驟與實施例I中陽離子性脂質(zhì)體的制備過程相同。b.金納米殼的形成氯金酸溶液和抗壞血酸溶液加的濃度不同，形成的金殼厚度和粒徑都不同，等離子體共振效應(yīng)產(chǎn)生的吸收峰也不同。在此例中加入7uL氯金酸溶液和10. 5uL抗壞血酸溶液，形成金納米球殼吸收峰為655nm。制好的樣品重新在PBS溶液中透析 12h。c.將 SH-miR-21 (20 μ mol/L)用 TE 緩沖液(10mmol/L，ΡΗ=8· O 的 Tris-HCL，Immo I/LEDTA)稀釋至一定的濃度，帶巰基的miR-21濃度為2 μ mol/L,根據(jù)預(yù)先設(shè)計好的體積比例(64:1、32:1，、16:1、8:1、2:1)，將相同量的SH-miR-21與金納米球殼在TE緩沖溶液中混合，室溫孵育20分鐘后得到兩者的復(fù)合物，從而構(gòu)建了藥物與基因的共載體系。所用siRNA基因序列為5，-HO-(CH2)6-SS-(CH2)6-spacer18-ACCCUGAAGUU-CAUCUGCACCACdCdG-(C-H2)6-NH2所用帶巰基的microRNA序列為UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGU
權(quán)利要求
1.以陽離子性脂質(zhì)體為模板形成的金納米空心球殼結(jié)構(gòu)的藥物基因共載體系，其特征是利用陽離子性脂質(zhì)體載親水性的藥物，在陽離子脂質(zhì)體外包裹金，形成內(nèi)部載藥的金納米球殼結(jié)構(gòu)，基因通過巰基接在金納米球殼結(jié)構(gòu)的表面，從而構(gòu)建內(nèi)部載藥、外部載基因的金納米球殼共載體系。
2.如權(quán)利要求I所述的體系，其特征是所述的藥物為鹽酸阿霉素的親水性抗癌藥物。
3.如權(quán)利要求I所述的體系，其特征是所述的基因為所有帶巰基或者可以修飾出巰基的基因。
4.構(gòu)建權(quán)利要求I的金納米空心球殼結(jié)構(gòu)的藥物基因共載體系的的方法，其特征是步驟如下 a.將二棕櫚酰磷脂酰膽堿和單棕摘酰磷脂酰膽堿按照重量比在I: I和I : O之間進(jìn)行投料，加入修飾有1，2-雙(二苯基膦)乙烷的聚乙二醇2000，1，2-雙(二苯基膦)乙烷的聚乙二醇2000的質(zhì)量占總質(zhì)量的5%，將上述物質(zhì)溶解在磷酸氫鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液，使得磷脂濃度濃度為40-60nM，加入鹽酸阿霉素，使得鹽酸阿霉素濃度為5-10nM。循環(huán)冷凍融化，通過IOOnm的聚碳酸酯膜擠出，形成載藥的陽離子脂質(zhì)體；取上述制備的脂質(zhì)體溶液lmL，加入7-18uL濃度為IOOnM氯金酸溶液，再加入10. 5uL_27uL濃度為500nM的抗壞血酸溶液，形成金納米球殼結(jié)構(gòu)； b.將50nmol的單鏈小干擾RNA(siRNA)在pH=3. 8的緩沖溶液中還原得到帶巰基單鏈siRNA，加入到Iml金納米球殼溶液中，在6000rpm條件下離心10分鐘，在30mM羥乙基哌嗪乙硫磺酸100mM、pH=7. 5醋酸鈉溶液中重分散三次，形成藥物基因共載的金納米球殼。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征是所述步驟b.為直接訂做帶巰基的基因SH-miR-21，將帶巰基的基因溶解在堿性緩沖溶液中，濃度為2umol/L，按照與金納米球殼溶液體積比在64 : I與2 : I的范圍內(nèi)混合，形成藥物基因共載的金納米球殼。
全文摘要
本發(fā)明涉及用陽離子脂質(zhì)體形成金納米球殼構(gòu)建基因藥物共載體系及制備方法；陽離子脂質(zhì)體用DPPC，MPPC，DPPE-PEG等磷脂及其衍生物通過膜擠出發(fā)行程陽離子脂質(zhì)體，在形成過程中將親水性的藥物鹽酸阿霉素載入脂質(zhì)體中，形成載藥的陽離子性脂質(zhì)體，在陽離子性脂質(zhì)體溶液中加入氯金酸溶液，吸附在陽離子脂質(zhì)體表面，加入的抗壞血酸溶液還原，形成金納米球殼結(jié)構(gòu)。將帶二硫鍵的綠色熒光蛋白沉默基因的單鏈還原出巰基，接在金納米球殼的表面，形成基因和藥物的共載體系。金納米球殼毒性低，并有比較獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)，以金納米球殼構(gòu)建藥物基因共載體系可以為藥物和基因的共治療提供載體，可以選擇光來照射金納米球殼，利用光熱轉(zhuǎn)化性質(zhì)實現(xiàn)藥物和基因的共釋放。
文檔編號A61K47/02GK102805873SQ20121016812
公開日2012年12月5日 申請日期2012年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月25日
發(fā)明者高立章, 劉貴高, 原續(xù)波, 何芳 申請人:天津大學(xué)