專利名稱：免疫原性組合物及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于制備經(jīng)純化EV71病毒抗原的方法。本發(fā)明亦相關(guān)于利用本發(fā)明的經(jīng)純化EV71病毒以制備免疫原性組合物及其免疫方法。
背景技術(shù)：
病毒感染引起各種病癥。舉例而言，腸病毒71 (Enterovirus 71/EV-71)為引起手足口病(hand，foot and mouth disease)的主要病原體之一，且與嚴重神經(jīng)疾病相關(guān)。由于對宿主的EV71感染反應(yīng)的分子機制了解極少，所以尚無對抗EV71感染的有效抗病毒制劑。故仍有需要發(fā)展有效對抗EV71感染的疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明系關(guān)于對抗EV71感染的免疫原性組合物(例如疫苗)及相關(guān)方法。因此，本發(fā)明一方面的特征在于一種制備經(jīng)純化EV71病毒抗原的方法，該EV71病毒抗原可用以制備對抗EV71感染的免疫原性組合物(例如疫苗)。該方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)產(chǎn)生EV71病毒的細胞、自細胞或培養(yǎng)基中純化EV71病毒(全粒子或次粒子)，及使經(jīng)純化的EV71病毒失活以獲得經(jīng)純化的EV71病毒抗原。培養(yǎng)基優(yōu)選為無血清培養(yǎng)基。純化步驟可通過液相層析純化、蔗糖梯度超速離心純化或兩者來進行。失活步驟可如下進行 在含有甲醛的溶液中在20-45°C下培養(yǎng)EV71病毒2至20天，例如在20_40°C下培養(yǎng)2至10 天，或在約37°C下培養(yǎng)2至5天。培養(yǎng)步驟可在旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶或微載體生物反應(yīng)器中進行。 在一實施例中，該方法進一步包括測定經(jīng)純化的EV71病毒抗原量的步驟。此測定步驟可通過定量ELISA來進行。在以上方法中，EV71病毒抗原可為經(jīng)分離的EV71病毒全粒子、經(jīng)分離的EV71病毒次粒子，或經(jīng)分離的EV71病毒蛋白。此等抗原可用于免疫原性組合物中。因此，在另一方面，本發(fā)明的特征為一種含有經(jīng)純化的EV71病毒抗原的免疫原性組合物。經(jīng)分離的病毒粒子、蛋白質(zhì)、多肽或肽是指實質(zhì)上不含天然結(jié)合分子的病毒粒子、 蛋白質(zhì)、多肽或肽，亦即以干重計為至少75% (亦即包括75%至100%在內(nèi)的任何數(shù)值) 純度。純度可通過任何適當標準方法(例如通過管柱層析、聚丙烯酰胺凝膠電泳或HPLC分析)量測。經(jīng)分離的肽、多肽或蛋白質(zhì)可純化自天然來源、通過重組DNA技術(shù)或化學方法產(chǎn)生。術(shù)語「蛋白質(zhì)」與「多肽」可互換使用以描述任何氨基酸鏈，而不論長度或轉(zhuǎn)譯后修飾 (例如糖基化或磷酸化)如何。因此，術(shù)語「本發(fā)明的多肽」包括本發(fā)明的全長、天然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)；對應(yīng)于本發(fā)明的全長天然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的重組或合成產(chǎn)生的多肽；或天然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的特定域或部分。該術(shù)語亦包涵具有附加的氨基端甲硫胺酸(適用于在原核細胞中表現(xiàn))的成熟多肽。肽是指足夠短而能由氨基酸組成成分人工制備的鏈。一般而言，肽為50個氨基酸殘基長或更短(例如50、40、30、20、15、10或5個殘基長)。病毒全粒子或完整病毒粒子是指由核酸(其基因組)經(jīng)蛋白質(zhì)保護殼(亦即衣殼)包圍組成的病毒粒子 (virion)。次粒子系指含有衣殼，但含有不完整基因組或不含核酸的粒子。例如參看Kinpe DM. R Howley PM. (2001)Fundamental Virology，第 4 版，第 18 章。
EV71病毒蛋白的實例包括第一EV 71病毒多肽，其包括EV71VP1蛋白的片段或肽， 該EV71 VPl蛋白具有選自下列組成的群的序列或由該序列組成SEQ ID NO :5_7、11-14、 16、20-M、39-41及44-46(列于下文)；及第二 EV71病毒多肽，其包括EV71VP2或VP 3蛋白的片段或肽。免疫原性組合物可進一步包括醫(yī)藥學上可接受的佐劑，諸如磷酸鋁。該第一或第二 EV71病毒多肽為至少15個氨基酸殘基長。該第二 EV71病毒多肽可包括選自由以下組成的群的序列或由該序列組成SEQ ID NO :1-4、8-10、25-四、31-32、34-；35、38、42及 43(列于下文)。上述抗原或組合物可用于誘發(fā)對腸病毒感染的免疫反應(yīng)。因此，可投予有效量的抗原或組合物至有需要的個體。「個體」是指人類及非人類動物。非人類動物的實例包括所有脊椎動物，例如哺乳類動物，諸如非人類的靈長類動物(尤其為較高等的靈長類動物)、 犬、嚙齒動物(例如小鼠或大鼠)、天竺鼠、貓，及非哺乳動物，諸如鳥類。在一較佳實施例中，個體為人類，尤其為幼兒。在另一實施例中，個體為實驗動物或適用作疾病模型的動物。本發(fā)明的一個或多個實施將于附圖及下文的說明中詳述。本發(fā)明的其它特征、目標及優(yōu)勢可由說明書、附圖及權(quán)利要求書而顯而易見。


圖1為展示在旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶中產(chǎn)生EV71-E59病毒原液的圖。圖2為展示在1.4L生物反應(yīng)器中產(chǎn)生EV71-E59病毒原液的圖。圖3為展示在5.0L生物反應(yīng)器中產(chǎn)生EV71-E59病毒原液的圖。圖4A-4C為展示通過液相層析對EV71-E59病毒原液進行純化的圖及相片。圖5為一組展示通過連續(xù)蔗糖梯度超速離心對EV71-E59病毒原液進行純化的圖及相片。圖6為一組展示EV71-E59病毒粒子的特征的相片。圖7為展示EV71-E59病毒的失活動力學的圖。圖8為展示通過TEM檢測EV71-E59病毒粒子的相片。
具體實施例方式本發(fā)明，至少部分，是基于EV71抗原可引發(fā)免疫反應(yīng)的意外發(fā)現(xiàn)及相關(guān)方法。 EV71 ^ΜΜΜΜ'ΜΜ^ (family Picornaviridae) WMMM (genus Enterovirus)白勺f 具外套的RNA病毒。此科的特征包括這些病毒不具外套、具二十面對稱性、直徑30士5nm、 含有單分子正義ss RNA(7. 5-8. 51Λ)，且其在細胞質(zhì)中復(fù)制。病毒衣殼為對稱的二十面體 (T = 1)且由60個相同單元構(gòu)成，各單元由以下四種結(jié)構(gòu)蛋白組成VP1、VP2、VP3及VP4。 EV71病毒在1969年于美國首次分離。已測定EV71原型病毒株BrCr的完整核苷酸序列。如本文所述，本發(fā)明的特征在于一種制備經(jīng)純化的EV71病毒抗原的方法。該方法包括培養(yǎng)產(chǎn)生EV71病毒的宿主細胞?？墒褂酶鞣N培養(yǎng)方法。實例包括基于旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶、微載體-生物反應(yīng)器、旋轉(zhuǎn)器及細胞于微載體珠粒間轉(zhuǎn)移(Beads-to-Beads transfer)的方法。可使用各種細胞作為產(chǎn)生上述EV71抗原的宿主。在一實例中，使用Vero細胞。 Vero細胞為人類疫苗制備的官方認可細胞株且已用來制備人類小兒麻痹疫苗(polio)及狂犬病疫苗。因為Vero細胞具固著依賴性，所以可使用微載體技術(shù)來建立用于疫苗制備的大規(guī)模細胞培養(yǎng)方法。為此，可使用微載體技術(shù)及無血清培養(yǎng)來克服使用高血清蛋白質(zhì)含量進行培養(yǎng)的缺點，包括復(fù)雜的下游純化過程及普里昂蛋白(prion)污染之風險。在一較佳實施例中，VP-SFM培養(yǎng)基(GIBCO)為較佳。亦可使用其它培養(yǎng)基，諸如Plus Vero(CESCO)、Excell(SAFC)及 HyQ(HYCL0NE)。為產(chǎn)生病毒抗原，一般可以10_2至10_6(例如約10_5)的MOI感染宿主細胞。對于收集，可使用批次、半批次或灌注技術(shù)。為純化病毒抗原，可使用液相層析(LC)或蔗糖梯度超速離心純化。可在25°C至37°C下使用例如4000 1 37%福爾馬林(formalin)進行病毒失活。為評估由此獲得的抗原及含有該抗原的疫苗的效能，可使用VP2抗原中的交叉中和抗原決定基(例如SEQ ID NO :1-4、8-10、25-29、31-32、34-35及38之一)作為疫苗效能測試的生物標記。本發(fā)明的特征在于一種對抗病毒感染及/或其它相關(guān)病癥(包括手足口病，及相關(guān)神經(jīng)疾病)的免疫原性組合物，諸如疫苗。如上所述，該免疫原性組合物含有抗原，例如 EV71病毒全粒子、EV71病毒次粒子或多肽?！缚乖故侵负幸粋€或多個將刺激宿主的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生體液反應(yīng)和/或細胞抗原特異性反應(yīng)的抗原決定基的粒子或分子。術(shù)語「抗原」可與「免疫原」互換使用。由于與適當
細胞進行接觸，因此抗原誘導敏感狀態(tài)或免疫反應(yīng)且在活體內(nèi)或活體外以可呈現(xiàn)方式與致敏個體的抗體或免疫細胞反應(yīng)。i^i^MI^Li*11!11
的抗體特異性識別及結(jié)合。與主要組織相容性復(fù)合體(MH C)結(jié)合的抗原亦可被T淋巴細胞(T-細胞)表面上的受體識別及結(jié)合，導致T-細胞活化。如本文中所用，術(shù)語「抗原決定基」是指抗原上由特定抗體分子或T-細胞受體所結(jié)合的位點。在本文中，該術(shù)語可與「抗原決定簇」或「抗原決定簇位點」互換使用。術(shù)語「免疫反應(yīng)」或「免疫原性反應(yīng)」是指個體中免疫系統(tǒng)響應(yīng)于抗原的任何反應(yīng)。脊椎動物免疫反應(yīng)的實例包括(但不限于)抗體產(chǎn)生、誘導細胞介導的免疫性及補體活化。對相同抗原后續(xù)刺激的免疫反應(yīng)(亦稱為二次免疫反應(yīng))快于初次免疫所產(chǎn)生之反應(yīng)。術(shù)語「免疫原性」系指在宿主動物中針對抗原產(chǎn)生免疫反應(yīng)的能力。此免疫反應(yīng)形成疫苗引發(fā)的針對特定感染生物體的保護性免疫力的基礎(chǔ)?！缚贵w」是指具有特定氨基酸序列且僅結(jié)合于一種抗原或密切相關(guān)的一組抗原的免疫球蛋白分子或免疫球蛋白分子的至少一個免疫活性部分?？贵w實例包括IgG、IgM、IgA、 IgD及IgE。免疫球蛋白分子的免疫活性部分的實例包括Fab及F(ab) ‘ 2片段，其可通過用諸如胃蛋白酶的酶處理抗體來產(chǎn)生?？贵w可為單克隆抗體或多克隆抗體?！竼慰寺】贵w」是指僅含有一個抗原結(jié)合位點且能夠與特定抗原決定基發(fā)生免疫反應(yīng)的一群抗體分子。「多克隆抗體」是指含有一個以上抗原結(jié)合位點且能夠與多肽上一個以上抗原決定基發(fā)生免疫反應(yīng)的一群抗體分子?？乖瓋?yōu)選可自宿主細胞或其培養(yǎng)基表達及分離。其一致性及純度可經(jīng)由此項技術(shù)中已知之方法(例如利用抗體的免疫印跡或質(zhì)譜分析)確定。由此制備的抗原可用以制備免疫原性組合物(例如疫苗)以便在易染病毒的個體(例如人類個體)體內(nèi)產(chǎn)生針對EV71 病毒的抗體及免疫反應(yīng)。例如可用下文所述的方式或通過此項技術(shù)中已知的任何其它等效方法制備這樣的組合物。此抗原可與醫(yī)藥學上可接受的載體(諸如磷酸鹽緩沖鹽水、碳酸氫鹽溶液)或佐劑混合以制備醫(yī)藥組合物。載體在其與組合物的活性成分兼容且較佳能夠穩(wěn)定活性成分且對待治療的個體無害的意義上須“可接受”?；谕端幠Ｊ郊巴緩郊皹藴梳t(yī)藥實施來選擇載體。適合的醫(yī)藥載體及稀釋劑、以及供其使用的醫(yī)藥必需品描述于Remington' s Pharmaceutical kiences中。在一實例中，將抗原與佐劑混合以形成適用于免疫調(diào)節(jié)的組合物。此組合物可制備成可注射劑、液體溶液或乳液。參看美國專利4，601，903; 4，599，231 ；4，599，230 ；及 4，596，792?！缸魟故侵柑砑又撩庖咴越M合物(諸如疫苗)中的物質(zhì)，其盡管本身不具有任何特定抗原作用，但可刺激免疫系統(tǒng)且增強對免疫原性組合物的免疫反應(yīng)。佐劑實例包括(但不限于)礬沈淀物(alum-precipitate)、弗氏完全佐劑(Freund' s complete adjuVant)、弗氏不完全佐劑(Freund' s incomplete adjuvant)、單磷?；?脂質(zhì)A/海藻糖二霉菌酸酉旨佐劑(monophosphoryl-lipid A/trehalose dicorynomycolate adjuvant) > 含有短棒狀桿菌(Corynebacterium parvum)及tRNA的油包水乳液，及通過模擬特定組的進化保守分子完成增強免疫反應(yīng)任務(wù)的其它物質(zhì)，該進化保守分子包括脂質(zhì)體、脂多醣 (LPS)、抗原之分子籠(molecular cage)、細菌細胞壁的組分，及胞飲核酸，諸如雙鏈RNA、單鏈DNA及含非甲基化CpG 二核苷酸的DNA。其它實例包括霍亂毒素(cholera toxin)、大腸桿菌(E. coli)熱不穩(wěn)定性腸毒素、脂質(zhì)體、免疫刺激復(fù)合物(ISCOM)、免疫刺激序列寡脫氧核苷酸及氫氧化鋁。組合物亦可包括有助于活體內(nèi)傳遞的聚合物。參看Au dran等人， Vaccine 21 1250-5，2003 ；及 Denis-Mize 等人，Cell Immunol.，225 12-20，2003?；蛘撸?本文所述的抗原可在無任何佐劑的情況下用于疫苗中。有效量的上述組合物可非經(jīng)腸投予，例如皮下注射或肌肉內(nèi)注射。或者，可能需要包括栓劑及經(jīng)口調(diào)配物的其它投藥模式。對于栓劑，黏合劑及載體可包括例如聚伸烷二醇或三酸甘油酯。經(jīng)口調(diào)配物可包括常用賦形劑，諸如醫(yī)藥級糖精、纖維素、碳酸鎂及其類似物。這些組合物采用溶液、懸浮液、錠劑、丸劑、膠囊、持續(xù)釋放調(diào)配物或散劑的形式。「有效量」意味研究者、獸醫(yī)、醫(yī)生或其它臨床醫(yī)師所尋求的在個體組織系統(tǒng)中或在個體體內(nèi)引發(fā)生物或醫(yī)學反應(yīng)的組合物的量。疫苗可經(jīng)與劑量調(diào)配物兼容的方式，及在治療上具有有效性、保護性及免疫原性的量投予。所投予的量視所治療的個體而定，包括，例如，個體免疫系統(tǒng)合成抗體及必要時產(chǎn)生細胞介導的免疫反應(yīng)的能力。需要投予的活性成分的確切量視從業(yè)者判斷而定。然而， 適合劑量范圍可由熟習此項技術(shù)者容易地決定且可為約數(shù)微克的本發(fā)明多肽。初次投藥及追加劑量的適合方案亦可變化，但可依次包括初次投藥及后續(xù)投藥。疫苗劑量亦可視投藥途徑而定且根據(jù)宿主體型而變。易受病毒感染影響的個體(尤其為幼兒)可通過此項技術(shù)中已知之方法鑒別且投予本發(fā)明的組合物。組合物劑量視例如特定抗原、是否共投予佐劑及所共投予佐劑的類型、 投藥模式及頻率而定，如可由熟習此項技術(shù)者決定。如可由熟習此項技術(shù)者決定，必要時重復(fù)投藥。舉例而言，致敏劑量之后可接著三次的追加劑量，時間間隔為每周一次?？稍谑状蚊庖吆?至8周提供追加注射(booster shot)，且第二次追加可在8至12周給予相同調(diào)配物?？勺詡€體取血清或T-細胞用于測試由組合物引發(fā)的對抗病毒的免疫反應(yīng)。此項技術(shù)中熟知檢定對抗蛋白質(zhì)或感染的抗體或細胞毒性T細胞的方法。需要時可提供額外追加。 通過改變多肽/蛋白質(zhì)的量、組合物的劑量及投藥頻率，免疫方案可經(jīng)最佳化以便引發(fā)最
7大免疫反應(yīng)。在大規(guī)模投藥之前，需要進行功效測試。在功效測試中，可經(jīng)由口服或非經(jīng)腸途徑投予非人類個體(例如小鼠、大鼠、兔、馬、豬、?；蚝?本發(fā)明的組合物。在初次投藥后或在視需要追加投藥后，可用病毒對測試個體與對照個體(接受模擬投藥)進行攻毒以測試組合物的功效。本發(fā)明的特征亦在于選擇性結(jié)合于具有一種上述序列的肽的經(jīng)分離的抗體。特征亦在于產(chǎn)生抗體的方法，該方法通過用在動物體內(nèi)引發(fā)免疫反應(yīng)的上述免疫原性組合物免疫動物以產(chǎn)生抗體；及自動物分離抗體或產(chǎn)生該抗體的細胞來達成。以下特定實例應(yīng)視為僅用于說明，而非以任何方式限制本揭示案的其余部分。在未進一步詳述下，相信熟習此項技術(shù)者可基于本文中的描述最大程度地利用本發(fā)明。本文中引用的所有公開案均以全文引用的方式并入本文中。此外，下文提出的任何機制均不以任何方式限制所主張的本發(fā)明的范圍。材料及方法1.細胞、培養(yǎng)基及病毒Vero細胞(綠猴腎細胞)自美國菌種保存中心(American Type Culture Collection, ATCC)獲得。Vero細胞以VP-SFM培養(yǎng)基(GIBCO)培養(yǎng)于組織培養(yǎng)瓶(T-flask) 中每周繼代兩次。EV71病毒株EV71-E59自臺灣臺北之疾病控制中心(Center of Disease Control, Taipei, Taiwan)獲得。在感染后第3天(第3 DPI)，自受感染Vero細胞的培養(yǎng)基收集EV71-E59病毒原液(EV71-E59viral stock)。病毒原液儲存于_80°C下。2.在旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶中產(chǎn)生EV71-E59病毒原液于旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，使Vero細胞在含200mL VP-SFM培養(yǎng)基(37°C下，在滾筒架(roller rack)中以0. 33rpm的速率攪拌)的850cm2旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶(CORNING)中繼代。 旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶培養(yǎng)的接種細胞密度為約1. 5-2X IO7個細胞，且在培養(yǎng)6天后細胞密度達到 1. 5-2\108個細胞。在100%培養(yǎng)基置換之后工￥71159病毒以10_5的MOI感染Vero細胞。 在此研究中，測試兩百或四百毫升工作體積的培養(yǎng)基。在第5 DPI自培養(yǎng)基收集EV71-E59 病毒原液。3.在生物反應(yīng)器中產(chǎn)生EV71-E59病毒原液根據(jù)mi等人，2004 Vaccine 22 (四_30) :3858-64中所述的微載體細胞培養(yǎng)方法進行EV71-E59病毒制備。在微載體培養(yǎng)方法中使用BI0FL0 310生物反應(yīng)器(NBS，US)。在60rpm速率下在 PH 7下攪拌生物反應(yīng)器培養(yǎng)物(1.4L及5L工作體積)，且通過氣體混合裝置將溶解氧(DO) 含量控制在50%。首先自上述旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶收集生物反應(yīng)器中所用的Vero細胞。遵照制造商的說明書制備Cytodex 1微載體(GE)。在設(shè)立各實驗前先將Cytodex 1微載體浸于磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中三小時以上且高壓滅菌處理15分鐘。以VP-SFM培養(yǎng)基洗滌經(jīng)高壓滅菌處理的微載體兩次。生物反應(yīng)器培養(yǎng)物中的接種細胞密度約為2X IO5個細胞/毫升。 在第3天，70 %培養(yǎng)基經(jīng)新鮮培養(yǎng)基置換，且在第6天，細胞密度達到2-2. 5 X IO6個細胞/ 毫升。在置換70%培養(yǎng)基之后，用EV71-E59病毒以10_5的MOI感染Vero細胞。在一實例中，在第6 DPI自微載體培養(yǎng)基收集EV71-E59病毒。在另一實例中，使用半批次培養(yǎng)法藉由在第6、第8、第10及第12 DPI每兩天置換70%培養(yǎng)基來收集病毒。在又一實例中，使用灌注培養(yǎng)法通過在第6至第13 DPI每天置換50-70%培養(yǎng)基來收集病毒。
4.通過液相層析純化EV71-E59病毒原液以上述方式收集EV71-E59病毒原液后，通過0. 65μπι過濾器(SARTORQ移除Vero 細胞碎片，且使用IOOK TFF卡匣(PALL)濃縮及透濾病毒原液。將濃縮病毒原液裝載至 Sepharose Fast Flow 6 凝膠管柱以便使用 FPLC 系統(tǒng)、AKTA pilot (GE HEALTHCARE)進行液相層析。S^hacryl S-500凝膠管柱亦用于進行純化方法。對此法所得分離液區(qū)段以 MAB979 抗體(MILLIP0RE)進行 SDS-PAGE 及 Western 印跡分析(Western analyses)來檢測 EV71病毒。使用IOOK TFF卡匣(PALL)濃縮經(jīng)純化的EV71-E59病毒原液且再懸浮于PBS 中。使用BCA蛋白質(zhì)檢定組(PIERCE)測定再懸浮病毒原液的總蛋白質(zhì)濃度。5.通過連續(xù)蔗糖梯度超速離心來純化EV71-E59病毒原液以上述方式收集 EV71-E59病毒原液后，通過0. 65 μ m過濾器(SARTORS)移除Vero細胞碎片，且使用IOOK TFF卡匣(PALL)濃縮EV71-E59病毒原液。將濃縮的病毒原液裝載至10-50 %連續(xù)蔗糖梯度以便在32，000RPM下超速離心3小時。對這些所得分離液區(qū)段使用MAB979抗體 (MILLIP0RE)進行 SDS-PAGE 及 Western 印跡分析(Western analyses)以檢測經(jīng)純化的 EV71病毒。使用Amicon 100K管(MILLIP0RE)通過在3，000Xg下離心來透濾經(jīng)純化的 EV71-E59病毒原液。將濃縮原液再懸浮于PBS中。使用BCA蛋白質(zhì)檢定組(PIERCE)測定再懸浮病毒原液的總蛋白質(zhì)濃度。6.測定病毒效價據(jù)組織培養(yǎng)物感染劑量的50%細胞感染力價(TCID5tl)測定病毒效價。將連續(xù)稀釋的病毒樣品( ο—1至10_8)添加至已長滿Vero細胞的96孔盤中，且各稀釋度以10重復(fù)試驗之。在37°C下培育96孔盤六天，且通過計數(shù)受感染Vero細胞的細胞病變效應(yīng)來獲得 TCID50 值。使用 Reed-Muench 法計算 TCID5tl 值。7.制備失活EV71-E59病毒及動物免疫將EV71-E59病毒原液與37%甲醛溶液(MERCK)以4000 1比率的體積比混合， 且在37°C下培育3天以使EV71-E59病毒失活。在免疫之前，使失活病毒原液在室溫下以磷酸鋁吸附3小時。以0. 2mL經(jīng)磷酸鋁吸附的失活EV71-E59病毒原液以肌肉內(nèi)注射法(i. m) 免疫一組6只雌性BALB/c小鼠(18-25g，出生6_8周)，且將相同劑量于首次免疫后兩周再對小鼠進行強化免疫。另免疫兩只紐西蘭白兔(New Zealand whiter abbit)，且在2至3 周后用0. 5mL經(jīng)磷酸鋁吸附的失活EV71-E59病毒原液進行肌肉內(nèi)注射強化免疫。同樣地， 一恒河猴亦以肌肉免疫，且在1個月后用0. 5mL經(jīng)磷酸鋁吸附的失活EV71-E59病毒原液進行肌肉內(nèi)注射強化免疫。在強化免疫一周之后對免疫的動物進行采血，且收集血清以便分析病毒中和能力。8.通過穿透式電子顯微鏡(TEM)檢測EV71-E59病毒粒子將失活的EV71-E59病毒原液滴于涂布福爾瓦膜(formvar)且經(jīng)碳蒸(carbon-vaporized)的200網(wǎng)目銅網(wǎng)上。在室溫下將樣品(20 μ L)滴在銅網(wǎng)上保持15分鐘，且接著以一片濾紙移除過量樣品。以ddH20 洗滌一次后，以2%鎢磷酸溶液對銅網(wǎng)進行染色2分鐘且隨后以一片濾紙移除溶液。染色的銅網(wǎng)經(jīng)干燥3天以上。在Hitachi H-7650電子顯微鏡下觀察銅網(wǎng)。9.抗EV71-E59血清的中和試驗在56°C下使自免疫小鼠收集的血清失活30分鐘。將各血清樣品添加至微管中且使用新鮮VP-SFM培養(yǎng)基以兩倍連續(xù)稀釋度稀釋。將4001^體積含20(^ CID50EV71-E59病毒的懸浮液添加至含有400 μ L連續(xù)稀釋血清的各管中。在4°C下培育18- 小時后，將 100 μ L連續(xù)稀釋樣品添加至含Vero細胞的96孔盤中。在37°C下培育96孔盤中的培養(yǎng)物七天，且通過計數(shù)受感染Vero細胞的細胞病變效應(yīng)來獲得TCID5tl值。使用Reed-Muench法獲得50%中和抑制劑量(ID5tl)，其為使病毒效價減小50%的血清稀釋度的幾何倒數(shù)。10.合成肽的設(shè)計及合成EV 71病毒株TW/2086/98VPl、VP2及VP3衣殼蛋白的重疊合成肽在科羅耐國際科技公司(Kelowna International Scientific Inc.，臺北縣，臺灣)合成，包括涵蓋VPl衣殼蛋白的完整序列的一組57種重疊合成肽、涵蓋VP2衣殼蛋白之完整序列的一組49種重疊合成肽，及涵蓋VP3衣殼蛋白之完整序列的一組47種重疊合成肽。各肽含有15個氨基酸殘基，其中10個殘基與相鄰肽重疊。11.通過ELISA檢測抗體通過酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測量抗體對各合成肽的親和力。在4°C下以50 μ L 在涂布緩沖液(0. IM NaHCO3, pH = 9. 5)中稀釋至10 μ g/mL的個別合成肽或經(jīng)純化的病毒涂布96孔盤(COSTAR)的各孔過夜。以0. 5微克/孔失活EV71-E59病毒原液用作陽性對照組。各合成肽或純化病毒有二重復(fù)孔。以IXPBST(含有0.05% Tween 20的磷酸鹽緩沖鹽水)洗滌一次后，以200 μ L阻斷緩沖液(5%脫脂奶的PB S溶液)阻斷各孔且在室溫下培育2小時。將以1 200稀釋于BSA/PBS中的一抗添加至各孔(每孔100 μ L)中且培育2小時。在移除一抗溶液之后，以IXPBST洗滌各孔六次。向經(jīng)洗滌的各孔中添加 100μ L 以 1 5000 稀釋于 BSA/PBS 中的辣根過氧化酶(Horseradish Peroxidase)標記的二抗，且培育2小時。在移除二抗溶液之后，以IXPBST洗滌各孔六次。通過添加TMB 底物溶液(KPL)使反應(yīng)顯色且在室溫下培育15分鐘。通過添WKSO4(IN)來停止反應(yīng)且通過ELISA讀取器在450nm下量測吸光度。12.序列比對及結(jié)構(gòu)同源性預(yù)測所有相關(guān) EV71 病毒株均自 NCBI PubMed 網(wǎng)站(www. ncbi. nlm. nih. gov/pubmed) 搜尋。使用稱為 ClustalW2 的計算機軟件(www. ebi. ac. uk/Tools/clustalw2/index. html) 對EV71VP2蛋白的基因組序列進行比對。結(jié)果1.在旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶中產(chǎn)生EV71-E59病毒原液Vero細胞在37°C下于含200mL VP-SFM培養(yǎng)基的850cm2旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。當細胞密度達到1. 5-2 X IO8個細胞時，置換培養(yǎng)基且用EV71-E59病毒以10_5的MOI感染Vero 細胞。如圖1中所示，病毒效價在第3DPI達到2-4. 5X IO6T CID50/mL且病毒效價維持穩(wěn)定產(chǎn)量。當使用200mL或400mL培養(yǎng)基時，EV71-E59病毒的生成動力學為類似。2.在生物反應(yīng)器中產(chǎn)生EV71-E59病毒原液使用VP-SFM培養(yǎng)基中的微載體細胞培養(yǎng)來產(chǎn)生EV71-E59病毒原液。在37°C下， 在批次、半批次或灌注生物反應(yīng)器中，使Vero細胞于載體濃度為5g/L的Cytodex微載體上生長。當細胞密度達到2-2. 5 X IO6個細胞/毫升時，用新鮮VP-SFM培養(yǎng)基置換70%培養(yǎng)基，且在生物反應(yīng)器中在32°C下用EV71-E59病毒以10_5的MOI感染Vero細胞。發(fā)現(xiàn)在 1.4L批次生物反應(yīng)器培養(yǎng)物中最大病毒效價為在第6 DPI達到2. 7X IO5 TCID5(1/mL。病毒效價在1. 4L半批次生物反應(yīng)器培養(yǎng)物中在第6至第12 DPI在0. 8至7X IO6 TCID50/mL的范圍內(nèi)。病毒效價在1.4L灌注生物反應(yīng)器培養(yǎng)物中在第6至第12DPI在0.5至2X106 TCID5Q/mL的范圍內(nèi)(圖2)。在5L批次生物反應(yīng)器培養(yǎng)物中最大病毒效價為在第6DPI達到1 X IO6 TCID50/mLo病毒效價在5L半批次生物反應(yīng)器培養(yǎng)物中在第6至第12 DPI在0. 7 至13 X IO6 TCID5Q/mL的范圍內(nèi)。病毒效價在5L灌注生物反應(yīng)器培養(yǎng)物中在第7至第13DPI 在1至2X107 TCID5Q/mL的范圍內(nèi)(圖3)。與批次培養(yǎng)法相比，半批次及灌注培養(yǎng)法可將收集產(chǎn)率提高3-5倍。3.通過液相層析純化EV71-E59病毒原液將濃縮的EV71-E59病毒原液QOmL)裝載至kpharose Fast Flow 6凝膠管柱或kphacryl S-500,且進行液相層析?；赹festern印跡分析，EV71-E59病毒主要收集于分離液區(qū)段3及4中(圖4A及4B)?；蛘撸瑢饪s的病毒原液(20mL)裝載至kphacryl S-500凝膠管柱。EV71-E59病毒的主要分離液區(qū)段見于分離液區(qū)段7及8中(圖4C)。濃縮匯集的分離液區(qū)段。透濾經(jīng)純化的病毒原液且以PBS再懸浮。4.通過連續(xù)蔗糖梯度超速離心來純化EV71-E59病毒原液將濃縮的EV71-E59病毒原液裝載至10-50%連續(xù)蔗糖梯度以便在32，000RPM下超速離心3小時。當自培養(yǎng)基分離EV71-E59病毒時，通過Wfestern印跡分析檢測到兩種EV71-E59病毒粒子(圖5)。在具有25至蔗糖的分離液區(qū)段中檢測到EV71-E59次粒子，而在具有35至38%蔗糖的分離液區(qū)段中檢測到EV71-E59全粒子。EV71-E59全粒子比EV71-E59次粒子更具感染性。分別透濾此兩種EV71-E59病毒粒子且以PBS再懸浮。5. EV71病毒粒子的特征通過組合純化與液相層析及蔗糖梯度超速離心來獲得超純EV71-E59病毒原液。將樣品裝載于10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠上且用考馬斯藍(Coomassie Blue)染色。 EV71-E59次粒子與全粒子顯示不同蛋白質(zhì)圖譜(圖6)。EV71-E59病毒抗原的預(yù)測分子量及觀測分子量列于表1A-1C中。表1A.完全切割的病毒抗原
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)生經(jīng)純化的EV71病毒抗原的方法，其包含在培養(yǎng)基中培養(yǎng)產(chǎn)生EV71病毒的細胞，自該細胞或該培養(yǎng)基純化EV71病毒，及使該經(jīng)純化的EV71病毒失活以獲得該經(jīng)純化的EV71病毒抗原。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中該培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)基。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中該純化步驟通過液相層析純化、蔗糖梯度超速離心純化或兩者之組合來進行。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中該失活步驟通過在含有甲醛的溶液中在20-45°C下培育該EV71病毒2至20天來進行。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中該失活步驟通過在該含有甲醛的溶液中在20-40°C 下培育該EV71病毒2至10天來進行。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中該失活步驟通過在該含有甲醛的溶液中在約37°C下培育該EV71病毒2至5天來進行。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中該培養(yǎng)步驟是在旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶或微載體生物反應(yīng)器中進行。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中該方法進一步包含測定該經(jīng)純化的EV71病毒抗原的量的步驟。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中該測定該經(jīng)純化的EV71病毒抗原的量的步驟是通過定量ELISA進行。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其中該EV71病毒抗原為EV71病毒全粒子、EV71病毒次粒子或EV71病毒蛋白。
11.一種免疫原性組合物，其包含經(jīng)純化的EV71病毒抗原，其中該EV71病毒抗原為經(jīng)分離的EV71病毒全粒子、經(jīng)分離的EV71病毒次粒子、經(jīng)分離的第一 EV71病毒多肽，其包括EV71 VPl蛋白的片段，該EV71 VPl蛋白包含選自由 SEQ ID NO :5-7、11-14、16、20-24、39-41 及 44-46 組成的群的序列；及經(jīng)分離的第二 EV71病毒多肽，其包括EV71 VP2或VP3蛋白的片段。
12.如權(quán)利要求11所述的免疫原性組合物，其中該免疫原性組合物進一步包含醫(yī)藥學上可接受的佐劑。
13.如權(quán)利要求11所述的免疫原性組合物，其中該佐劑含有磷酸鋁。
14.如權(quán)利要求11所述的免疫原性組合物，其中該第一EV71病毒多肽或該第二 EV71 病毒多肽為至少15個氨基酸殘基長。
15.如權(quán)利要求11所述的免疫原性組合物，其中該第二EV71病毒多肽包含選自由SEQ ID NO :1-4、8-10、25-29、31-32、34-35、38、42 及 43 組成的群的序列。
16.如權(quán)利要求15所述的免疫原性組合物，其中該第二EV71病毒多肽由選自由以下組成的群的序列組成SEQ ID NO :1-4、8-10、25-29、31-32、；34-35、38、42 及 43。
17.如權(quán)利要求15所述的免疫原性組合物，其中該免疫原性組合物進一步包含醫(yī)藥學上可接受的佐劑。
18.如權(quán)利要求15所述的免疫原性組合物，其中該佐劑含有磷酸鋁。
19.如權(quán)利要求11所述的免疫原性組合物，其中該第一EV71病毒多肽由選自由以下組成的群的序列組成SEQ ID NO :5-7、11-14、16、20-24、39-41 及 44-46。
20.一種誘導對腸病毒感染之免疫反應(yīng)的方法，其包含投予有需要的個體有效量的如權(quán)利要求11的免疫原性組合物。
全文摘要
本發(fā)明有關(guān)免疫原性組合物及其用途。特別是，本發(fā)明揭示制備經(jīng)純化的EV71病毒抗原的方法，亦揭示相關(guān)的免疫原性組合物及免疫方法。
文檔編號A61K39/125GK102399757SQ201110242398
公開日2012年4月4日 申請日期2011年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月17日
發(fā)明者再成·莊, 劉家齊, 張瑞原, 郭孟欣 申請人:財團法人衛(wèi)生研究院