專利名稱：一種用于預(yù)防和治療神經(jīng)損傷或其相關(guān)疾病的藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于預(yù)防和/或治療神經(jīng)損傷或其相關(guān)疾病的藥物，具體涉及脂 肪來(lái)源的成體干細(xì)胞分泌的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子混合物或脂肪來(lái)源的成體干細(xì)胞體外培養(yǎng)物在 制備預(yù)防和/或治療神經(jīng)損傷或其相關(guān)疾病的藥物中的用途。
背景技術(shù)：
脂肪來(lái)源的成體干細(xì)胞(ASC)是由脂肪組織提取的間充質(zhì)干細(xì)胞，其提供了 豐富的、容易獲得的且可補(bǔ)充的用于潛在臨床應(yīng)用的原料。這些多能細(xì)胞存在于脂肪 組織的“基質(zhì)”或“非脂肪細(xì)胞”部分，以前被認(rèn)為是“前脂肪細(xì)胞”。由于它們具有分化 成脂肪細(xì)胞的能力，ASC已經(jīng)被作為潛在的軟組織替代物研究了幾十年(Dardick，I.， et al. ， Ultrastructuralobservations on differentiating human preadipocytes cultured in vitro. TissueCel1，1976. 8 (3) :561-71 ；Rieck，B. and S. Schlaak，In vivo tracking of ratpreadipocytes after autologous transplantation. Ann Plast Surg,2003. 51 (3) :294_300 ；Kimura，Y.，et al.，Adipose tissue engineering based on humanpreadipocytes combined with gelatin microspheres containing basic fibroblastgrowth factor. Biomaterials, 2003. 24 (14) :2513_21)。近來(lái)的證據(jù)顯示 ASC具有相當(dāng)廣泛的分化潛能，并且現(xiàn)在被認(rèn)為是骨髓基質(zhì)細(xì)胞的替代物(Gimble，J. md F.Guilak, Adipose-derived adult stem cells :isolation， characterization, and differentiation potential. Cytotherapy, 2003. 5(5) :362_9 ；Gronthos，S.，et al.， Surface protein characterization of human adiposetissue-derived stromal cells. J Cell Physiol，2001. 189(1) :54_63)。例如，在種系特異性誘導(dǎo)因子存在下，人體皮下 ASC 會(huì)邑夠分化為成骨細(xì)胞(Dragoo, J. L.，et al.，Bone induction by BMP—2 transduced stem cells derived fromhuman fat. J Orthop Res, 2003. 21 (4) :622_9·)，心肌細(xì)胞 (Rangappa, S. ， et al. ， Transformation of adult mesenchymal stem cells isolated from the fatty tissueinto cardiomyocytes. Ann Thorac Surg,2003.75(3) :775_9 ； Planat—Benard，V. ，et al. ，Spontaneous cardiomyocyte differentiation from adipose tissue stromacells. Circ Res, 2004. 94(2) :223_9)和內(nèi)皮細(xì)胞(Planat-Benard，V.， et al. ， Plasticity of human adipose lineage cells toward endothelial cells physiological and therapeutic perspectives. Circulation，2004. 109(5) :656_63)。當(dāng) 移植到免疫缺陷小鼠中時(shí)，這些人體的ASC還能分化成軟骨細(xì)胞(EricksomG.R.，et al.， Chondrogenic potential of adipose tissue-derivedstromal cells in vitro and in vivo. Biochem Biophys Res Commun,2002. 290(2) :763_9)。最近證實(shí)了 ASC具有分化成其它種系之外的細(xì)胞的能力，其在體內(nèi)和體外可特 異性地分化成神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(Zuk, P. Α.，et al.，Human AdiposeTissue Is a Source of Multipotent Stem Cells. Mol. Biol. Cell,2002. 13(12) :4279_4295. ；Guilak，F(xiàn).，et al. ， Clonal analysis of the differentiation potential ofhuman adipose-derived
3adult stem cells. J Cell Physiol,2006.206 (1) 229-37 ；Fujimura，J.，et al.， Neural differentiation of adipose-derived stem cells isolatedfrom GFP transgenic mice. Biochem Biophys Res Commun, 2005. 333 (1) :116_21 ；Kokai，LE.， J. P. Rubin, and K. G Marra, The potential of adipose-derivedadult stem cells as a source of neuronal progenitor cells. Plast Reconstr Surg,2005. 116 (5) 1453-60)。來(lái)源于小鼠、大鼠或人的ASC經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)后可表達(dá)呈現(xiàn)神經(jīng)元的特異性標(biāo)記， 如 NeuN、巢蛋白禾口 tau 蛋白(Safford, K. M. ， etal. ，Neurogenic differentiation of murine and human adipose-derived stromalcells. Biochem Biophys Res Commun, 2002.294 (2) :371_9 ；Safford, K. Μ. , et al. , Characterization of neuronal/glial differentiation of murine adipose-derivedadult stromal cells.Exp Neurol, 2004. 187 (2) 319-28 ；Tholpady, S. S.，A. J. Katz, and R. C. Ogle, Mesenchymal stem cells from rat visceral fat exhibitmultipotential differentiation in vitro. Anat Rec A Discov Mol Cell Evol Biol, 2003. 272(1) 398-402 ；Yang, L. Y. , et al., Adipose tissue-derived stromal cellsexpress neuronal phenotypes. Chin Med J (Engl),2004. 117(3) :425_9 ；Zuk, P. A. , et al. , Human Adipose Tissue Is a Source of Multipotent Stem Cells. Mol. Biol. Cell,2002. 13(12) 4279-4295 ；Ashjian, P. H., et al. ， In vitro differentiation ofhuman processed lipoaspirate cells into early neural progenitors. Plast ReconstrSurg,2003. Ill(6) : 1922-31 ；Kang, S. K. , et al. ， Improvement of neurologicaldeficits by intracerebral transplantation of human adipose tissue-derived stromalcells after cerebral ischemia in rats. Exp Neurol, 2003. 183(2) :355_66)。當(dāng)暴露于神經(jīng)元誘導(dǎo)介質(zhì)時(shí)，小鼠ASC被誘導(dǎo)表達(dá)電壓依 賴性鈣通道以及低水平的巢蛋白和突觸蛋白I (Safford, K.M.，et al.，Characterization ofneuronal/glial differentiation of murine adipose-derived adult stromal cells. ExpNeurol, 2004. 187(2) :319_28)。但這些都只是表達(dá)了已分化的神經(jīng)元中的選擇 性蛋白神經(jīng)元標(biāo)記，并沒(méi)有顯示出任何神經(jīng)元的功能。 產(chǎn)前和圍產(chǎn)期期間的缺氧缺血性(HI)腦病是胎兒和新生兒常見(jiàn)的腦損傷，是 導(dǎo)致胎兒與新生兒發(fā)病與死亡的主要原因(Wei, X.，et al.，Caffeicacid phenethyl ester prevents neonatal hypoxic-ischaemic brain injury. Brain,2004. 127 (Pt 12) :2629-35)。目前還沒(méi)有避免人類新生兒HI后果的有效療法。已知缺氧-缺 血誘發(fā)新生大鼠腦室下區(qū)中的祖細(xì)胞增殖，這些祖細(xì)胞具有在體外分化成神經(jīng)元或 少突膠質(zhì)細(xì)胞的會(huì)邑力(Yang, Ζ. and S. W. Levison, Hypoxia/ischemia expands the regenerative capacity of progenitors in theperinatal subventricular zone. Neuroscience，2006. 139(2) :555_64)。兩種細(xì)胞群都對(duì)圍產(chǎn)期的缺氧-缺血損傷高度敏 感(McQuilien, P.S.，et al.，Selectivevulnerability of subplate neurons after early neonatal hypoxia-ischemia. JNeurosci, 2003. 23(8) :3308_15 ；Nakajima，W.， et al. ， Apoptosis has a prolongedrole in the neurodegeneration after hypoxic ischemia in the newborn rat. TheJournal of Neuroscience, 2000. 20 :7994_8004 ； Ness, J. K.，et al.，Perinatalhypoxia-ischemia induces apoptotic and excitotoxic death of periventricularwhite matter oligodendrocyte progenitors.Dev
4Neurosci,2001. 23(3) :203_8 ；Back, S. A. , et al. , Selective vulnerability of late oligodendrocyte progenitors tohypoxia-ischemia. J Neurosci,2002. 22(2) :455_63)。 進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，由神經(jīng)損傷誘發(fā)的這種內(nèi)源性祖細(xì)胞的增殖與分化可以進(jìn)一步被某些神 經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子刺激，但是單獨(dú)使用其中任何一種因子需要高濃度且效果不佳，往往還會(huì)引起 不良反應(yīng)，特別是在使用載體情況下。因此，還需要進(jìn)一步優(yōu)化和提高神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子預(yù)防和 /或治療神經(jīng)損傷的療效，這具有顯著的意義。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的是提供一種能夠更有效地預(yù)防和/或治療神經(jīng)損傷或其相關(guān) 疾病的藥物。用于實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下脂肪來(lái)源的成體干細(xì)胞分泌的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子混合物在制備預(yù)防和/或治療神經(jīng) 損傷或其相關(guān)疾病的藥物中的用途。具體地，在上述用途中，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子混合物可以包含肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子 (hepatocyte growth factor, HGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascularendothelium growth factor, VEGF)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(neuronal growth factor, NGF)和胰島素樣生長(zhǎng)因子 I (insulin-like growth factor，IGF-I)。優(yōu)選地，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子混合物還包含腦源神經(jīng)營(yíng) 養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophicfactor, BDNF)和/或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子 (glial cell derivedneurotrophic factor, GDNF)。在上述用途中，神經(jīng)損傷或其相關(guān)疾病可以選自缺氧缺血性腦病，例如產(chǎn)前缺氧 缺血性腦病或圍產(chǎn)期缺氧缺血性腦病；缺血性心臟?。恍穆墒С?；老年性癡呆；腦中風(fēng)；帕 金森病；肌萎縮性側(cè)索硬化；創(chuàng)傷性腦損傷；脊髓外傷性損傷；亨廷頓氏病(Huntington’ s disease)；新生兒黃疸；癲癇以及癡呆中的一種或多種。本發(fā)明還提供了脂肪來(lái)源的成體干細(xì)胞體外培養(yǎng)物在制備預(yù)防和/或治療神經(jīng) 損傷或其相關(guān)疾病的藥物中的用途，該體外培養(yǎng)物包含脂肪來(lái)源的成體干細(xì)胞分泌的神經(jīng) 營(yíng)養(yǎng)因子混合物。具體地，在上述用途中，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子混合物可以包含肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子 (hepatocyte growth factor, HGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascularendothelium growth factor, VEGF)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(neuronal growth factor, NGF)和胰島素樣生長(zhǎng)因子 I (insulin-like growth factor，IGF-I)。優(yōu)選地，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子混合物還包含腦源神經(jīng)營(yíng) 養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophicfactor, BDNF)和/或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子 (glial cell derivedneurotrophic factor, GDNF)。在上述用途中，神經(jīng)損傷或其相關(guān)疾病可以選自缺氧缺血性腦病，例如產(chǎn)前缺氧 缺血性腦病或圍產(chǎn)期缺氧缺血性腦??；缺血性心臟病；心律失常；老年性癡呆；腦中風(fēng)；帕 金森??；肌萎縮性側(cè)索硬化；創(chuàng)傷性腦損傷；脊髓外傷性損傷；亨廷頓氏病(Huntington’ s disease)；新生兒黃疸；癲癇以及癡呆中的一種或多種。在上述用途中，優(yōu)選地，脂肪來(lái)源的成體干細(xì)胞體外培養(yǎng)物為脂肪來(lái)源的成體干 細(xì)胞在37°C、5% (體積/體積)CO2的條件下在微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基中的培養(yǎng)物。更優(yōu) 選地，脂肪來(lái)源的成體干細(xì)胞體外培養(yǎng)物的培養(yǎng)方法包括以下步驟
(1)將脂肪組織消化后加入DMEM培養(yǎng)基，離心得到細(xì)胞，再加入DMEM培養(yǎng)基使之
懸?。?2)用100 μ m細(xì)胞篩過(guò)濾后離心，得到的細(xì)胞用紅細(xì)胞裂解液處理；(3)將處理的細(xì)胞懸浮于微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基中，在37°C、5% (體積/體積) CO2的條件下培養(yǎng)。本發(fā)明人在ASC的分泌物中，例如存在于ASC體外培養(yǎng)物(ASC-CM)的分泌物中首 次發(fā)現(xiàn)并識(shí)別了多種營(yíng)養(yǎng)因子，其中包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、 胰島素樣生長(zhǎng)因子I (IGF-I)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(⑶NF) 以及腦源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)。實(shí)驗(yàn)表明來(lái)源于脂肪來(lái)源的成體干細(xì)胞的肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子 (HGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子I (IGF-I)、神經(jīng) 膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)和腦源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)均能夠刺激內(nèi)源性干細(xì)胞分化 成神經(jīng)或其它功能性細(xì)胞，更重要的是這些細(xì)胞因子同時(shí)存在于分泌物中，彼此之間能夠 產(chǎn)生協(xié)同作用，使得所述活性作用大大加強(qiáng)，成功地刺激了內(nèi)源性神經(jīng)元的形成并顯示出 對(duì)動(dòng)物神經(jīng)功能的極大改善，還明顯降低了臨床用量，削減治療了成本，減少副作用。此外， 脂肪來(lái)源的成體干細(xì)胞分泌的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子混合物存在于該細(xì)胞體外培養(yǎng)物中，無(wú)需進(jìn)一 步的提取純化等加工步驟以及添加載體即可直接、有效地用于神經(jīng)損傷或其相關(guān)疾病，例 如缺氧缺血性腦病的預(yù)防和/或治療，彌補(bǔ)了目前神經(jīng)損傷或其相關(guān)疾病的預(yù)防和治療手 段匱乏的缺陷，同時(shí)降低了副作用和不良反應(yīng)也進(jìn)一步有利于降低藥物的生產(chǎn)成本和推廣 應(yīng)用。


以下，結(jié)合附圖來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方案，其中圖1 :ASC體外培養(yǎng)物(ASC-CM)對(duì)缺氧-缺血(H-I)腦損傷誘導(dǎo)神經(jīng)元再生的研 究。其中=Control 對(duì)照組；ASC-CM 用ASC-CM對(duì)未經(jīng)H-I處理的動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)治療組；H-I 經(jīng)過(guò)缺氧_缺血處理的動(dòng)物組；H-I+ASC-CM 用ASC-CM對(duì)經(jīng)過(guò)H-I處理的動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)治療 組。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，靜脈注射濃縮的ASC-CM (未采用H-I處理，術(shù)前20 μ 1，術(shù)后 20 μ 1)顯著刺激了內(nèi)源性神經(jīng)元的再生(56士8，η = 3vs. 16士4，η = 3廣ρ < 0.01)。此 外，與僅采用HI處理的組相比，ASC-CM預(yù)處理也明顯地刺激了缺氧-缺血腦損傷攻擊后的 海馬神經(jīng)元的再生(108 士43，η = 3vs. 53 士 17，η = 3)。圖2 =ASC-CM誘導(dǎo)PC-12細(xì)胞的神經(jīng)元分化作用以及AMPK抑制劑對(duì)ASC-CM誘導(dǎo) 分化的抑制作用。其中Control 對(duì)照組；ASC-CM 用ASC-CM處理的PC12細(xì)胞；ASC-CM+C ASC-CM、化合物C與PC12細(xì)胞共同培養(yǎng)組。結(jié)果顯示，與對(duì)照相比，ASC-CM(50%的培養(yǎng)基 替換為ASC-CM，連續(xù)培養(yǎng)7天)顯著地刺激了細(xì)胞分化(11% 士4，η = 17vsl% 士0. 5，η =4)。當(dāng)PC12細(xì)胞用AMPK抑制劑-化合物C(Calbiochem)預(yù)處理后，明顯抑制了 ASC-CM 誘導(dǎo)的神經(jīng)元分化(11% 士4，η = 17vs. 5. 5士2. 9，η = 3，**ρ < 0. 01)。圖3 :NGF(50ng/ml,5天處理)誘導(dǎo)AMPK介導(dǎo)的神經(jīng)元分化。圖3A 與對(duì)照相比， NGF 刺激內(nèi)源性神經(jīng)元分化(1% 士 1，η = 3vs. 27% 士 7，η = 3，**ρ < 0.01)。NGF 抗體 (Ab)和 AMPK α IsiRNA 的預(yù)處理明顯抑制 NGF 的作用(2. 9% 士 1. 9，8. 9士 1. 3vs. 27% 士7， **p < 0. 01)。此外，圖3B :NGF(50ng/ml,60分鐘)誘導(dǎo)AMPK磷酸化并且siRNA阻斷該效應(yīng)。圖4 =NGF, IGF-I、VEGF和HGF在神經(jīng)元分化的誘導(dǎo)中發(fā)揮重要作用。加入 NGF(NA)、IGF-I (IA)、VEGF(VA)和HGF(HA)抗體中和ASC-CM對(duì)神經(jīng)元分化的刺激活性。 抗NGF、IGF-I、VEGF和HGF的抗體能夠分別在一定程度上中和ASC-CM活性(ASC-CM對(duì)照 (hASC) 9. 1% ；抗 NGF 3. 5% ；抗 IGF-I 4.2% ；抗 NGF/IGF-1 3. 1% ；抗 VEGF 5. 5% ；抗 HGF 6. 3% ；抗 VEGF/HGF 4. 3% 抗 NGF/IGF-1/VEGF/HGF 2. 2%，未采用 ASC-CM(no-ASC) 1. 1%)，表明單純使用一種因子的抗體可部分阻斷ASC-CM的誘導(dǎo)神經(jīng)元分化的作用。如 果同時(shí)阻斷多種因子，如同時(shí)阻斷2至4個(gè)因子能夠更顯著地削弱ASC-CM的促神經(jīng)分化作 用，上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明這些生長(zhǎng)因子具有誘導(dǎo)神經(jīng)元分化的協(xié)同作用。圖5 :NGF和ASC-CM促進(jìn)PC12細(xì)胞分化作用的對(duì)比。圖5A 表示在PC12細(xì)胞 的BME培養(yǎng)基中，加入不同劑量(lng/ml、5ng/ml、20ng/ml、50ng/ml)的NGF后，生長(zhǎng)出神經(jīng) 突起的PC12細(xì)胞的百分比?！霰硎驹赑C12細(xì)胞的BME培養(yǎng)基中，加入不同劑量(lng/ml、 5ng/ml、20ng/ml、50ng/ml)的NGF以及NGF抗體(50ng/ml)后，生長(zhǎng)出神經(jīng)突起的PCl2細(xì) 胞的百分比。結(jié)果說(shuō)明，NGF具有顯著的促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞分化、成熟的作用。圖5B: 表示在 包含不同濃度(10%、30%、50%、100% )ASC-CM的BME培養(yǎng)基中培養(yǎng)的生長(zhǎng)出神經(jīng)突起的 PC 12細(xì)胞的百分比；·表示在包含不同濃度(10%、30%、50%、100%)六5(義11以及呢？抗 體(50ng/ml)的BME培養(yǎng)基中培養(yǎng)的生長(zhǎng)出神經(jīng)突起的PC12細(xì)胞的百分比。在本實(shí)驗(yàn)中， ASC-CM中的NGF的濃度為0. 68ng/ml。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)液用50%的ASC-CM液替換時(shí)，NGF的含 量為0. 34ng/ml。對(duì)比圖5A和5B可以發(fā)現(xiàn)，50%的ASC_CM(含0. 34ng/ml的NGF)的促進(jìn) 神經(jīng)細(xì)胞分化活性的效價(jià)相當(dāng)于單純應(yīng)用lOng/ml的NGF的效價(jià)，說(shuō)明ASC-CM中還存在其 它神經(jīng)生長(zhǎng)因子，而且多種神經(jīng)生長(zhǎng)與營(yíng)養(yǎng)因子的組合比單一神經(jīng)因子起到更強(qiáng)的作用， 具有顯著的差異。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡 明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。1.圍產(chǎn)期缺氧-缺血模型的制作在單獨(dú)的籠子中安置懷孕的Sprague Dawley大鼠(Charles River)并用實(shí)驗(yàn)室 標(biāo)準(zhǔn)飼料飼喂，自由進(jìn)食。采用7日齡的大鼠幼崽，手術(shù)誘發(fā)缺氧-缺血?jiǎng)游锬Ｐ?Wei，X.， et al. ， Caffeic acid phenethyl ester prevents neonatalhypoxic-ischaemic brain injury.Brain,2004. 127(Pt 12) :2629_35)。其實(shí)驗(yàn)過(guò)程為首先用氟烷(4%用于誘導(dǎo)，1-1. 5%用于維持)和30%氧氣的混合 氣體麻醉7天大的大鼠幼崽(體重為13-19克)。暴露每只動(dòng)物幼崽的左頸總動(dòng)脈，將其與 神經(jīng)和靜脈分離，并用3-0手術(shù)絲線結(jié)扎。縫合傷口并將大鼠幼崽送回至其母鼠，恢復(fù)3小 時(shí)。假手術(shù)動(dòng)物經(jīng)歷相同的操作過(guò)程，除了暴露的頸動(dòng)脈不被結(jié)扎(僅缺氧)外，其它過(guò)程 與手術(shù)組動(dòng)物相同。之后，將2-3只幼崽置于500ml密閉罐中，并暴露于濕潤(rùn)的氮氧氣混合 物(氧氣占8%)中，每分鐘輸送5至6升該氮氧氣混合物。在150分鐘缺氧期間，將密閉 罐部分浸沒(méi)在37°C水浴中以維持恒定的熱環(huán)境。在缺氧-缺血的第三天，每天腹膜內(nèi)注射 兩次Brdu (Sigma, 50mg/kg體重，其溶液濃度為10mg/ml，溶劑為0. 9% NaCl，其中NaCl溶液還含有0. 007N的NaOH)，標(biāo)記分裂細(xì)胞。隨后，缺氧后第7天收集腦組織，立即在干冰上冷 凍并在-70°C下保存直至進(jìn)行分析。2.免疫熒光檢測(cè)將腦組織固定并用蔗糖防凍保護(hù)。將腦組織切成40i!m厚的冰凍切片。采用 常規(guī)免疫熒光方法對(duì)切片染色。將切片在室溫下處理60分鐘(至DNA變性)，然后用 0. 1M的pH8. 5的硼酸鹽緩沖液中充分清洗，然后將切片與大鼠抗-Brdu抗體(Accurate Chemical, ffestbury, NY, 1 10)以及山羊抗 DCX 抗體(DCX-C00H 末端，1 100，Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz,CA) 一起孵育。同時(shí)采用小鼠單克隆抗神經(jīng)元細(xì)胞核抗 體(NeuN，Chemicon，CA1 50)將切片染色。4°C下在一抗中孵育過(guò)夜后，在室溫下用二抗 (Jacksonlmmunoresearch,West Grove,PA)處理切片 2 小時(shí)，采用 4，，6，-脈基-2-苯基吲 哚二鹽酸鹽(DAPI) (Sigma，將lmg/ml儲(chǔ)備液稀釋至0. 0005mg/ml)對(duì)細(xì)胞核復(fù)染15分鐘。3.細(xì)胞培養(yǎng)和試劑。在含有10%小牛血清(FBS)，100U/ml青霉素和100iig/ml鏈霉素的Dulbecco' s 改良Eagle' s培養(yǎng)基(DMEM)中培養(yǎng)大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞。對(duì)于在PC12細(xì)胞上進(jìn) 行的實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞以10X104/ml的密度種植于24孔板中。這些培養(yǎng)條件也用在涉及通過(guò) NGF-Ab (2 u g/ml)或化合物c (10 u M)減弱分化的實(shí)驗(yàn)中。第一次在種植后4小時(shí)加入，然 后每48小時(shí)加入一次。針對(duì)采用NGF延長(zhǎng)刺激來(lái)誘導(dǎo)神經(jīng)元分化，將細(xì)胞種植在多聚_右 旋賴氨酸包被的12孔板上，密度為10X104個(gè)細(xì)胞/ml。在含有1% 83(低密度/低血清 條件)的DMEM中培養(yǎng)細(xì)胞，并在NGF抗體(2 y g/ml)或化合物C (10 y M，Calbiochem)存在 下用NGF(50ng/ml)處理。第一次在種植后4小時(shí)加入，然后每48小時(shí)加入一次。NGF購(gòu)自 Sigma (St. Louis, M0, USA)，抗大鼠 3-NGF 抗體購(gòu)自 R&D System (Minneapolis, MN, USA), AMPK 抑制劑購(gòu)自 Calbiochem(San Diego, CA) 4. RNA 干擾針對(duì)AMPK a 1 的小干擾(si) RNA 序列為 5，-UUCCUUCGCACACGCAAAUAAUAGG-3，， 實(shí)驗(yàn)與對(duì)照組的siRNA均購(gòu)自Invitrogen公司。首先，將細(xì)胞接種于24孔板中，細(xì)胞濃 度為50X 104個(gè)細(xì)胞/孔。培養(yǎng)24小時(shí)后，在Opti-MEM (Invitrogen)中，在37°C下用 Lipofectamine2000 (Invitrogen)將siRNAs遞送到細(xì)胞中轉(zhuǎn)染。然后將NGF加到轉(zhuǎn)染的細(xì) 胞中培養(yǎng)48小時(shí)。最后將細(xì)胞固定，用于形態(tài)觀察或從壁上刮下來(lái)收集蛋白用于Western 印跡檢測(cè)。4.蛋白質(zhì)分析根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法，采用針對(duì)總AMPK、磷酸化的AMPK、磷酸化的ACC的抗體進(jìn)行 Western 印跡分析，這些抗體為 Cell Signaling Technology (Beverley,MA,USA)公司產(chǎn)品。 當(dāng)Thr172磷酸化時(shí)，用磷酸化的AMPK抗體檢測(cè)內(nèi)源性AMPK a 1和a 2。5.細(xì)胞分化分析如上所述，將PC12細(xì)胞種植于12孔板中培養(yǎng)，密度為10 X 104個(gè)細(xì)胞/孔，然后分 別用NGF、NGF+化合物C (10 y M)或NGF+NGF Ab處理培養(yǎng)的細(xì)胞。在加入NGF之前，用NGF Ab或化合物C試劑預(yù)處理PC 12細(xì)胞1小時(shí)，根據(jù)細(xì)胞形態(tài)確定PC12細(xì)胞的分化狀態(tài)。神 經(jīng)突被定義為等于或大于細(xì)胞體直徑的細(xì)胞體延伸。讀取視野中作為神經(jīng)元樣細(xì)胞的具有 至少一個(gè)神經(jīng)突的細(xì)胞的數(shù)量。
6.統(tǒng)計(jì)學(xué)比較數(shù)據(jù)以平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)來(lái)表示，采用SPSS 12. 0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行對(duì)比。 進(jìn)行配對(duì)Student' s t檢驗(yàn)，P值< 0. 05被認(rèn)為是顯著差異的。實(shí)施例1首先，將獲得的脂肪組織用lmg/ml的I型膠原酶在37°C的條件下消化1小時(shí)。然 后在消化液中加入50ml的DMEM培養(yǎng)基，以200g離心5分鐘。移去上清液，保留離心管底 部的細(xì)胞部分。將細(xì)胞重新懸浮于新鮮的DMEM培養(yǎng)基中，然后用lOOym細(xì)胞篩濾過(guò)細(xì)胞 懸液。將細(xì)胞懸液以200g離心5分鐘。移去上清，下部的細(xì)胞用紅細(xì)胞裂解液在37°C下 處理5分鐘。然后以300g離心5分鐘。將所獲得的細(xì)胞重新懸浮于微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng) 基中，然后以4X 106個(gè)/cm2的細(xì)胞濃度接種于未經(jīng)過(guò)包被處理的T75組織培養(yǎng)瓶中，在C02 孵育箱中培養(yǎng)(37°C，5% C02)。實(shí)施例2對(duì)ASC分泌的物質(zhì)刺激大鼠缺氧-缺血腦中的內(nèi)源性神經(jīng)形成的能力進(jìn)行了測(cè) 試。從大鼠皮下脂肪組織分離的ASC在EGM2MV培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至匯合，然后轉(zhuǎn)移至Eagle基 本培養(yǎng)基(包含5mM K+的BME，Invitrogen)中培養(yǎng)24小時(shí)(在C02孵育箱中培養(yǎng)，條件為 37°C,5%C02)o收集培養(yǎng)物(ASC-CM)，并采用CentriPluS(截留麗10k)濃縮50倍。將新 生(7天)大鼠進(jìn)行單側(cè)(左)頸動(dòng)脈結(jié)扎，然后暴露于缺氧條件(含氧氣7%)下2小時(shí)。 在缺氧_缺血(H-I)前1小時(shí)靜脈注射10 u 1濃縮(50倍)的ASC-CM。7天后，與僅進(jìn)行 H-I處理的動(dòng)物進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，ASC-CM預(yù)處理顯著地刺激了缺氧-缺血腦損傷引起 的海馬神經(jīng)元的形成(108士43，n = 3比53士 17，n = 3 ；參見(jiàn)圖1)。與對(duì)照組(未經(jīng)H-I 處理)的動(dòng)物相比，靜脈注射濃縮的ASC-CM也顯著地刺激了內(nèi)源性神經(jīng)元的形成(16士4， n = 3 比 56士8，n = 3 ；參見(jiàn)圖 1，**p < 0. 01)。實(shí)施例3為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)濃縮的ASC-CM如何在體內(nèi)刺激神經(jīng)形成，我們采用PC12細(xì)胞模 型，通過(guò)觀察ASC-CM對(duì)這些細(xì)胞中的神經(jīng)突觸生長(zhǎng)的影響來(lái)研究ASC-CM是否影響神經(jīng)元 的分化。數(shù)據(jù)顯示ASC-CM顯著地刺激了 PC-12細(xì)胞的神經(jīng)元分化(參見(jiàn)圖2)，而且顯示了 這種影響會(huì)被AMPK激酶的特異性抑制劑顯著地阻斷(參見(jiàn)圖3)，這表明AMPK在NGF誘導(dǎo) 的神經(jīng)元分化中發(fā)揮重要的作用。AMPK被包括缺氧、氧化應(yīng)激、糖剝奪以及運(yùn)動(dòng)和飲食激 素，如瘦素和脂肪細(xì)胞因子的多種病理性應(yīng)激所活化。AMPK活化在抗病理性應(yīng)激，特別是缺 血缺氧應(yīng)激中發(fā)揮保護(hù)性作用，能夠減小梗死的體積。在飲食限制的條件下，下丘腦神經(jīng)元 中的AMPK也被活化。最近還顯示在白藜蘆醇誘導(dǎo)的神經(jīng)元分化中，活化的AMPK起關(guān)鍵作 用。由于實(shí)驗(yàn)表明ASC-CM通過(guò)AMPK活化誘導(dǎo)神經(jīng)元分化，而且NGF是ASC-CM中可能 涉及PC-12分化的成分，所以需要研究涉及刺激PC-12分化的ASC-CM中的NGF是否起作用。 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí)ASC-CM以及其中的NGF能夠直接刺激PC-12分化，并且這種作用也特異地通 過(guò)AMPK活化(圖3)。實(shí)施例4我們進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析以檢驗(yàn)何種生長(zhǎng)因子在刺激神經(jīng)元分化中起到關(guān)鍵作用。采用 蛋白質(zhì)組學(xué)方法，我們鑒別了幾種ASC分泌物(ASC-CM)中的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，如源于神經(jīng)膠
9質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(⑶NF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)和胰島素樣 生長(zhǎng)因子I (IGF-1)等。結(jié)果顯示分別來(lái)自ASC-CM的NGF、IGF-1、VEGF和HGF等(它們已 經(jīng)在抗體分析研究中被鑒別)能夠在一定程度上刺激神經(jīng)元分化(參見(jiàn)圖4)，而且它們的 抗體能夠特異性抑制 ASC-CM 的活性(NGF 70% ；IGF-1 61% ；VEGF 45% ；HGF 35% )。如 果一同加入這些抗體，ASC-CM活性幾乎完全被抑制(NGF/IGF-1 75% ；VEGF/HGF :60%，總 抑制率86% )，表明這四種生長(zhǎng)因子在ASC-CM刺激活性中發(fā)揮重要作用。很明顯，它們作 用于不同的途徑并彼此協(xié)同作用，活性更為強(qiáng)大，因此將ASC-CM中的這4種因子組合在一 起，將具有對(duì)神經(jīng)元分化具有巨大的刺激作用，其他因子例如GDNF可能發(fā)揮余下的功能。 有趣的是，GDNF與IGF-1通過(guò)相同的途徑發(fā)揮作用，對(duì)抗兩種因子的兩種抗體的作用不累 加。實(shí)施例5NGF和ASC-CM促進(jìn)PC12細(xì)胞分化作用的比較(參見(jiàn)圖5)。在包含不同劑量(lng/ ml、5ng/ml、20ng/ml、50ng/ml)NGF的BME培養(yǎng)基中培養(yǎng)PC12細(xì)胞；在包含不同劑量(lng/ ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml)NGF 以及 NGF 抗體(50ng/ml)的 BME 培養(yǎng)基中培養(yǎng) PC 12細(xì)胞。在包含不同濃度(10%、30%、50%、100% )ASC-CM的BME培養(yǎng)基中培養(yǎng)PC12 細(xì)胞；在包含不同濃度(10 %、30%、50%、100%) ASC-CM以及NGF抗體(50ng/ml)的BME培 養(yǎng)基中培養(yǎng)PC 12細(xì)胞。其中，培養(yǎng)8天后，對(duì)長(zhǎng)出神經(jīng)突起的PC12細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。陽(yáng)性 細(xì)胞為長(zhǎng)出的神經(jīng)突起的長(zhǎng)度為細(xì)胞體長(zhǎng)度1. 5倍的細(xì)胞，每組總計(jì)包括500個(gè)細(xì)胞。結(jié) 果表明，加入lOng/ml的NGF所產(chǎn)生的促進(jìn)PC-12分化的效果水平與加入50%的ASC-CM的 效果水平相當(dāng)，而經(jīng)測(cè)定ASC-CM中的NGF濃度為0. 68ng/ml，加入50 %的ASC-CM的BME培 養(yǎng)基中的NGF濃度為0. 34ng/ml，進(jìn)一步證明NGF與ASC-CM中的其它神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子協(xié)同作 用，僅以很低的用量就可以獲得相同的作用效果。
權(quán)利要求
脂肪來(lái)源的成體干細(xì)胞分泌的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子混合物在制備預(yù)防和/或治療神經(jīng)損傷或其相關(guān)疾病的藥物中的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子混合物包含肝細(xì)胞生 長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、神經(jīng)生長(zhǎng)因子和胰島素樣生長(zhǎng)因子I。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子混合物還包括神經(jīng) 膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和/或腦源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的用途，其特征在于，所述神經(jīng)損傷或其相關(guān)疾 病選自缺氧缺血性腦病，例如產(chǎn)前缺氧缺血性腦病或圍產(chǎn)期缺氧缺血性腦??；缺血性心臟 ?。恍穆墒С?；老年性癡呆；腦中風(fēng)；帕金森病；肌萎縮性側(cè)索硬化；創(chuàng)傷性腦損傷；脊髓外 傷性損傷；亨廷頓氏病；新生兒黃疸；癲癇以及癡呆中的一種或多種。
5.脂肪來(lái)源的成體干細(xì)胞體外培養(yǎng)物在制備預(yù)防和/或治療神經(jīng)損傷或其相關(guān)疾病 的藥物中的用途，該體外培養(yǎng)物包含脂肪來(lái)源的成體干細(xì)胞分泌的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子混合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于，所述神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子混合物包含肝細(xì)胞生 長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、神經(jīng)生長(zhǎng)因子和胰島素樣生長(zhǎng)因子I。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的用途，其特征在于，所述神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子混合物還包括神經(jīng) 膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和/或腦源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。
8.根據(jù)權(quán)利要求5至7中任一項(xiàng)所述的用途，其特征在于，所述神經(jīng)損傷或其相關(guān)疾 病選自缺氧缺血性腦病，例如產(chǎn)前缺氧缺血性腦病或圍產(chǎn)期缺氧缺血性腦??；缺血性心臟 病；心律失常；老年性癡呆；腦中風(fēng)；帕金森??；肌萎縮性側(cè)索硬化；創(chuàng)傷性腦損傷；脊髓外 傷性損傷；亨廷頓氏?。恍律鷥狐S疸；癲癇以及癡呆中的一種或多種。
9.根據(jù)權(quán)利要求5至8中任一項(xiàng)所述的用途，其特征在于，所述脂肪來(lái)源的成體干細(xì)胞 體外培養(yǎng)物為脂肪來(lái)源的成體干細(xì)胞在37°C、5% (體積/體積)CO2的條件下在微血管內(nèi) 皮細(xì)胞培養(yǎng)基中的培養(yǎng)物。
10.根據(jù)權(quán)利要求5至9中任一項(xiàng)所述的用途，其特征在于，所述脂肪來(lái)源的成體干細(xì) 胞體外培養(yǎng)物的培養(yǎng)方法包括以下步驟(1)將脂肪組織消化后加入DMEM培養(yǎng)基，離心得到細(xì)胞，再加入DMEM培養(yǎng)基使之懸??；(2)用100μ m細(xì)胞篩過(guò)濾后離心，得到的細(xì)胞用紅細(xì)胞裂解液處理；(3)將處理的細(xì) 懸浮于微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基中，在37°C、5%(體積/體積)CO2的 條件下培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用于預(yù)防和治療神經(jīng)損傷或其相關(guān)疾病的藥物，具體涉及脂肪來(lái)源的成體干細(xì)胞分泌的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子混合物或脂肪來(lái)源的成體干細(xì)胞體外培養(yǎng)物在制備預(yù)防和/或治療神經(jīng)損傷或其相關(guān)疾病的藥物中的用途。這些神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子混合物存在于細(xì)胞體外培養(yǎng)物中，彼此之間能夠產(chǎn)生協(xié)同作用，使得活性作用大大加強(qiáng)，明顯降低臨床用量，降低治療成本，減少副作用，無(wú)需進(jìn)一步提取純化等加工步驟以及添加載體即可有效地用于神經(jīng)損傷或其相關(guān)疾病，例如缺氧缺血性腦病的預(yù)防和/或治療，彌補(bǔ)了目前神經(jīng)損傷或其相關(guān)疾病的預(yù)防和治療手段匱乏的缺陷，同時(shí)降低了副作用和不良反應(yīng)，進(jìn)一步有利于降低藥物的生產(chǎn)成本和推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61P9/10GK101940589SQ201010252600
公開(kāi)日2011年1月12日 申請(qǐng)日期2010年8月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月13日
發(fā)明者杜燕生 申請(qǐng)人:無(wú)錫市智昱生物科技有限公司