加味玉屏風(fēng)凝膠劑及其制備方法和用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種加味玉屏風(fēng)凝膠劑及其制備方法和用途，屬于含有傳統(tǒng)中草藥的醫(yī)藥配制品，本發(fā)明是按重量份數(shù)比的黃芪、白術(shù)、防風(fēng)、黃芩，經(jīng)乙醇提取濃縮為浸膏；上述浸膏按重量體積比加入藥用輔料水溶性高分子基質(zhì)卡波姆，保濕劑甘油、丙二醇、促滲劑氮酮，pH調(diào)節(jié)劑三乙醇胺、防腐劑尼泊金乙酯及純凈水充分?jǐn)嚢杈鶆蚨?。這樣設(shè)計(jì)的本發(fā)明以“內(nèi)病外治”為依據(jù)，并根據(jù)外用透皮吸收的特點(diǎn)，提取中藥原料中的有效部位或有效組分制備成凝膠劑，直接用于紫外線損傷的皮膚，不通過肝臟的首過效應(yīng)，也減少胃腸道酶對(duì)其的破壞，對(duì)光老化皮損改善明顯，該凝膠劑在治療光老化方面具有顯著療效。
【專利說明】加味玉屏風(fēng)凝膠劑及其制備方法和用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種含有傳統(tǒng)中草藥的醫(yī)藥配制品，具體是一種加味玉屏風(fēng)凝膠劑及 其制備方法和用途。

【背景技術(shù)】
[0002] 皮膚和其他器官一樣，也會(huì)經(jīng)歷衰老，并且隨年齡的增長而加劇。皮膚的衰老除內(nèi) 源性因素外，外源性因素對(duì)皮膚的影響同樣不可忽視。隨著人類社會(huì)的進(jìn)步，工業(yè)迅猛發(fā) 展，臭氧層遭到破壞，使人類遭受過多的紫外線輻射，而成為衰老的重要外源性因素之一。 人們把長期受到紫外線照射，皮膚組織、生理及形態(tài)的變化定義為光老化，即慢性UV損傷。
[0003] 臨床上可表現(xiàn)為暴露部位皮膚松弛、皺紋粗深、結(jié)節(jié)、皮革樣外觀，色素斑增多、毛 細(xì)血管擴(kuò)張，原有幾何圖形外觀明顯改變或消失，皮膚顏色改變常呈灰黃色。更重要的是過 多接受紫外線照射可能導(dǎo)致皮膚脂溢性角化、日光性角化等良性腫瘤以及增加惡性腫瘤的 發(fā)病率。
[0004] 隨著人們生活水平的提高，更多的患者有延緩衰老的需求，同時(shí)光老化也受到臨 床醫(yī)師的重視，因此預(yù)防和延緩光老化進(jìn)程成為近年來人們研究的熱點(diǎn)。
[0005] 隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)及美容學(xué)的發(fā)展，皮膚光老化的預(yù)防多以遮光劑和外用氧化劑為 主。光老化的治療多以維甲酸和物理方法(激光、磨削、剝脫等)為主。而這些方法大多是治 標(biāo)不治本，并不能從根本改善光老化皮膚結(jié)構(gòu)，且容易產(chǎn)生色素沉著或色素脫失、紅斑、脫 屑、瘙癢、瘢痕等副作用。
[0006] 光老化組織學(xué)改變包括表皮厚度因增生(重度萎縮）明顯不均勻，表皮急性損傷， 角質(zhì)形成細(xì)胞出現(xiàn)不典型增生，表皮與真皮連接境界清晰，表皮突消失；真皮炎性細(xì)胞浸潤 較明顯，彈性纖維增粗、排列紊亂或扭結(jié)成團(tuán)，彈力纖維和溶菌酶的沉淀增加；血管壁開始 增厚最后變薄，炎性細(xì)胞浸潤周圍；黑素細(xì)胞增殖活性增強(qiáng)密度增加等。
[0007] 彈力纖維和膠原纖維的改變與皮膚光老化的表現(xiàn)較為密切。彈力纖維使皮膚富有 彈性，膠原纖維起到支撐和抗?fàn)坷淖饔?，二者質(zhì)和量的改變，均能導(dǎo)致皮膚外觀的變化。 在曰光暴露部位彈力纖維增多，且形態(tài)發(fā)生異常改變，出現(xiàn)增粗、扭曲、聚集成團(tuán)、排列不規(guī) 則等，是光老化皮膚的一個(gè)組織學(xué)特征。
[0008] 光老化是個(gè)長期慢性的過程，兼有皮膚自然老化時(shí)氣虛陰虧的特點(diǎn)。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)對(duì) 光老化的防治主要從調(diào)整陰陽、調(diào)理氣血、調(diào)治臟腑和祛痰延衰著眼。
[0009] 玉屏風(fēng)方是中醫(yī)"扶正固本"經(jīng)典名方，方由黃芪、白術(shù)、防風(fēng)3味藥物組成。黃 芪益氣固表，補(bǔ)益肺脾之氣，白術(shù)健脾兼扶正，防風(fēng)可疏散風(fēng)邪。黃芪能補(bǔ)三焦而實(shí)衛(wèi)氣； 白術(shù)健脾，可培土生金；防風(fēng)能遍行周身，可使固表不留邪，驅(qū)邪不傷正；三藥合用有益氣 固表、斂汗之效。玉屏風(fēng)正如其名，為人體抵御外邪構(gòu)建了一道保護(hù)屏障。有實(shí)驗(yàn)研究表 明，黃芪有增強(qiáng)表皮細(xì)胞內(nèi)自身氧化酶系活力的作用，能夠大幅提高SOD活性，還能加速離 體表皮細(xì)胞的分裂生長，可延長表皮細(xì)胞的壽命，黃芪總黃酮是一種良好的抗氧化劑，能夠 清除多種自由基，通過對(duì)自由基的清除發(fā)揮對(duì)UV損傷的防護(hù)作用。黃芪能增強(qiáng)網(wǎng)狀內(nèi)皮系 統(tǒng)的吞噬功能，使血白細(xì)胞數(shù)巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)顯著升高；可增強(qiáng)刀豆素 A激發(fā)的T淋巴 細(xì)胞增殖反應(yīng)，同時(shí)對(duì)T細(xì)胞、B細(xì)胞、DC功能具有明顯的增強(qiáng)作用。黃芪能增加羥脯氨酸 (HYP)含量，減少膠原的交鏈，起到延緩衰老的作用。黃芩苷可有效保護(hù)人成纖維細(xì)胞免于 UVA損傷和延緩光老化進(jìn)程，具體機(jī)制可能與抑制氧化損傷和調(diào)控等老化相關(guān)基因表 達(dá)有關(guān)。抑制酪氨酸酶活性可阻止皮膚黑素生成，雷鐵池等通過實(shí)驗(yàn)證明在篩選的82種中 藥中白術(shù)抑制酪氨酸酶活性的作用最強(qiáng)。白術(shù)能提高12月齡以上小鼠紅細(xì)胞SOD活性，抑 制小鼠腦單胺氧化酶B(MO-B)活性，對(duì)抗細(xì)胞自氧化溶血，并且有清除氧自由基的作用， 具有一定的抗衰老作用。
[0010] 玉屏風(fēng)散含藥血清具有抗皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞和皮膚成纖維細(xì)胞光老化的作用， 其作用機(jī)理與直接促進(jìn)細(xì)胞生長和增殖有關(guān)。玉屏風(fēng)散對(duì)紫外線照射引起的大鼠皮膚光老 化具有保護(hù)作用，機(jī)制可能是一方面玉屏風(fēng)散具有清除自由基、促進(jìn)表皮細(xì)胞分裂，增加真 皮膠原蛋白合成的作用；另一方面玉屏風(fēng)散能夠減少表皮郎格罕斯細(xì)胞（LC)遷移，保護(hù)其 樹突狀結(jié)構(gòu).人體內(nèi)天然抗氧化劑SOD(超氧化物歧化酶）活力隨著年齡增長逐漸降低， 而實(shí)驗(yàn)證明玉屏風(fēng)散能改善微循環(huán)，提高血漿TSOD和CiuZn-SOD活力，并增加了紅細(xì) 胞和血紅蛋白含量，提高了血液的帶氧能力，從而促進(jìn)細(xì)胞的新陳代謝，提高機(jī)體的抗 氧化能力。
[0011] 回顧以往，玉屏風(fēng)多以顆粒劑、膠囊劑、軟膠囊、微丸、滴丸、口服液劑為主，鮮有外 用制劑，尤其用于改善光老化的凝膠劑未見報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 本發(fā)明解釋為了解決紫外線照射后的慢性UV損傷問題，而提供一種中藥加味玉 屏風(fēng)凝膠劑及其制備方法和用途。
[0013] 本發(fā)明以"內(nèi)病外治"為依據(jù)，并根據(jù)外用透皮吸收的特點(diǎn)提取中藥原料，采用有 效部位或有效組分制備成凝膠劑，直接作用于UV損傷皮膚，不通過肝臟的首過效應(yīng)，也減 少胃腸道酶對(duì)其的破壞，對(duì)光老化皮損改善明顯。
[0014] 鑒于黃芩的黃酮類成分在抗氧化、抗炎和抗過敏方面有很強(qiáng)的藥理作用，為了能 加強(qiáng)玉屏風(fēng)抗氧化作用，并預(yù)防治療光老化所造成的炎性反應(yīng)，故在玉屏風(fēng)的基礎(chǔ)上增加 了黃芩一味中藥，起到協(xié)同、補(bǔ)充作用。
[0015] 本發(fā)明是按照以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。
[0016] 一種加味玉屏風(fēng)凝膠劑，該凝膠劑按以下重量份數(shù)比的原料制成的，黃芪3?12 份、白術(shù)1?6份、防風(fēng)1?6份、黃苳1?2份；將上述原料的提取物按w/v比加入藥 用輔料水溶性高分子基質(zhì)卡波姆〇. 5%~2%，保濕劑甘油2%~10%、丙二醇2%~10%、促滲劑氮 酮0. 5%~1. 5%、防腐劑尼泊金乙酯0. 5%。~1%。，放置24小時(shí)以上，加入pH調(diào)節(jié)劑三乙醇胺 0. 5%~1. 5%及純凈水，配至100%，充分?jǐn)嚢杈鶆颍玫剿苄阅z劑。
[0017] 所述一種加味玉屏風(fēng)凝膠劑的制備方法，其是按如下步驟制備的： a. 按重量份數(shù)比稱取以下原料，黃苗3?12份、白術(shù)1?6份、防風(fēng)1?6份、黃苳1? 2份，加30%?90%乙醇提取2?3次，加醇量分別為藥材量的5?15倍，分別提取1?2. 5 小時(shí)，過濾，濾液合并，回收乙醇濃縮至浸膏； b. 將上述浸膏按w/v比，依次加入甘油2%~10%、丙二醇2%~10%、氮酮0. 5%~1. 5%、尼泊 金乙酯0. 5%。~1%。、卡波姆0. 5%~2%，充分?jǐn)嚢?，放?4小時(shí)以上；加三乙醇胺0. 5%~1. 5% 調(diào)節(jié)pH值，加純凈水調(diào)配至100%，充分?jǐn)嚢杈鶆蚣闯伞?br> [0018] 所述一種加味玉屏風(fēng)凝膠劑的制備方法，其是按如下步驟制備的： a. 按重量份數(shù)比稱取的黃芪3?12份、黃芩1?2份，經(jīng)所述乙醇提取濃縮，制成浸 膏；另將白術(shù)1?6份、防風(fēng)1?6份，加水5?15倍，用揮發(fā)油提取器提取揮發(fā)油2?8 小時(shí)，收集揮發(fā)油，用吐溫-80稀釋，加入上述浸膏中； b. 將上述浸膏按w/v比，依次加入甘油2%~10%、丙二醇2%~10%、氮酮0. 5%~1. 5%、尼泊 金乙酯0. 5%。~1%。、卡波姆0. 5%~2%，充分?jǐn)嚢?，放?4小時(shí)以上；加三乙醇胺0. 5%~1. 5% 調(diào)節(jié)pH值，加純凈水調(diào)配至100%，充分?jǐn)嚢杈鶆蚣闯伞?br> [0019] 所述一種加味玉屏風(fēng)凝膠劑的制備方法，其是按如下步驟制備的： a. 按重量份數(shù)比稱取以下原料，黃苗3?12份、黃苳1?2份、白術(shù)1?6份和防風(fēng) 1?6份，加水提取2?3次，加水量分別為藥材量的5?15倍，分別提取1?2. 5小時(shí)，過 濾，濾液合并，濃縮至比重I. 1?1. 3的浸膏，加入95%乙醇使含醇量為50%?80%，使其沉 淀，離心或過濾，將上清液或?yàn)V液回收乙醇，并繼續(xù)濃縮至浸膏； b. 將上述浸膏按w/v比，依次加入甘油2%~10%、丙二醇2%~10%、氮酮0. 5%~1. 5%、尼泊 金乙酯0. 5%。~1%。、卡波姆0. 5%~2%，充分?jǐn)嚢?，放?4小時(shí)以上；加三乙醇胺0. 5%~1. 5% 調(diào)節(jié)pH值，加純凈水調(diào)配至100%，充分?jǐn)嚢杈鶆蚣闯伞?br> [0020] 所述一種加味玉屏風(fēng)凝膠劑的制備方法，其是按如下步驟制備的： 所述黃芪是黃芪總皂苷，所述黃芩是黃芩苷，所述白術(shù)是白術(shù)揮發(fā)油，所述防風(fēng)是防風(fēng) 揮發(fā)油， 所述a.按重量份數(shù)比稱取的黃芪總皂苷45?160份和黃芩苷40?80份，加純凈水 溶解，另將白術(shù)揮發(fā)油6?36份和防風(fēng)揮發(fā)油0. 5?6份用吐溫-80稀釋，混合成浸膏；其 中所述純凈水為浸膏重量的45?90%，吐溫-80為浸膏重量的0. 5?3%。
[0021] 所述的加味玉屏風(fēng)凝膠劑在制備防治光老化外用藥物中的應(yīng)用。
[0022] 這樣設(shè)計(jì)的本發(fā)明以"內(nèi)病外治"為依據(jù)，并根據(jù)外用透皮吸收的特點(diǎn)提取中藥原 料，采用有效部位或有效組分制備成凝膠劑，直接作用于UV損傷皮膚，不通過肝臟的首過 效應(yīng)，也減少胃腸道酶對(duì)其的破壞，對(duì)光老化皮損改善明顯，該凝膠劑在治療光老化方面具 有顯著療效。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023] 圖1是造模后小鼠皮膚組織學(xué)HE染色觀察； 圖2是造模后小鼠皮膚彈力纖維Weigert染色觀察； 圖3是加味玉屏風(fēng)組小鼠皮膚組織學(xué)HE染色觀察； 圖4是加味玉屏風(fēng)組小鼠皮膚彈力纖維、膠原纖維Weigert染色觀察； 圖5是自然恢復(fù)組小鼠皮膚組織學(xué)HE染色觀察； 圖6是自然恢復(fù)組小鼠皮膚彈力纖維、膠原纖維Weigert染色觀察； 圖7是凝膠空白基質(zhì)組HE染色圖； 圖8是凝膠空白基質(zhì)組E. V. G染色圖； 圖9是造模后CK5的表達(dá)圖； 圖10是造模后CK14的表達(dá)圖； 圖11是加味玉屏風(fēng)組CK5的表達(dá)圖； 圖12是加味玉屏風(fēng)組CK14的表達(dá)圖； 圖13是自然恢復(fù)組CK5的表達(dá)圖； 圖14是自然恢復(fù)組CK14的表達(dá)圖； 圖15是凝膠空白基質(zhì)組CK5的表達(dá)圖； 圖16是凝膠空白基質(zhì)組CK14的表達(dá) 圖17是造模后CKl表達(dá)圖； 圖18是造模后CKlO表達(dá)圖； 圖19是加味玉屏風(fēng)凝膠干預(yù)后CKl表達(dá)圖； 圖20是加味玉屏風(fēng)凝膠干預(yù)后CKlO表達(dá)圖； 圖21是自然恢復(fù)組CKl表達(dá)圖； 圖22是自然恢復(fù)組CKlO表達(dá)圖。
[0024]

【具體實(shí)施方式】： 下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說明。
[0025] 一·實(shí)施例 實(shí)施例1 : 一種加味玉屏風(fēng)凝膠劑，稱取黃芪60g、黃芩20g、白術(shù)30g和防風(fēng)30g，混合，加80%乙 醇提取2次，加醇量分別為藥材量的10倍(W/V)計(jì)1400mL，分別提取2小時(shí)，過濾，濾液合 并，回收乙醇濃縮至浸膏68g。
[0026] 將上述浸膏，加甘油4. 25g、丙二醇4. 25g，氮酮0. 85g，攪拌，加卡波姆-980 0. 85g，含0. 05g尼泊金乙酯的乙醇溶液lmL，攪拌，放置24小時(shí)以上，加三乙醇胺0. 85g， 加純凈水配至85g，充分?jǐn)嚢杈鶆蚨伞?br> [0027] 實(shí)施例2 : 一種加味玉屏風(fēng)凝膠劑，先稱取黃芪60g、黃芩15g，混合，加70%乙醇提取2次，加醇量 分別為藥材量的8倍(W/V)計(jì)600mL，分別提取1. 5小時(shí)，過濾，濾液合并，回收乙醇濃縮至 浸膏38g。
[0028] 另將白術(shù)、防風(fēng)各20g，混合粉碎過1號(hào)藥典篩，加水8倍量計(jì)320mL，用揮發(fā)油提 取器提取揮發(fā)油8小時(shí)，收集揮發(fā)油0. 15mL，用吐溫-80稀釋至0. 65mL，加入到上述浸膏 中。
[0029] 最后在上述浸膏中，加甘油2g、丙二醇2g、氮酮0. 65g、含0. 02g尼泊金乙酯的乙醇 溶液0. 4mL，攪拌，加卡波姆-980 0. 7g，攪拌，放置24小時(shí)以上，加三乙醇胺0. 7g，加純凈 水配至46g，充分?jǐn)嚢杈鶆蚨伞?br> [0030] 實(shí)施例3 : 一種加味玉屏風(fēng)凝膠劑，稱取黃芪60g、白術(shù)20g、防風(fēng)20g、黃芩10g，加水提取3次，力口 水量分別為藥材量的12倍(W/V)計(jì)1320mL，分別提取1. 5小時(shí)，過濾，濾液合并，濃縮至比 重1. 25的浸膏，加入95%乙醇使含醇量達(dá)到70%，使其沉淀，離心或過濾，將上清液或?yàn)V液回 收乙醇，并繼續(xù)濃縮至浸膏95g。
[0031] 在上述浸膏中，加甘油3. 3g、丙二醇3. 3g、氮酮lg、含0. Ig尼泊金乙酯的乙醇溶液 2mL，攪拌，加卡波姆-980 0.66g攪拌，放置24小時(shí)以上，加三乙醇胺I. lg，加純凈水配至 ll〇g，充分?jǐn)嚢杈鶆蚨伞?br> [0032] 實(shí)施例4 : 一種加味玉屏風(fēng)凝膠劑，稱取白術(shù)、防風(fēng)各30g，混合粉碎過1號(hào)篩，加水量為藥材量的 6倍（W/V)計(jì)360mL，用揮發(fā)油提取器提取揮發(fā)油6小時(shí)，收集揮發(fā)油0. 2mL，用吐溫-80稀 釋至0. 8 mL，備用。
[0033] 黃芪皂苷I. 6g、黃芩苷I. Og加入純凈水85mL，攪勻溶解，加入上述稀釋后揮發(fā)油， 再依次加入甘油5g、丙二醇5g、氮酮0. 5g、含0. Ig尼泊金乙酯的乙醇溶液2mL，加卡波姆 I. 〇g，攪拌，放置24小時(shí)以上；加三乙醇胺I. 0g，加純水配至100g，充分?jǐn)嚢杈鶆蚨伞?[0034] 所述黃芪總皂苷、黃芩苷系南京狄爾格醫(yī)藥科技有限公司市售商品，所述白術(shù)揮 發(fā)油，防風(fēng)揮發(fā)油系自行制備。
[0035] 實(shí)施例5 : 黃芪60g加60%乙醇提取兩次，加醇量分別為藥材量的8倍（W/V)計(jì)480mL，分別提取 1. 5小時(shí)，過濾，濾液合并，得黃芪醇提液備用。
[0036] 白術(shù)20 g、防風(fēng)20 g，加水量為藥材量的8倍（W/V)計(jì)320mL，用揮發(fā)油提取器提 取揮發(fā)油4小時(shí)，收集揮發(fā)油0.12 mL，用吐溫-80稀釋至0.6 mL，備用，其過濾水煎液作為 第一煎，第二煎加水8倍即320mL，提取40分鐘，過濾，合并濾液，濃縮至40g，加入95%乙醇 使含醇量達(dá)到60%，使其沉淀，離心或過濾，將上清液或?yàn)V液加入上述黃芪醇提液一起回收 乙醇，并繼續(xù)濃縮至浸膏46g。
[0037] 將上述浸膏加丙二醇5. 5g、黃芩苷0. 5g、上述稀釋后揮發(fā)油，攪拌均勻，加卡波姆 0. 82g充分?jǐn)嚢?，放?4小時(shí)以上，加三乙醇胺0. 82g，加適量純凈水配至55g，繼續(xù)攪拌均 勻而成。
[0038] 本發(fā)明所用水溶性凝膠基質(zhì)包括藥學(xué)上允許的所有適宜藥用輔料。并且除水溶性 凝膠外，還包括乳膏劑、巴布劑等其它外用劑型。
[0039] 二.療效觀察 外用加味玉屏風(fēng)凝膠對(duì)皮膚慢性UV損傷小鼠模型的治療療效觀察 1材料 1. 1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 普通健康清潔級(jí)昆明種小鼠40只，雌雄各半，鼠齡6周（18-22g)，由天津市山川紅實(shí)驗(yàn) 動(dòng)物科技有限公司提供，生產(chǎn)許可證：scxk (津）2013-0001。
[0040] 1.2實(shí)驗(yàn)主要儀器 SS-03AB型紫外線光療儀上(購于海希格瑪高技術(shù)有限公司）（UVB發(fā)射光譜 260~350mn，峰值 311nm ;UVA 發(fā)射光譜 340~400nm，峰值 365nm) !National NN-5250 型一按 感應(yīng)微波爐（National公司）;YT-6生物組織拷片機(jī)（湖北孝感亞光醫(yī)用電子技術(shù)研究所）； SHAND0N-AS325切片機(jī)；ΚΜΥ-103型電熱干燥箱；OLYMPUS雙目生物顯微鏡。
[0041] 1.3實(shí)驗(yàn)主要試劑 彈力纖維EVG染色液4X20ml (高錳酸鉀溶液、草酸溶液、Elastin溶液、Van Gieson 染液）購于珠海貝索生物技術(shù)有限公司（生產(chǎn)批號(hào)：610111); 一抗兔抗鼠 CK5單克隆抗體(克隆號(hào)bs-1060R)濃縮液、兔抗鼠 CK14單克隆抗體(克 隆號(hào)bs-1792R)濃縮液均購自于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司； 兔抗鼠 CKl單克隆抗體(克隆號(hào)bs-1244R)濃縮液、兔抗鼠 CKlO單克隆抗體(克隆號(hào) bs-2700R)濃縮液均購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司； SABC免疫組化染色試劑盒（5%BSA封閉液、二抗、SABC)購于武漢博士德生物技術(shù)有限 公司； 液體DAB酶底物顯色試劑盒（3ml批號(hào)：911882A)由A (濃縮緩沖液)、B (DAB溶液)、C (濃縮H2O2溶液）三種溶液組成； 抗原修復(fù)液：檸檬酸抗原修復(fù)緩沖液粉劑，購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。 [0042] 2 方法 2.1慢性UV損傷小鼠模型的建立 將30只昆明小鼠，先用清水浸濕小鼠背部預(yù)脫毛部位，約3cmX5cm，用眼科小剪擴(kuò)大 范圍粗略剪去長毛，用刀片將其余背毛盡量剃除干凈，以確保小鼠皮膚與UV充分接觸。脫 毛時(shí)應(yīng)避免損傷小鼠皮膚，以免影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。由于小鼠背毛生長較快，所以在UV照射期 間隔天剃毛一次。
[0043] 將小鼠固定于自制塑料固定盒內(nèi)，黑布遮擋頭部，背部照射部位充分暴露，置于 SS-03AB型紫外線光療儀正下方30cm處，UVB強(qiáng)度為0. 45mW/cm2, UVA強(qiáng)度為6. 7mW/cm2; UVB的輻照劑量為0. 07J/cm2, UVA為10倍UVB輻照劑量即0. 7J/cm2,每天照射1次，每周 照射5天，每周增加0. 5個(gè)紅斑量，共照射9周完成光老化模型建立。UVB累計(jì)照射劑量達(dá) 9. 45J/cm2, UVA 累計(jì)照射劑量達(dá) 94. 5J/cm2。
[0044] 照射期間嚴(yán)格執(zhí)行實(shí)驗(yàn)計(jì)劃照射劑量及時(shí)間，每天肉眼觀察小鼠皮膚變化情況， 如有水皰、糜爛等出現(xiàn)，立即剔除，以免影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0045] 2. 2小鼠分組及給藥 待光老化模型成功建立后，將小鼠隨機(jī)分成3組，每組10只，按性別分籠飼養(yǎng)。即凝膠 基質(zhì)空白組、自然恢復(fù)組、加味玉屏風(fēng)組。自然恢復(fù)組不予處理自然恢復(fù)，其他干預(yù)4周，力口 味玉屏風(fēng)組每日分別外涂相同劑量的加味玉屏風(fēng)凝膠（以20g小鼠為例，約為3. 3g/d)，4周 干預(yù)結(jié)束后取老鼠背部皮膚，并斷椎處死小鼠。用10 %水合氯醛（0.3 ml/ 100 g)腹腔麻 醉，固定于自制處置臺(tái)，背部皮膚充分暴露。常規(guī)消毒后切取小鼠背部照射部位脊柱右側(cè)的 皮膚組織，并用10%福爾馬林溶液固定后進(jìn)行石蠟包埋、切片、貼片與烤片，HE染色、EVG染 色，SABC免疫組化判定CK5、CK14及CKl、CKlO的表達(dá)。
[0046] 2.3 結(jié)果 2. 3. 1實(shí)驗(yàn)小鼠皮膚肉眼觀察 造模后小鼠皮膚明顯增厚且粗糙，干燥，彈性減退，光澤感下降，皮紋加深，可見粗大的 皮溝。自然恢復(fù)組小鼠皮膚外觀較慢性UV損傷后改善不明顯。在加味玉屏風(fēng)凝膠干預(yù)慢 性UV損傷小鼠模型4周后，小鼠皮膚光澤度有所提升，干燥明顯改善，皮膚彈性有所恢復(fù)， 加深的皮紋略變淺。
[0047] 2· 3· 2HE 染色及 EVG 染色 本實(shí)驗(yàn)采用間苯二酚-堿性品紅染色（Weigert染色法），用于皮膚的組織結(jié)構(gòu)及彈力 纖維、膠原纖維變化的檢測。染色后膠原纖維呈紅色，彈力纖維呈藍(lán)黑色，肌纖維、紅細(xì)胞 呈黃色。
[0048] 造模后小鼠表皮薄厚不一，伴有角化過度及角化不全，角質(zhì)形成細(xì)胞變大，輪廓不 清，部分核深染，形態(tài)不規(guī)則；真皮層明顯變厚，真皮淺層結(jié)構(gòu)疏松，真皮層微血管擴(kuò)張，附 屬器不規(guī)則增生，大量炎性細(xì)胞浸潤；膠原纖維束明顯腫脹變性，均質(zhì)化，形成片狀、塊狀， 并可見無定型物質(zhì)沉積；真皮層彈力纖維增粗、變多，部分增生的彈力纖維斷裂、破碎、卷曲 扭結(jié)、聚集成團(tuán)、排列紊亂，無定形，毛囊周圍最為明顯，有的甚至消失（圖1-2)。
[0049] 加味玉屏風(fēng)凝膠干預(yù)4周后小鼠表皮薄厚一致，細(xì)胞大小排列均勻一致，細(xì)胞層 數(shù)與造模后相比明顯減少，真皮層結(jié)構(gòu)較為致密，可見表皮突，僅可見少量炎性細(xì)胞；真皮 內(nèi)彈力纖維和膠原纖維與造模后比較明顯變細(xì)，并且排列整齊有序，與皮膚表面平行，呈波 浪狀，無卷曲扭結(jié)（圖3-4)。
[0050] 凝膠空白基質(zhì)組與自然恢復(fù)組的小鼠皮膚組織在干預(yù)4周后組織結(jié)構(gòu)未發(fā)生變 化。表皮仍薄厚不一，伴有角化過度及角化不全。真皮層仍較空白組增厚明顯，大量炎性細(xì) 胞浸潤；膠原纖維、彈力纖維仍較粗，仍有部分卷曲扭結(jié)、聚集成團(tuán)（圖5-8)。
[0051] 2. 2. 3 CK5 和 CK14 的表達(dá) 照射紫外線后CK5、CK14在表皮內(nèi)呈彌漫性表達(dá)，幾乎全層表達(dá)見圖9、圖10,陽性率 均為95%。
[0052] 加味玉屏風(fēng)組CK5的表達(dá)呈陰性或弱陽性表達(dá)，表達(dá)接近表皮上層見圖11，陽性 率為50%，與用藥前表達(dá)情況相比t=5. 339, P=O. 000, P < 0. 05,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義見表I ;CK14 的表達(dá)呈弱陽性，多數(shù)仍表達(dá)在基底層，偶見表達(dá)于基底層上部見圖12,陽性率為70%，與 用藥前表達(dá)情況相比t=5. 480, P=O. 000, P < 0. 05,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義見表2。
[0053] 自然恢復(fù)組與凝膠空白基質(zhì)組的小鼠皮膚組織在干預(yù)4周后角蛋白的表達(dá)仍呈 陽性反應(yīng)見圖13-16，陽性率仍為95%，與干預(yù)前相比，CK14 t均=1. 000, /? =0.330， 巧0. 05無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；CK5自然恢復(fù)組t=l. 453，片0. 163，巧0. 05無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；凝膠空白 基質(zhì)組t=l. 000,片0. 330,巧0. 05無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

【權(quán)利要求】
1. 一種加味玉屏風(fēng)凝膠劑，其特征在于：該凝膠劑按以下重量份數(shù)比的原料制成的， 黃芪3?12份、白術(shù)1?6份、防風(fēng)1?6份、黃芩1?2份；將上述原料的提取物按w/v 比加入藥用輔料水溶性高分子基質(zhì)卡波姆0. 5%~2%，保濕劑甘油2%~10%、丙二醇2%~10%、促 滲劑氮酮〇. 5%~1. 5%、防腐劑尼泊金乙酯0. 5%。~1%。，放置24小時(shí)以上，加入pH調(diào)節(jié)劑三 乙醇胺0. 59(^1. 5%及純凈水，配至100%，充分?jǐn)嚢杈鶆?，得到水溶性凝膠劑。
2. 如權(quán)利要求1所述一種加味玉屏風(fēng)凝膠劑的制備方法，其特征在于： a. 按重量份數(shù)比稱取以下原料，黃苗3?12份、白術(shù)1?6份、防風(fēng)1?6份、黃苳1? 2份，加30%?90%乙醇提取2?3次，加醇量分別為藥材量的5?15倍，分別提取1?2. 5 小時(shí)，過濾，濾液合并，回收乙醇濃縮至浸膏； b. 將上述浸膏按w/v比，依次加入甘油2%~10%、丙二醇2%~10%、氮酮0. 5%~1. 5%、尼泊 金乙酯0. 5%。~1%。、卡波姆0. 5%~2%，充分?jǐn)嚢?，放?4小時(shí)以上；加三乙醇胺0. 5%~1. 5% 調(diào)節(jié)pH值，加純凈水調(diào)配至100%，充分?jǐn)嚢杈鶆蚣闯伞?br> 3. 如權(quán)利要求2所述一種加味玉屏風(fēng)凝膠劑的制備方法，其特征在于： 所述a.按重量份數(shù)比稱取的黃芪3?12份、黃芩1?2份，經(jīng)所述乙醇提取濃縮，制成 浸膏；另將白術(shù)1?6份、防風(fēng)1?6份，加水5?15倍，用揮發(fā)油提取器提取揮發(fā)油2? 8小時(shí)，收集揮發(fā)油，用吐溫-80稀釋，加入上述浸膏中。
4. 如權(quán)利要求2所述一種加味玉屏風(fēng)凝膠劑的制備方法，其特征在于： 所述a.按重量份數(shù)比稱取以下原料，黃苗3?12份、黃苳1?2份、白術(shù)1?6份和 防風(fēng)1?6份，加水提取2?3次，加水量分別為藥材量的5?15倍，分別提取1?2. 5小 時(shí)，過濾，濾液合并，濃縮至比重1. 1?1. 3的浸膏，加入95%乙醇使含醇量為50%?80%，使 其沉淀，離心或過濾，將上清液或?yàn)V液回收乙醇，并繼續(xù)濃縮至浸膏。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述一種加味玉屏風(fēng)凝膠劑的制備方法，其特征在于： 所述黃芪是黃芪總皂苷，所述黃芩是黃芩苷，所述白術(shù)是白術(shù)揮發(fā)油，所述防風(fēng)是防風(fēng) 揮發(fā)油， 所述a.按重量份數(shù)比稱取的黃芪總皂苷45?160份和黃芩苷40?80份，加純凈水 溶解，另將白術(shù)揮發(fā)油6?36份和防風(fēng)揮發(fā)油0. 5?6份用吐溫-80稀釋，混合成浸膏。
6. 如權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)所述的加味玉屏風(fēng)凝膠劑在制備防治光老化外用藥物 中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K9/06GK104491003SQ201510033202
【公開日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2015年1月23日 優(yōu)先權(quán)日:2015年1月23日
【發(fā)明者】蔣靖, 劉俊紅, 夏立君, 韓旭, 李定超 申請(qǐng)人:天津市南開醫(yī)院