專利名稱：一種血小板生成素?cái)M肽凍干制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種含有血小板生成素?cái)M肽的凍干粉針，以及相應(yīng)的制備工藝。
背景技術(shù)：
慢性特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)是一種自身性免疫性疾病，由致血小板減少的一種自身免疫反應(yīng)引起，其特征是血小板數(shù)降低，其患者面臨出血高風(fēng)險(xiǎn)，往往導(dǎo)致患者小血管出血，癥狀為淤青、鼻出血和牙齦出血，嚴(yán)重者可出現(xiàn)致命性胃腸道和腦內(nèi)出血。目前治療ITP的主要手段是使用免疫抑制類藥物，如皮質(zhì)類固醇、靜注免疫球蛋白、抗D免疫球蛋白和Genentech公司產(chǎn)品利妥昔單抗，而對(duì)嚴(yán)重衰竭性病人的最后一著則是行脾切除術(shù)。其中大多數(shù)治療藥物未曾經(jīng)歷隨機(jī)安慰劑對(duì)照臨床試驗(yàn)的考察，雖對(duì)不同患者群均有效，但同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副反應(yīng)，其作用機(jī)制是阻止血小板破壞，而非促進(jìn)血小板產(chǎn)生。血小板生成素(TPO)為一種糖蛋白，主要產(chǎn)生于肝臟，在巨核細(xì)胞及血小板的產(chǎn)生中起著重要的調(diào)節(jié)作用。其與c-Mpl結(jié)合后可激活下游信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而導(dǎo)致巨核細(xì)胞的分化和增值，且伴隨著血小板水平升高。第1代促血小板生成劑-糖基化全長(zhǎng)重組人血小板生成素(rhTPO)和聚乙二醇化重組人巨核細(xì)胞生長(zhǎng)及發(fā)育因子(PEG-rHuMGDF)隨之問世。其可促進(jìn)健康受試者體內(nèi)巨核細(xì)胞生成，并提高血小板數(shù)量，且在用于治療癌癥患者、 免疫性血小板生成素減少性紫癜患者及接受非清髓性化療的癌癥患者的研究中均獲得了成功。然而，第1代促血小板生成劑可能會(huì)導(dǎo)致受試者體內(nèi)產(chǎn)生抗TPO抗體，因而具有誘發(fā)血小板減少癥的風(fēng)險(xiǎn)，糖基化全長(zhǎng)重組人血小板生成素(rhTPO)和聚乙二醇化重組人巨核細(xì)胞生長(zhǎng)及發(fā)育因子(PEG-rHuMGDF)的開發(fā)被迫停止。此后研究人員在多肽文庫(kù)中尋找隨機(jī)、無相關(guān)性的多肽，企圖可在不產(chǎn)生抗TPO抗體的情況下刺激依賴于TPO的細(xì)胞株；在嘗試將篩選得到的多肽連接于各種載體分子，以增加其半衰期。由此開發(fā)出以血小板生成素?cái)M肽為代表的第2代促血小板生成劑。血小板生成素?cái)M肽在健康受試者及ITP患者中的試驗(yàn)均獲得了成功，且試驗(yàn)中亦未見受試者體內(nèi)產(chǎn)生抗TPO抗體。血小板生成素?cái)M肽為一種新型重組蛋白，可特異性結(jié)合并激活血小板生成素 (TPO)受體c-Mpl，從而顯著提高血小板水平。血小板生成素?cái)M肽含有兩個(gè)相同的亞單位， 每個(gè)亞單位分別由一個(gè)IgGl Fc結(jié)構(gòu)區(qū)和c-Mpl結(jié)合區(qū)共價(jià)結(jié)合構(gòu)成，且與TPO無氨基酸序列同源性，故不會(huì)在用藥者體內(nèi)產(chǎn)生抗TPO抗體。血小板生成素?cái)M肽的生產(chǎn)是利用基因工程技術(shù)構(gòu)建出血小板生成素?cái)M肽原核表達(dá)菌株，采用發(fā)酵工程技術(shù)實(shí)現(xiàn)了血小板生成素?cái)M肽高密度發(fā)酵，通過蛋白質(zhì)復(fù)性和純化技術(shù)純化出符合藥用級(jí)別的血小板生成素?cái)M肽原液，配制成制劑。主要用于治療脾切除及非脾切除的成人免疫性血小板減少癥。但是，蛋白質(zhì)藥物的生物學(xué)活性受多種環(huán)境因素的影響，可能發(fā)生多種物理或化學(xué)變化，例如聚合、氧化和降解等現(xiàn)象，從而大大喪失活性。因此我們選擇了適合的劑型、輔料、生產(chǎn)工藝，通過控制關(guān)鍵的工藝條件，使制的的產(chǎn)品保持了很高的活性和穩(wěn)定性。中試研究表明，產(chǎn)品制造工藝穩(wěn)定，操作簡(jiǎn)單，周期短，成本低，適合產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了提供一種能穩(wěn)定保存血小板生成素?cái)M肽蛋白，并適合于實(shí)際臨床使用的含有重組血小板生成素?cái)M肽的凍干紛針。為達(dá)到發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是
一種含有血小板生成素?cái)M肽的凍干粉針，所述凍干粉針由血小板生成素?cái)M肽與藥用級(jí)穩(wěn)定性輔料溶于PH5 6的緩沖液中得到，所述血小板生成素?cái)M肽蛋白濃度為0. 1 Img/mL。血小板生成素?cái)M肽原液由我公司制備，其制備方法在我公司申請(qǐng)的專利申請(qǐng)?zhí)枮?201110235281.5中已有詳細(xì)記載，在此不再獒述。所述穩(wěn)定性輔料可根據(jù)需要適當(dāng)添加。 本發(fā)明中優(yōu)選穩(wěn)定性輔料為甘露醇、甘氨酸和吐溫80，優(yōu)選甘露醇質(zhì)量濃度為2-8%，更優(yōu)選甘露醇質(zhì)量濃度為5%。優(yōu)選甘氨酸質(zhì)量濃度為1_5%，更優(yōu)選甘氨酸質(zhì)量濃度為2. 5%。 優(yōu)選吐溫80體積濃度為0. 001%-0. 01%,更優(yōu)選溫80體積濃度為0. 005%。所述血小板生成素?cái)M肽的蛋白濃度為0. 1 lmg/mL。所述緩沖液為磷酸鹽緩沖液、或檸檬酸緩沖液、或醋酸一醋酸鈉緩沖液。所述緩沖液優(yōu)選為醋酸一醋酸鈉緩沖液，濃度為5 50mmol/L。優(yōu)選的，所述凍干粉針由血小板生成素?cái)M肽與甘氨酸溶于pH5 6的濃度為 5 50mmol / L醋酸-醋酸鈉緩沖液中得到，所述血小板生成素?cái)M肽蛋白濃度為0. 1 Img / mL，所述甘露醇質(zhì)量濃度為2-8%，甘氨酸質(zhì)量濃度為1 4%，吐溫80體積濃度為 0.001%-0. 01%。更優(yōu)選的，所述凍干粉針由血小板生成素?cái)M肽蛋白與甘氨酸溶于pH5. 5、濃度 20mmol / L的醋酸-醋酸鈉緩沖液中得到，所述血小板生成素?cái)M肽蛋白濃度為0. 5mg / mL, 所述甘露醇質(zhì)量濃度為5%，甘氨酸質(zhì)量濃度為2. 5%，吐溫80體積濃度為0. 005%。本發(fā)明所述的含有血小板生成素?cái)M肽凍干粉針的有益效果主要體現(xiàn)在提供了一種能穩(wěn)定保存血小板生成素?cái)M肽蛋白的凍干制劑，并適合于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
具體實(shí)施例方式為了提高含有血小板生成素?cái)M肽藥劑的穩(wěn)定性，進(jìn)行了深入的研究并且發(fā)現(xiàn)如果從合適的輔料挑選幾種加入制劑中，并通過選擇合適的PH及血小板生成素?cái)M肽的蛋白濃度，則可以有效達(dá)到這個(gè)目的。在血小板生成素?cái)M肽藥劑穩(wěn)定性研究過程中，選取了外觀檢測(cè)，SDS-PAGE電泳檢測(cè)，反相高效液相色譜分析，生物活性檢測(cè)等作為考察指標(biāo)，來觀察血小板生成素?cái)M肽藥劑的變化情況。下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此
實(shí)施例1 緩沖系統(tǒng)對(duì)血小板生成素?cái)M肽穩(wěn)定性的影響
可注射藥物制劑中PH是影響蛋白制品穩(wěn)定性的一個(gè)重要因素。通過加入合適的緩沖鹽類，來維持制劑PH。如加入磷酸鹽、醋酸鹽、檸檬酸鹽等。為了考察不同pH條件下制劑的穩(wěn)定性，按如下條件進(jìn)行了不同PH條件對(duì)制劑穩(wěn)定性的影響實(shí)驗(yàn)分別配制醋酸-醋酸鈉緩沖體系，檸檬酸鹽，磷酸鹽緩沖體系，Iml /瓶(蛋白濃度為 0. 5mg/ml)，pH 設(shè)計(jì)有 4. 0，4. 5，5. 0，5. 5，6. 0，6. 5，7. 0，7. 5，8. 0 濃度均為 20mmol/L，(見下表1)。通過使用SUPERDEX G-25脫鹽柱將血小板生成素?cái)M肽原液的緩沖體系替換成設(shè)計(jì)組，并將上述不同緩沖體系的血小板生成素?cái)M肽溶液放置于37°C條件下存放進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)，分別于7、14、觀和60天取樣檢測(cè)電泳純度(見表2)。檢測(cè)方法；SDS-PAGE非還原電泳方法。 表1 不同緩沖體系的配制
權(quán)利要求
1.一種血小板生成素?cái)M肽凍干制劑，其特征在于所述凍干制劑由血小板生成素與藥用輔料溶于PH5-6. 0的藥用緩沖液中得到，所述血小板生成素?cái)M肽蛋白濃度為0. I-Img/ ml;所述藥用輔料為甘露醇、甘氨酸和吐溫80，甘露醇質(zhì)量濃度為2-8%，甘氨酸質(zhì)量濃度為 1-5%,吐溫80體積濃度為0. 001%-0. 01%。
2.如權(quán)利要求1所述的一種血小板生成素?cái)M肽凍干制劑，其特征在于所述血小板生成素?cái)M肽蛋白濃度為0. 5 mg/ml。
3.如權(quán)利要求1所述的一種血小板生成素?cái)M肽凍干制劑，其特征在于所述甘露醇質(zhì)量濃度為5%，甘氨酸質(zhì)量濃度為2. 5%，吐溫80體積濃度為0. 005%。
4.如權(quán)利要求1-3任一所述的一種血小板生成素?cái)M肽凍干制劑，其特征在于所述緩沖液為磷酸鹽緩沖液、或檸檬酸緩沖液、或醋酸-醋酸鈉緩沖液。
5.如權(quán)利要求4所述的一種血小板生成素?cái)M肽凍干制劑，其特征在于所述緩沖液為醋酸-醋酸鈉緩沖液，濃度為5 50mmol/L，優(yōu)選20 mmol/L。
6.如權(quán)利要求5所述的一種血小板生成素?cái)M肽凍干制劑，其特征在于所述緩沖液為醋酸-醋酸鈉緩沖液，濃度為20 mmol/L。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種血小板生成素?cái)M肽凍干粉針劑，所述凍干制劑由血小板生成素與藥用輔料溶于pH5-6.0的藥用緩沖液中得到，所述血小板生成素?cái)M肽蛋白濃度為0.1-1mg/ml;所述藥用輔料為甘露醇、甘氨酸和吐溫80，甘露醇質(zhì)量濃度為2-8%，甘氨酸質(zhì)量濃度為1-5%，吐溫80體積濃度為0.001%-0.01%。該發(fā)明所述的含有血小板生成素?cái)M肽的凍干制劑具有高效、簡(jiǎn)便、低成本，并適合于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)A61K47/26GK102552184SQ201210034540
公開日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2012年2月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月16日
發(fā)明者劉寧, 劉紅軍, 宋磊, 陳文芳 申請(qǐng)人:山東泉港藥業(yè)有限公司