專利名稱：抗TNFα的人源化Fab和人源化抗體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗人腫瘤壞死因子α的人源化Fab和人源化抗體及其用途。
背景技術(shù)：
自身免疫性疫病的發(fā)生發(fā)展是一個由許多有活性的細(xì)胞因子調(diào)控失衡的復(fù)雜過程。在眾多因子中，TNFa被證實在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，但其過量表達(dá)被證實是導(dǎo)致自身免疫性等疾病主要因素之一。因此，抑制TNFa活性的生物藥成為治療該類疾病中最為成功的療法之一，已被批準(zhǔn)治療的適應(yīng)癥，主要包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Mieumatoid Arthritis)、克隆病(Crohn，s Disease)、斑片性銀屑病(Plaque Psoriasis)、銀屑病關(guān)節(jié)炎(Psoriatic Arthritis)、強(qiáng)直性脊柱炎(Ankylosing Spondylitis)、潰瘍性結(jié)腸炎 (Ulcerative Colitis)和幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎(Juvenile Idiopathic Arthritis)，同時還有許多其他相關(guān)疾病正在開展臨床試驗。歐美市場上已經(jīng)有針對TNF α的抗體藥物和類似抗體的Fc融合蛋自藥物，如 Remicade。Remicade在體內(nèi)的半衰期較短，大約為9天。此外，Remicade雖有良好的結(jié)合親和性、生物活性和臨床療效，但作為一個包含1/3鼠源序列和2/3人源序列的嵌合性抗體，約有10% -47%的患者在使用Remicade后發(fā)生了免疫反應(yīng)，通常產(chǎn)生人抗小鼠抗體 (HAMA)，影響該抗體的療效和長期應(yīng)用。因此，十分需要尋求一種人源化程度高的抗TNF α 抗體，最大程度減少其中鼠源序列比例，以降低鼠源性并能安全用于治療人體疾病。一種常見的抗體人源化方法是將鼠源抗體可變區(qū)(VH、VK)的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)部分移植到事先選擇的人抗體框架之中，所得抗體將具有大部分人源的序列，同時又能夠保留起始鼠源抗體對相同抗原的選擇性，但這個過程通常導(dǎo)致抗體親和力的損失。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供抗人腫瘤壞死因子α人源化抗原結(jié)合片段Fab或抗人腫瘤壞死因子α人源化抗體，該Fab或抗體與人腫瘤壞死因子α的親和力與人鼠嵌合抗體Remicade相似，甚至更高。本發(fā)明所提供的抗人腫瘤壞死因子α的人源化抗原結(jié)合片段Fab，含有重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)；所述Fab的氨基酸序列為下述al)-U)中任一種al)所述重鏈可變區(qū)的氨基酸序列為序列表中序列27的第1_120位或序列25的第1-120位，所述輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列為序列表中序列31的的第1-109位或序列四的第1-109位；a2)所述重鏈可變區(qū)的氨基酸序列為序列表中序列1或序列3，所述輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列為序列表中序列15、序列9、序列11、序列7、序列13和序列5中的任一種；其中序列1的第一位氨基酸殘基為Glu或Gin。所述Fab由重鏈片段(Fd)和輕鏈組成；所述重鏈片段(Fd)由Vh和CHl組成，所述輕鏈由Vk和輕鏈恒定區(qū)組成；所述CHl氨基酸序列與人抗體重鏈恒定區(qū)的CHl氨基酸序列相同，所述輕鏈恒定區(qū)氨基酸序列與人抗體輕鏈恒定區(qū)氨基酸序列相同。所述Fab的Fd片段的CHl可以是任意類型(IgG、IgA、IgM、IgE、IgD)或亞類(IgGl、 IgG2、IgG3、IgG4，IgMU IgM2，IgAU IgA2，)的人源恒定區(qū)的CHl ；所述Fab的輕鏈恒定區(qū)可為任意類型(κ型或λ型)、亞型(λ 1、λ 2、λ 3、λ 4)、或同種異性(Km(l)、Km(2), Km(3))輕鏈的人源恒定區(qū)。所述CHl氨基酸序列如序列表中序列33所示；所述輕鏈恒定區(qū)氨基酸序列如序列表中序列19所示。在本發(fā)明的具體實施例中，所述Fab為下述bl)_b3)中任一種bl)KS-7F 所述重鏈片段的氨基酸序列為序列表中序列27，且所述輕鏈的氨基酸序列為序列表中序列31 ；b2)KS-7A 所述重鏈片段的氨基酸序列為序列表中序列25，且所述輕鏈的氨基酸序列為序列表中序列31 ；b3)KS-2E 所述重鏈片段的氨基酸序列為序列表中序列25，且所述輕鏈的氨基酸序列為序列表中序列四。本發(fā)明的另一個目的是提供抗人腫瘤壞死因子α的人源化抗體，該抗體含有重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)；所述重鏈可變區(qū)由上述bl)所述Fab的重鏈可變區(qū)突變而來，所述輕鏈可變區(qū)由上述bl)所述Fab的輕鏈可變區(qū)突變而來；所述抗體的重鏈可變區(qū)氨基酸序列為序列表中序列1或序列3 ；所述抗體的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列為序列表中序列序列15、 序列9、序列11、序列7、序列13和序列5中的任一種；其中序列1的第一位氨基酸殘基為 Glu 或 Gin。所述抗體具體為下述a-Ι中的任一種a.KSlO，其重鏈可變區(qū)為SH01，氨基酸序列為序列1，輕鏈可變區(qū)為SH08，氨基酸序列為序列15 ；b.KS03，其重鏈可變區(qū)為SH01，氨基酸序列為序列1，輕鏈可變區(qū)為SH05，氨基酸序列為序列9 ；C.KS06，其重鏈可變區(qū)為SH01，氨基酸序列為序列1，輕鏈可變區(qū)為SH06，氨基酸序列為序列11 ；d. KS12，其重鏈可變區(qū)為SH02，氨基酸序列為序列3，輕鏈可變區(qū)為SH08，氨基酸序列為為序列15 ；e.KS04，其重鏈可變區(qū)為SH02，氨基酸序列為序列3，輕鏈可變區(qū)為SH05，氨基酸序列為序列9 ；f. KS07,其重鏈可變區(qū)為SH02，氨基酸序列為序列3，輕鏈可變區(qū)為SH06，氨基酸序列為序列11 ；g.KS02，其重鏈可變區(qū)為SH02，氨基酸序列為序列3，輕鏈可變區(qū)為SH03，氨基酸序列為序列5 ；h. KS08,其重鏈可變區(qū)為SH02，氨基酸序列為序列3，輕鏈可變區(qū)為SH04，氨基酸序列為序列7 ；i.KSll，其重鏈可變區(qū)為SH02，氨基酸序列為序列3，輕鏈可變區(qū)為SH07，氨基酸序列為序列13 ；
j.KSOl，其重鏈可變區(qū)為SH01，氨基酸序列為序列1，輕鏈可變區(qū)為SH03，氨基酸序列為序列5 ；LKS05，其重鏈可變區(qū)為SH01，氨基酸序列為序列1，輕鏈可變區(qū)為SH04，氨基酸序列為序列7 ；1.KS09，其重鏈可變區(qū)為SH01，氨基酸序列為序列1，輕鏈可變區(qū)為SH07，氨基酸序列為序列13。其中序列1的第一位氨基酸殘基為Glu或Gln，優(yōu)選Glu。上述序列中，序列1和序列3均共有120個氨基酸殘基；序列5、序列7、序列13、 序列9、序列11和序列15均共有109個氨基酸殘基。所述抗體由重鏈和輕鏈組成，所述重鏈的恒定區(qū)氨基酸序列與人抗體重鏈恒定區(qū)氨基酸序列相同，所述輕鏈的恒定區(qū)氨基酸序列與人抗體輕鏈恒定區(qū)氨基酸序列相同。所述抗體的重鏈恒定區(qū)可以是任意類型(IgG、IgA、IgM、IgE、IgD)或亞類(IgGl、 IgG2、IgG3、IgG4，IgMl、IgM2，IgAl、IgA2，)的人源恒定區(qū)；所述抗體的輕鏈恒定區(qū)可為任意類型(κ型或λ型)、亞型(λ 1、λ 2、λ 3、λ 4)、或同種異性(Km(l)、Km⑵、Km(3)) 輕鏈的人源恒定區(qū)。所述抗體的重鏈恒定區(qū)氨基酸序列如序列表中序列17所示；所述抗體的輕鏈恒定區(qū)氨基酸序列如序列表中序列19所示。所述重鏈的氨基酸序列為序列表中序列21 ；所述輕鏈的氨基酸序列為序列表中序列23。其中序列21的第1-120位氨基酸殘基為所述重鏈的可變區(qū)，第121-450位氨基酸殘基為所述重鏈的恒定區(qū)；序列23的第1-109位氨基酸殘基為所述輕鏈的可變區(qū)，第 110-214位氨基酸殘基為所述輕鏈的恒定區(qū)。序列21的第一位氨基酸為Glu或Gin。本發(fā)明的再一個目的是提供由所述Fab衍生的抗原結(jié)合片段A或抗原結(jié)合片段B。 抗原結(jié)合片段A為由所述Fab衍生的Fab’、F(ab’)2、Fv、重鏈可變區(qū)、輕鏈可變區(qū)、選自重鏈可變區(qū)的多肽片段或選自輕鏈可變區(qū)的多肽片段；抗原結(jié)合片段B為由所述抗體衍生的 Fab、Fab，、F(ab，)2、Fv (抗體可變區(qū)片段)、重鏈可變區(qū)、輕鏈可變區(qū)、選自重鏈可變區(qū)的多肽片段或選自輕鏈可變區(qū)的多肽片段。上述F(ab' )2由一對輕鏈和一對略大于Fd的重鏈(稱為Fd')組成，胃蛋白酶水解IgG分子產(chǎn)生此片段，它包含兩個Fab，可結(jié)合2個抗原表位。Fd'約含有235個氨基酸殘基，包括VH、CHl和絞鏈區(qū)。Fv由輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)(Vh)組成，二者以非共價鍵結(jié)合在一起，分子量約為完整抗體分子的1/6，具有單一抗原結(jié)合位點。Fv包括 ScFv(單鏈抗體)、DsFv(二硫鍵穩(wěn)定抗體)等。kFv是將％和\用一段適當(dāng)?shù)墓丫酆塑账?接頭，linker)連起來，使之表達(dá)為單一的肽鏈。DsFv是在輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)適當(dāng)部位各引入一個半胱氨酸，形成一個二硫鍵固定的Fv段，經(jīng)證實其結(jié)合能力及穩(wěn)定性均優(yōu)于&Fv。編碼如下A)_C)中任一種蛋白的基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍A)所述Fab ；B)所述抗體；C)所述抗原結(jié)合片段A或所述抗原結(jié)合片段B。所述Fab和所述抗原結(jié)合片段A的重鏈可變區(qū)的編碼序列均為序列表中序列觀的第1-360位、序列沈的第1-360位、序列2和序列4中的任一種；所述Fab和所述抗原結(jié)合片段A的輕鏈可變區(qū)的編碼序列均為序列表中序列32的第1-327位、序列30的第1-327位、序列16、序列10、序列12、序列8、序列14和序列6中的任一種；所述抗體和抗原結(jié)合片段B的重鏈可變區(qū)的編碼序列均如序列表中序列2或序列4所示；所述抗體和抗原結(jié)合片段B的輕鏈可變區(qū)編碼序列均如序列表中序列16、序列10、序列12、序列8、序列14和序列 6中的任一種所示。 其中，序列2和序列4均共有360個核苷酸；序列6、序列8、序列14、序列10、序列 12和序列16均共有327個核苷酸。 所述Fab的CHl的編碼序列如序列表中序列34所示；所述Fab的輕鏈恒定區(qū)編碼序列如序列表中序列20所示。所述抗體的重鏈恒定區(qū)的編碼序列如序列表中序列18所示；所述抗體的輕鏈恒定區(qū)的編碼序列如序列表中序列20所示。在本發(fā)明的實施例中，所述Fab的編碼序列為下述cl)_c3)中任一種cl)KS-7F 所述Fab的重鏈片段的編碼序列為序列表中序列28，且所述Fab的輕鏈編碼序列為序列表中序列32 ；c2)KS-7A 所述Fab的重鏈片段的編碼序列為序列表中序列26，且所述Fab的輕鏈編碼序列為序列表中序列32 ；c3)KS-2E 所述Fab的重鏈片段的編碼序列為序列表中序列26，且所述Fab的輕鏈編碼序列為序列表中序列30 ；所述抗體的重鏈編碼序列具體為序列表中序列22 ；所述抗體的輕鏈編碼序列具體為序列表中序列24。其中序列22的第1-360位核苷酸為所述重鏈的可變區(qū)核苷酸，第360-1350位核苷酸為所述重鏈的恒定區(qū)核苷酸；其中序列M的第1-327位核苷酸為所述輕鏈的可變區(qū)核苷酸，第3觀-642位核苷酸為所述輕鏈的恒定區(qū)核苷酸。本發(fā)明的又一個目的是提供下述遺傳材料含有所述基因的重組載體、重組菌、重組細(xì)胞系、重組病毒或表達(dá)盒。所述重組載體為表達(dá)所述Fab或抗體或抗原結(jié)合片段的原核表達(dá)載體或真核表達(dá)載體。所述重組菌為攜帶有所述基因的大腸桿菌。所述重組細(xì)胞系可為轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或融合細(xì)胞系，其中轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系可為轉(zhuǎn)入本發(fā)明的抗人腫瘤壞死因子α人源化Fab或抗體或抗原結(jié)合片段編碼基因的哺乳動物細(xì)胞系，優(yōu)選CHO細(xì)胞系，或293細(xì)胞及其亞系；融合細(xì)胞系可為分泌本發(fā)明的抗人腫瘤壞死因子α人源化抗體的雜交瘤細(xì)胞。所述重組病毒為攜帶有所述基因的重組腺病毒或重組腺相關(guān)病毒等。所述表達(dá)盒是一個DNA分子，從上游至下游依次為如下三個片段啟動子、由所述啟動子啟動轉(zhuǎn)錄的所述抗體或Fab，或所述抗原結(jié)合片段的編碼基因和終止子。將含所述Fab，或所述抗體，或所述抗原結(jié)合片段編碼基因的重組載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，即可表達(dá)相應(yīng)的蛋白，獲得所述抗體或Fab，或所述抗原結(jié)合片段。所述宿主細(xì)胞可以是真核細(xì)胞，也可以是原核細(xì)胞，它們包含但不限于哺乳動物細(xì)胞、細(xì)菌、酵母、昆蟲細(xì)胞等?？捎糜诘鞍踪|(zhì)大規(guī)模表達(dá)的哺乳動物細(xì)胞有多種，如293細(xì)胞、CHO細(xì)胞、SP20細(xì)胞、NSO細(xì)胞、COS細(xì)胞、BHK細(xì)胞或PerC6細(xì)胞等。轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方法有多種，其中包括但不限于電穿孔，脂質(zhì)體介導(dǎo)法，鈣介導(dǎo)法等。一種較佳的所述抗體或Fab，或所述抗原結(jié)合片段的表達(dá)方式是在已經(jīng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞中對重組載體進(jìn)行基因擴(kuò)增，以提高相應(yīng)重組蛋白的表達(dá)量，例如用含有二氫葉酸還原酶(DHFR)的重組載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染缺乏DHFR的宿主細(xì)胞后，可在細(xì)胞培養(yǎng)液中添加氨甲喋啶(MTX)的濃度以擴(kuò)增重組載體在宿主細(xì)胞中的拷貝數(shù)量。含有所述編碼基因序列組合的Fab或IgG表達(dá)后，可用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA) 或其他方法測定培養(yǎng)液中的蛋白濃度。對于Fab片段，可用ftOtein G親和層析法提純；IgG 蛋白可用ftOtein A親和層析法提純。所述Fab，或所述抗體，或所述抗原結(jié)合片段，或所述基因，或所述遺傳材料的用途也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍dl)在制備預(yù)防和/或治療人抗腫瘤壞死因子α相關(guān)疾病藥物中的用途，或d2)在制備中和人抗腫瘤壞死因子α產(chǎn)品中的用途，或d3)在制備定性或定量檢測人抗腫瘤壞死因子α的試劑盒中的用途。所述人腫瘤壞死因子α相關(guān)疾病為由人腫瘤壞死因子α升高引起的疾??；優(yōu)選為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、自身免疫性葡萄膜炎、克隆病、斑片性銀屑病、銀屑病關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、潰瘍性結(jié)腸炎或幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎。本發(fā)明的又一個目的是提供藥物組合物，該藥物組合物含有輔料和活性成分，所述活性成分含有下述物質(zhì)中的至少一種所述Fab，所述抗體，所述抗原結(jié)合片段，所述基因，和所述遺傳材料；所述輔料為藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。上述藥物組合物，可用于預(yù)防和/或治療人腫瘤壞死因子α相關(guān)疾病，如自身免疫性葡萄膜炎或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。該藥物組合物的活性成分也可只為上述任一 Fab或抗體，或上述任一所述抗原結(jié)合片段，或上述任一所述基因，或上述遺傳材料中的任一種。本發(fā)明通過對CDR移植后的抗體進(jìn)行突變改造，有力克服了常規(guī)抗體人源化方法 (將鼠源抗體可變區(qū)(VH、VK)的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)直接移植到人抗體框架中)導(dǎo)致抗體親和力受損這一缺陷，最終得到與起始抗體相近的人源化抗體。本發(fā)明所提供的Fab及IgG 抗體的人源化程度大大提高(達(dá)95%以上)，且經(jīng)實驗證明具有與人鼠嵌合抗體Remicade 相近，甚至更高的親和力及生物活性，對人TNF α具有更好的中和作用，可更有效地治療與 TNFa相關(guān)的疾病，優(yōu)選類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、自身免疫性葡萄膜炎、克隆病、斑片性銀屑病、銀屑病關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、潰瘍性結(jié)腸炎或幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎。


圖1為Elisa檢測人源化Fab抑制TNF α的生物活性。圖2為細(xì)胞毒性實驗檢測人源化Fab中和TNF α的生物活性。圖3為KSlO與不同種屬抗原TNF α的結(jié)合情況。圖4為KSlO對實驗性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠的治療評分結(jié)果。由左至右依次為正常組、陰性組、模型組、KSlO 5mg/kg 組、KSlO 10mg/kg 組、KSlO 20mg/kg 組。圖5為KSlO對實驗性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)滑液/組織IL-I β水平的影響。 由左至右依次為正常組、陰性組、模型組、KSlO 5mg/kg組、KSlO 10mg/kg組、KS1020mg/kg組。圖6為KSlO對實驗性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)滑液/組織IL-6水平的影響。由左至右依次為正常組、陰性組、模型組、KSlO 5mg/kg組、KSlO 10mg/kg組、KS1020mg/kg組。
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具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。本發(fā)明描述的人源化TNF α抗體重輕鏈的⑶R移植，PCR引入位點突變及突變文庫的篩選是通過常規(guī)基因重組技術(shù)及基于抗原抗體相互作用的免疫學(xué)技術(shù)所完成，具體實驗方法步驟如<<分子克隆>>第三版(Jos印h Sambrook，科學(xué)出版社，2002年8月1日) 及類似實驗手冊所記載。實施例中涉及到的EC50是將測得的OD值(0D450)輸入graphpad prism5軟件獲得的，同時獲得相關(guān)結(jié)果圖。下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例1、人源化TNF α抗體Fab的表達(dá)及活性檢測本實施例涉及三種人源化TNF α抗體Fab (Fab由抗體的重鏈Fd片段和抗體的輕鏈組成)，分別是 KS-2E、KS-7A、KS-7F。一、KS-2E、KS-7A、KS-7F 表達(dá)載體的構(gòu)建(一)輕鏈、重鏈的獲得以人TNF-α (R&D公司，貨號210-TA_050)免疫鼠獲得的雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)過單克隆篩選后，提取總RNA為模板，利用通用引物Pl 5-GCGAATTCAGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG-3, P2 :5-TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAG-3引導(dǎo)進(jìn)行PCR擴(kuò)增重鏈可變區(qū)序列，通用引物 P3 5-GACATTCTGMTSACMCAGMCTCC-3, P4 5-GTTAGATCTCGAGCTTGGTCCC-3 引導(dǎo)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增輕鏈可變區(qū)序列，切膠回收目的條帶，將擴(kuò)增獲得的抗體輕鏈和重鏈的產(chǎn)物分別插入到PMD18-T載體(TaKaRa公司貨號D101C)中，分別挑取單菌落，經(jīng)過測序鑒定獲得抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)序列。( 二)人源化Fab的構(gòu)建將輕鏈可變區(qū)與人源化抗體的輕鏈可變區(qū)進(jìn)行氨基酸序列相似性比對，將重鏈可變區(qū)與人源化抗體的重鏈可變區(qū)進(jìn)行氨基酸序列相似性比對，通過Ig BLAST(http:// www. ncbi. nlm. nih. gov/igblast/)禾口 IMGT (免疫基因數(shù)據(jù)庫 IMGT :http //www. imgt. org)中分別進(jìn)行序列相似性搜索，在搜索的結(jié)果中，選擇與輕、重鏈均有較高序列相似性的抗體作為人源化抗體模板，將獲得的重鏈可變區(qū)VH移植到序列相似度較高的人抗體 IGHV3-15*07 (Accession number :M99406)的框架之中，對獲得輕鏈可變區(qū)VK移植到相似度較高的人抗體IGKV6-21*01 (Accession number :X63399)的框架之中。在經(jīng)過對重鏈片段(Fd)和輕鏈人源序列經(jīng)過多輪的突變后，將不同的輕鏈和重鏈片段(Fd)組合插入到pTLR載體(經(jīng)過改造的pET22b(+)載體)中。具體操作為，制備兩端分別含有酶切位點BamHI和EcoRI的各輕鏈DNA，以及兩端分別含有酶切位點NotI和 XhoI的各重鏈片段爾(1)0嫩，將這兩個0嫩分別克隆入？11^載體(經(jīng)過改造的pET22b(+) 載體)中的相應(yīng)限制性內(nèi)切酶位點之間，即各輕鏈DNA分別插入到限制性內(nèi)切酶BamHI和 EcoRI位點之間，各重鏈片段(Fd)DNA分別插入到限制性內(nèi)切酶NotI和BioI位點之間，構(gòu)建數(shù)個Fab表達(dá)載體(包括分別表達(dá)KS-2E、KS-7A和KS-7F的三個Fab表達(dá)載體)。其中，上述不同的輕鏈和重鏈片段(Fd)組合中包括KS-2E、KS-7F、KS-7A這三個
10Fab。KS-2E的重鏈片段氨基酸序列為序列表中序列25，核苷酸序列為序列26，輕鏈氨基酸序列為序列表中序列四，核苷酸序列為序列30 ；KS-7A的重鏈片段氨基酸序列為序列表中序列25，核苷酸序列為序列26，輕鏈氨基酸序列為序列表中序列31，核苷酸序列為32 ； KS-7F的重鏈片段氨基酸序列為序列表中序列27，核苷酸序列為序列觀，輕鏈氨基酸序列為序列表中序列31，核苷酸序列為序列32。對pET22b(+)載體進(jìn)行改造獲得上述pTLR載體的具體方法如下首先通過人工合成一段含有T7啟動子(T7 promoter)、乳糖操縱子(lac operator)、核糖體結(jié)合位點(RBS) 序列以及兩端包含有Mil和NotI酶切位點的DNA片段(簡稱，T-L-R DNA序列，如序列表中序列35所示)，pET22b (+)載體(美國Novage公司產(chǎn)品)和T-L-R DNA序列分別用Sal I和Not I雙酶切后，T4連接酶連接后轉(zhuǎn)化，常規(guī)方法挑單克隆測序篩選出正確改造的載體。二、KS-2E、KS-7A、KS-7F 的原核表達(dá)將上述構(gòu)建的Fab表達(dá)載體(包括分別表達(dá)KS-2E、KS_7A和KS-7F的三個Fab表達(dá)載體)分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplO，涂氯霉素抗性2-YT平板(蛋白胨1.6%，酵母提取物 1%, NaCl 0. 5%，瓊脂粉1. 5% )。第二天選擇合適菌落密度的板挑取單克隆菌落，每個陽性克隆挑8個單克隆到96孔深孔板里IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，每個單克隆菌落加入到6ml含氯霉素的2-YT液體培養(yǎng)基(蛋白胨1.6%，酵母提取物1%，NaCl 0.5% )中，于37°C 250rpm 搖12小時，每管中取0. 2 μ 1菌液在氯霉素抗性的2-ΥΤ平板上保菌。將5ml菌液接種到 500ml氯霉素抗性2-YT液體培養(yǎng)基，33 °C，300rmp培養(yǎng)至OD600為0. 6。在培養(yǎng)基中加入 IPTG至終濃度為50 μ Μ,誘導(dǎo)不同F(xiàn)ab蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)時間為3h。將誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)束后的培養(yǎng)液在5100rpm，10°C條件下，離心15min，棄上清，沉淀用40ml預(yù)冷的TES溶液充分重懸菌體沉淀；重懸后再加入66ml預(yù)冷的1/5TES溶液到重懸后的菌液中，冰上孵育40min ；冰浴結(jié)束后，13000rpm，4°C，離心IOmin ；離心后收集上清，上清即為含有Fab蛋白(KS-2E、KS-7A 或KS-7F蛋白)的細(xì)胞周質(zhì)提取液。周質(zhì)提取液過G-25 (GE公司，17-0034-01)柱脫鹽處理后，準(zhǔn)備ftOtein G(GE公司17-0618-04)預(yù)裝柱，平衡液(20mM磷酸緩沖液pH 6.5)平衡后蛋白上樣，上樣結(jié)束后繼續(xù)用平衡液清洗柱子，然后用洗脫液(0. IM Gly-HCl, pH2. 5) 直接洗脫，收集洗脫樣品，并預(yù)先在收集樣品前按照Tris緩沖液與樣品體積比1 9加入 LOM Tris-HCl (pH9. 0)于樣品收集管里，快速調(diào)pH7. 0，收集到的液體即為目的蛋白，蛋白經(jīng)過SDS-PAGE分析純度后，對蛋白樣品進(jìn)行濃度測定，最后分裝后保存于-80°C，得到純度較高的Fab蛋白(包括KS-2E、KS-7A和KS-7F這三個蛋白)。三、KS-2E、KS-7A、KS-7F的活性檢測1、ELISA法檢測人源化Fab與TNF α的結(jié)合能力以每孔IOOng的人源TNF α (R&D公司，商品目錄號為210-ΤΑ-050)為底物包被酶標(biāo)板，然后分別加入一系列2倍稀釋的40ηΜ抗體Fab (步驟二制備的Fab蛋白，包括KS-2E、 KS-7A和KS-7F這三個蛋白)溫育后，再加辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗人C-Kappa二抗(Sigma 公司，產(chǎn)品目錄號為K3502)，最后加TMB顯色，加入2M硫酸終止反應(yīng)，從而檢測結(jié)合TNF α 的Fab蛋白，經(jīng)過這樣的篩選方法獲得了 3個活性較高的Fab :KS_2E、KS-7F、KS_7A，共包含了 2個不同的VH (VH01和VH02，VH01的氨基酸序列如序列25 ；核苷酸序列如序列沈；VH02 的氨基酸序列如序列27 ；核苷酸序列如序列28)和2個不同的VK(VK03和VK05，VK03的氨基酸序列如序列四；核苷酸序列如序列30 ；VK05的氨基酸序列如序列31 ；核苷酸序列如序
11列 32)(表 1)。ELISA法檢測人源化Fab與TNF α的結(jié)合能力的實驗結(jié)果在圖1中顯示。結(jié)果表明上述獲得的3個人源化Fab和人鼠嵌合抗體Remicade的Fab片段具有相似的抗原親和力，其中KS-7A和KS-7F結(jié)合TNF α的EC5tl優(yōu)于人鼠嵌合抗體Remicade Fab (表2)。表1人源化TNF- α抗體的Fab
權(quán)利要求
1.抗人腫瘤壞死因子α的人源化抗原結(jié)合片段Fab，含有重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)； 所述Fab的氨基酸序列為下述al)_a2)中任一種al)所述重鏈可變區(qū)的氨基酸序列為序列表中序列27的第1-120位或序列25的第 1-120位，所述輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列為序列表中序列31的的第1-109位或序列四的第 1-109 位；a2)所述重鏈可變區(qū)的氨基酸序列為序列表中序列1或序列3，所述輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列為序列表中序列15、序列9、序列11、序列7、序列13和序列5中的任一種；所述序列1的第一位氨基酸殘基為Glu或Gin。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的Fab，其特征在于所述Fab由重鏈片段和輕鏈組成，所述重鏈片段由所述重鏈可變區(qū)和重鏈恒定區(qū)的CHl組成，所述輕鏈由所述輕鏈可變區(qū)和輕鏈恒定區(qū)組成；所述CHl氨基酸序列與人抗體重鏈恒定區(qū)的CHl氨基酸序列相同，所述輕鏈恒定區(qū)氨基酸序列與人抗體輕鏈恒定區(qū)氨基酸序列相同；所述CHl氨基酸序列如序列表中序列33所示；所述輕鏈恒定區(qū)氨基酸序列如序列表中序列19所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的Fab，其特征在于所述Fab為下述bl)-b;3)中任一種bl)KS-7F 所述重鏈片段的氨基酸序列為序列表中序列27，且所述輕鏈的氨基酸序列為序列表中序列31 ；b2)KS-7A 所述重鏈片段的氨基酸序列為序列表中序列25，且所述輕鏈的氨基酸序列為序列表中序列31 ；b3)KS-2E 所述重鏈片段的氨基酸序列為序列表中序列25，且所述輕鏈的氨基酸序列為序列表中序列四。
4.抗人腫瘤壞死因子α的人源化抗體，含有重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)；所述重鏈可變區(qū)由權(quán)利要求3的bl)所述Fab的重鏈可變區(qū)突變而來，所述輕鏈可變區(qū)由權(quán)利要求3的 bl)所述Fab的輕鏈可變區(qū)突變而來，其特征在于所述抗體的重鏈可變區(qū)氨基酸序列為序列表中序列1或序列3 ；所述抗體的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列為序列表中序列序列15、序列 9、序列11、序列7、序列13和序列5中的任一種；所述序列1的第一位氨基酸殘基為Glu或Gin。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述抗體，其特征在于所述抗體為下述a-Ι中任一種a、KS10，其重鏈可變區(qū)為SH01，氨基酸序列為序列1，輕鏈可變區(qū)為SH08，氨基酸序列為序列15 ；b、KS03，其重鏈可變區(qū)為SH01，氨基酸序列為序列1，輕鏈可變區(qū)為SH05，氨基酸序列為序列9 ；c、KS06，其重鏈可變區(qū)為SH01，氨基酸序列為序列1，輕鏈可變區(qū)為SH06，氨基酸序列為序列11 ；d、KS12，其重鏈可變區(qū)為SH02，氨基酸序列為序列3，輕鏈可變區(qū)為SH08，氨基酸序列為為序列15 ；e、KS04，其重鏈可變區(qū)為SH02，氨基酸序列為序列3，輕鏈可變區(qū)為SH05，氨基酸序列為序列9 ；f> KS07，其重鏈可變區(qū)為SH02，氨基酸序列為序列3，輕鏈可變區(qū)為SH06，氨基酸序列為序列11 ；g、KS02，其重鏈可變區(qū)為SH02，氨基酸序列為序列3，輕鏈可變區(qū)為SH03，氨基酸序列為序列5 ；h、KS08，其重鏈可變區(qū)為SH02，氨基酸序列為序列3，輕鏈可變區(qū)為SH04，氨基酸序列為序列7 ；i、KS11，其重鏈可變區(qū)為SH02，氨基酸序列為序列3，輕鏈可變區(qū)為SH07，氨基酸序列為序列13 ；j、KS01，其重鏈可變區(qū)為SH01，氨基酸序列為序列1，輕鏈可變區(qū)為SH03，氨基酸序列為序列5 ；k、KS05，其重鏈可變區(qū)為SH01，氨基酸序列為序列1，輕鏈可變區(qū)為SH04，氨基酸序列為序列7 ；l、KS09，其重鏈可變區(qū)為SH01，氨基酸序列為序列1，輕鏈可變區(qū)為SH07，氨基酸序列為序列13 ；所述序列1的第一位氨基酸殘基為Glu或Gin。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述抗體，其特征在于所述抗體由重鏈和輕鏈組成，所述重鏈的恒定區(qū)氨基酸序列與人抗體重鏈恒定區(qū)氨基酸序列相同，所述輕鏈的恒定區(qū)氨基酸序列與人抗體輕鏈恒定區(qū)氨基酸序列相同；所述重鏈的恒定區(qū)氨基酸序列如序列表中序列17所示；所述輕鏈的恒定區(qū)氨基酸序列如序列表中序列19所示。
7.根據(jù)權(quán)利要求4-6中任一所述的抗體，其特征在于所述重鏈的氨基酸序列為序列表中序列21 ；所述輕鏈的氨基酸序列為序列表中序列23 ；所述序列21的第一位氨基酸殘基為Glu或Gin。
8.由權(quán)利要求1-3中任一所述Fab衍生的抗原結(jié)合片段A或由權(quán)利要求4-7中任一所述抗體衍生的抗原結(jié)合片段B，其特征在于所述抗原結(jié)合片段A為Fab’、F(ab’)2、Fv、重鏈可變區(qū)、輕鏈可變區(qū)、選自重鏈可變區(qū)的多肽片段或選自輕鏈可變區(qū)的多肽片段；所述抗原結(jié)合片段B為Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、重鏈可變區(qū)、輕鏈可變區(qū)、選自重鏈可變區(qū)的多肽片段或選自輕鏈可變區(qū)的多肽片段。
9.編碼如下A)-C)中任一種蛋白的基因A)權(quán)利要求1-3中任一所述Fab；B)權(quán)利要求4-7中任一所述抗體；C)權(quán)利要求8所述抗原結(jié)合片段。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的基因，其特征在于權(quán)利要求1-3中任一所述Fab和權(quán)利要求8所述抗原結(jié)合片段A的重鏈可變區(qū)的編碼序列均為序列表中序列觀的第1-360位、序列沈的第1-360位、序列2和序列4中的任一種；權(quán)利要求1-3中任一所述Fab和權(quán)利要求8所述抗原結(jié)合片段A的輕鏈可變區(qū)的編碼序列均為序列表中序列32的第1-327位、序列30的第1-327位、序列16、序列10、序列12、序列8、序列14和序列6中的任一種；權(quán)利要求4-7中任一所述抗體和權(quán)利要求8所述抗原結(jié)合片段B的重鏈可變區(qū)的編碼序列均如序列表中序列2或序列4所示；權(quán)利要求4-7中任一所述抗體和權(quán)利要求8所述抗原結(jié)合片段B的輕鏈可變區(qū)編碼序列均如序列表中序列16、序列10、序列12、序列8、序列14和序列6中的任一種所示。
11.根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的基因，其特征在于所述Fab的CHl的編碼序列如序列表中序列；34所示；所述Fab的輕鏈恒定區(qū)編碼序列如序列表中序列20所示；所述抗體的重鏈恒定區(qū)的編碼序列如序列表中序列18所示；所述抗體的輕鏈恒定區(qū)的編碼序列如序列表中序列20所示。
12.根據(jù)權(quán)利要求9-11中任一所述的基因，其特征在于所述Fab的編碼序列為下述 cl)-c3)中任一種cl)KS-7F 所述Fab的重鏈片段的編碼序列為序列表中序列觀，且所述Fab的輕鏈編碼序列為序列表中序列32 ；c2)KS-7A 所述Fab的重鏈片段的編碼序列為序列表中序列沈，且所述Fab的輕鏈編碼序列為序列表中序列32 ；c3)KS-2E 所述Fab的重鏈片段的編碼序列為序列表中序列沈，且所述Fab的輕鏈編碼序列為序列表中序列30 ；所述抗體的重鏈編碼序列為序列表中序列22 ；所述抗體的輕鏈編碼序列為序列表中序列24。
13.下述遺傳材料含有權(quán)利要求9-12中任一所述基因的重組載體、重組菌、重組細(xì)胞系、重組病毒或表達(dá)盒。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的遺傳材料，其特征在于所述重組載體為表達(dá)所述Fab或抗體或抗原結(jié)合片段的原核表達(dá)載體或真核表達(dá)載體；所述重組菌為攜帶有所述基因的大腸桿菌；所述重組細(xì)胞系為轉(zhuǎn)入所述基因的哺乳動物細(xì)胞系，優(yōu)選CHO細(xì)胞系，或293細(xì)胞及其亞系；所述重組病毒為攜帶有所述基因的重組腺病毒或重組腺相關(guān)病毒。
15.權(quán)利要求1-3中任一所述Fab，或權(quán)利要求4-7中任一所述抗體，或權(quán)利要求8所述抗原結(jié)合片段，或權(quán)利要求9-12中任一所述的基因，或權(quán)利要求13或14所述遺傳材料的用途dl)在制備預(yù)防和/或治療人抗腫瘤壞死因子α相關(guān)疾病藥物中的用途，或d2)在制備中和人抗腫瘤壞死因子α產(chǎn)品中的用途，或d3)在制備定性或定量檢測人抗腫瘤壞死因子α的試劑盒中的用途。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述用途，其特征在于所述人腫瘤壞死因子α相關(guān)疾病為由人腫瘤壞死因子α升高引起的疾病，優(yōu)選為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、自身免疫性葡萄膜炎、克隆病、 斑片性銀屑病、銀屑病關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、潰瘍性結(jié)腸炎或幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎。
17.藥物組合物，含有輔料和活性成分，所述活性成分含有下述物質(zhì)中的至少一種權(quán)利要求1-3中任一所述Fab，權(quán)利要求4-7中任一所述抗體，權(quán)利要求8所述抗原結(jié)合片段， 權(quán)利要求9-12中任一所述的基因，和權(quán)利要求13或14所述遺傳材料；所述輔料為藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗人腫瘤壞死因子α的人源化Fab和人源化抗體及其用途。本發(fā)明所提供的人源化Fab含有氨基酸序列如序列27的第1-120位、序列25的第1-120位、序列1或序列3所示的重鏈可變區(qū)，和氨基酸序列如序列31的第1-109位、序列29的第1-109位、序列15、序列9、序列11、序列7、序列13或序列5所示的輕鏈可變區(qū)。本發(fā)明所提供的人源化抗體含有氨基酸序列如序列1或序列3所示的重鏈可變區(qū)，和氨基酸序列如序列15、序列9、序列11、序列7、序列13和序列5中的任一種所示的輕鏈可變區(qū)。本發(fā)明所提供的人源化Fab和人源化抗體具有較高的親和力和生物活性，能很好地中和人TNFα，有效的治療TNFα相關(guān)疾病。
文檔編號A61P29/00GK102443063SQ20111029481
公開日2012年5月9日 申請日期2011年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月30日
發(fā)明者柯瀟, 高小平 申請人:成都康弘生物科技有限公司