專利名稱：外周給予的glp－1類似物和衍生物在控制肥胖中的用途的制作方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)，GLP-1類似物和衍生物在幫助減輕體重的方法和組合物，特別是藥用制劑中的用途。
肥胖，特別是上身肥胖，是世界上營(yíng)養(yǎng)過剩的人群當(dāng)中最常見的營(yíng)養(yǎng)紊亂。大量研究證實(shí)，減輕體重可大大降低慢性疾病的危險(xiǎn)，所述慢性疾病如糖尿病、高血壓、高脂血癥、冠心病和肌骨骼病。例如，各種肥胖指標(biāo)，包括單純的體重，腰/臀比，和腸系膜脂肪儲(chǔ)存，均與非胰島素依賴性糖尿病(NIDDM)密切相關(guān)，后者也稱為II型糖尿病。根據(jù)美國(guó)糖尿病協(xié)會(huì)(1995)的統(tǒng)計(jì)，大約80％的NIDDM患者超重。減輕體重是許多慢性疾病包括NIDDM的治療的一個(gè)具體目標(biāo)。
目前幫助減輕體重的方法均不能讓人完全滿意。某些肥胖患者可通過刻意調(diào)整行為來減輕體重，如改變飲食和增加運(yùn)動(dòng)。通過這些方法未能減輕體重可能是由于某些遺傳因素，它們引起食欲增加，導(dǎo)致偏好高脂食物或脂肪生成代謝的傾向。不幸的是，每年用于減輕體重的措施上的花費(fèi)估計(jì)有330億元，而這些措施中大部分沒有效果。因此，急需幫助減輕體重的新方法和組合物(如藥物)來補(bǔ)充舊的方法。
已知胰高血糖素樣肽1在對(duì)進(jìn)食的生理調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。GLP-1由胰高血糖素原加工而來，攝入食物后從主要定位于小腸末端和結(jié)腸的內(nèi)分泌L細(xì)胞釋放進(jìn)入血液(Nilsson et al.，1991；Krcymann et al.，1987；Mojsov et al.，1986)。GLP-1通過G蛋白偶聯(lián)細(xì)胞表面受體(GLP-1R)發(fā)揮作用，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)素誘導(dǎo)的胰島素合成(Fehmann et al，1992)和釋放(Fehmann et al.，1995)。GLP-1刺激胰島素分泌(促胰島作用)和cAMP形成(Mojsov et al.，1992)。GLP-1(7-36)酰胺刺激胰島素釋放，降低胰高血糖素分泌，并抑制胃液分泌和排空(Nauck，1993；Gutniak et al，1992)。在迷走神經(jīng)切斷的受試者中未見到GLP-1的這些胃腸道效應(yīng)，指出它是一種中樞介導(dǎo)的效應(yīng)(Orskov et al.，1995)。GLP-1以高親和力與分離的大鼠脂肪細(xì)胞結(jié)合，激活cAMP產(chǎn)生(Valverde et al.，1993)，刺激脂肪合成(Oben，et al.，1991)或脂解作用(Ruiz-Grande et al.，1992)。GLP-1刺激大鼠骨骼肌中的糖元合成，葡萄糖氧化和乳酸形成(Villanueva et al.，1994)。
編碼胰型GLP-1受體的mRNA在大鼠胰島、肺、下丘腦和胃中以相對(duì)較高的量存在(Billock et al.，1996)。有趣的是，盡管人們知道GLP-1和GLP-1受體均發(fā)現(xiàn)于下丘腦(Krcymann et al.，1989；Kanse et al.，1988)，但一直未確定GLP-1的中樞作用，直到最近才有人報(bào)導(dǎo)，GLP-1通過腦室內(nèi)途徑(ICV)給藥顯著抑制禁食大鼠的攝食(Turton et al.，1996)。在該報(bào)導(dǎo)中還指出，GLP-1的ICV給藥之后，神經(jīng)元活化的標(biāo)志c-fos似乎只見于下丘腦的室旁核和扁桃體的中核，這兩個(gè)區(qū)域是腦中攝食調(diào)控的主要區(qū)域(Morley，1987)。在隨意取食的動(dòng)物中，注射強(qiáng)效攝食刺激物神經(jīng)肽Y后，ICV GLP-1也顯著降低食物攝取(Turton et al.，1996)。隨后的報(bào)導(dǎo)證實(shí)，在大鼠中，中樞給予或外周給予的GLP-1參與體溫調(diào)控的控制，但在短期腹膜內(nèi)給藥后不影響食物攝取(O′Shea et al.，1996)。最近的一篇文章報(bào)導(dǎo)，在厭食大鼠中，后室注射GLP-1在室旁核和扁桃體小細(xì)胞中核誘發(fā)廣泛的Fos-ir刺激，證實(shí)了Turton等的報(bào)導(dǎo)(Rowland et al.，1996)。此外，這些研究者還描述了參與進(jìn)食調(diào)控的其它中心的強(qiáng)烈激活，包括延髓孤束核的即時(shí)早期基因蛋白產(chǎn)物，腦橋后臂旁核，終紋基底核和后支(postrema)區(qū)。外周GLP-1可接觸的GLP-1受體見于大鼠下穹窿(subfornical)器官和后支區(qū)(Orskov et al.，1996)。
Turton等(1996)特別指出，GLP-1對(duì)體重和食物攝取的影響僅通過GLP-1直接在腦室用藥才可引起，GLP-1的腹膜內(nèi)用藥即使?jié)舛认鄬?duì)較高，也不影響早暗期攝食，GLP-1片段外周給藥時(shí)無活性(引用Suzuki等，1989)。這些論述不支持使用GLP-1作為一種減輕體重的組合物(藥劑)，因?yàn)橹袠型緩浇o藥如ICV途徑對(duì)治療肥胖患者來說是不切實(shí)際的。上述GLP-1的生理效應(yīng)已導(dǎo)致有人提出其可用于治療糖尿病和肥胖，方法是移植編碼GLP-1或GLP-1受體的重組細(xì)胞系，例如WO 96/25487。
另一出版物也不支持GLP-1的使用，其引證現(xiàn)有技術(shù)指出“GLP-1對(duì)攝食行為無影響”(WO 97/31943)。該出版物還報(bào)導(dǎo)了GLP-2外周給藥對(duì)食物攝取的影響。
發(fā)明概述使用胰高血糖素樣肽1類似物、衍生物和其活性肽的方法和組合物，特別是藥物組合物，藥物，可有效減輕體重和治療肥胖。對(duì)肥胖的定義隨地理區(qū)域、臨床關(guān)注和社會(huì)偏好而有所不同。然而，本發(fā)明的方法和組合物適用于任何需要減輕體重的受試者。本發(fā)明不限于在如糖尿病患者中使用。向肥胖患者外周給予GLP-1(7-36)酰胺的結(jié)果出乎意料，并與Turton等(1996)的推論相反，引起體重的顯著降低。因此，本發(fā)明的一方面是一種減輕體重的方法，它包括制備一種含胰高血糖素樣肽1化合物的組合物，并給予受試者。合適的胰高血糖素樣肽1化合物包括GLP-1，GLP-1類似物，GLP-1衍生物，GLP-1受體激動(dòng)劑，GLP-1信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的激動(dòng)劑，刺激內(nèi)源GLP-1釋放的化合物，和其可藥用的鹽。給予藥學(xué)有效劑量，即足以導(dǎo)致體重減輕的劑量。
發(fā)明詳述使用胰高血糖素樣肽1，其類似物、衍生物的方法和組合物，特別是藥物(藥物組合物和制劑)，可有效減輕體重和治療肥胖。可用于本發(fā)明實(shí)施中的GLP-1類似物和衍生物是以下化合物，其半壽期相對(duì)于GLP-1增加，在一段時(shí)間內(nèi)用于受試者可有效減輕體重?；衔颎LP-1類似物，衍生物，變體，前體和同源物均適合用于本發(fā)明實(shí)施中，只要其包括可有效減輕體重的活性片段。
GLP-1意指GLP-1(7-37)。按專業(yè)習(xí)慣，GLP-1(7-37)的氨基末端已被指定為序號(hào)7，而羧基末端被指定為序號(hào)37。本專業(yè)人員都熟知GLP-1(7-37)的氨基酸序列，但為了方便讀者，仍提供于下NH2-His7-Ala-Glu-Gly10-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp15-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu20-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala25-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala30-Trp-Leu-Val-Lys-Gly35-Arg-Gly37-COOH(SEQ ID NO1)“GLP-1類似物”被定義為，與GLP-1相比較，具有一個(gè)或幾個(gè)氨基酸取代，刪除，轉(zhuǎn)換或增加的分子。本領(lǐng)域已知的GLP-1類似物包括，例如GLP-1(7-34)和GLP-1(7-35)，GLP-1(7-36)，Val8-GLP-1(7-37)，Gln9-GLP-1(7-37)，D-Gln9-GLP-1(7-37)，Thr16-Lys18-GLP-1(7-37)，以及Lys18-GLP-1(7-37)。優(yōu)選的GLP-1類似物是GLP-1(7-34)和GLP-1(7-35)，它們被公布在美國(guó)專利5,118,666中，還有GLP-1(7-36)。這些化合物是GLP-1的生物學(xué)加工形式，具有促胰島特性。另一些GLP-1類似物被公布在美國(guó)專利5,545,618中。
“GLP-1衍生物”被定義為如下一種分子，它具有GLP-1或GLP-1類似物氨基酸序列，但是另外還具有化學(xué)修飾的一個(gè)或幾個(gè)氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)，α-碳原子，末端氨基，或者末端羧酸基?；瘜W(xué)修飾包括增加部分化學(xué)結(jié)構(gòu)，生成新鍵，和除去部分化學(xué)結(jié)構(gòu)。對(duì)氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)的修飾包括賴氨酸ε-氨基的?；彼?，組氨酸或賴氨酸的N-烷基化，谷氨酸或天冬氨酸羧酸基的烷基化，以及谷氨酰胺或天冬酰胺的脫酰氨基。末端氨基的修飾包括脫氨基，N-低級(jí)烷基修飾，N-二低級(jí)烷基修飾和N-酰基修飾。對(duì)末端羧基的修飾包括酰胺修飾，低級(jí)烷基酰胺修飾，二烷基酰胺修飾和低級(jí)烷基酯修飾。低級(jí)烷基是C1-C4烷基。并且，還可以用蛋白質(zhì)化學(xué)的普通技術(shù)人員熟知的保護(hù)基，保護(hù)一個(gè)或幾個(gè)側(cè)鏈基團(tuán)或末端基團(tuán)。還可以使氨基酸的α-碳原子單甲基化或二甲基化。
在本發(fā)明中，用于本發(fā)明的優(yōu)選GLP-1類似物和衍生物由美國(guó)專利5,545,618(′618)中要求保護(hù)的各種GLP-1分子組成?；钚訥LP-1肽7-34，7-35，7-36和7-37的有效類似物在7-10位有氨基酸取代和/或在C末端切斷和/或在基本肽中含有其它氨基酸取代。在7和8位有D氨基酸取代和/或在7位有N-烷基化或N-酰基化氨基酸的類似物對(duì)體內(nèi)降解特別具有抗性。
顯示較高胰島素刺激活性的發(fā)明′618中的類似物具有天然GLP-1，7-34，7-35，7-36或7-37或其C末端酰胺的序列，包括至少一個(gè)選自以下的修飾A.中性氨基酸，精氨酸或D型賴氨酸取代26位和/或34位的賴氨酸和/或中性氨基酸，賴氨酸或D型精氨酸取代36位的精氨酸；B.抗氧化氨基酸取代31位的色氨酸；C.根據(jù)以下至少一個(gè)的取代Y取代16位的V；K取代18位的S；
D取代21位的E；S取代22位的G；R取代23位的Q；R取代24位的A；Q取代26位的K；(使用單字符表示氨基酸)D.包括以下至少一個(gè)的取代另一個(gè)小的中性氨基酸取代8位的A；另一個(gè)酸性或中性氨基酸取代9位的E；另一個(gè)酸性氨基酸取代15位的D；和E.另一個(gè)中性氨基酸或D型或N-?；蛲榛慕M氨酸取代7位的組氨酸。
對(duì)于A、B、D和E的修飾，被取代的氨基酸可以是D型。7位的被取代的氨基酸也可以是N?；騈烷基化形式。
另一方面，發(fā)明′618涉及在血漿中相對(duì)GLP-1(7-37)具有較高降解抗性的肽。在這些類似物中，從GLP-1(7-34)到GLP-1(7-37)的任何上述截短形式或其C末端酰胺化形式通過以下方法修飾A.D中性或D酸性氨基酸取代7位的H，或B.D氨基酸取代8位的A，或C.以上二者，或D.N酰基化或N烷基化的任何天然存在的氨基酸取代7位的H。
因此，對(duì)降解具有抗性的類似物包括(N-?；?1-6C)AA)7GLP-1(7-37)和(N-烷基化(1-6C)AA)7GLP-1(7-37)，其中當(dāng)AA是賴氨酸殘基時(shí)，一個(gè)或兩個(gè)氮可以被烷基化或?；?，AA代表與保持胰島素刺激活性有關(guān)的任何氨基酸。
對(duì)于7和8位的D氨基酸取代，任何酸性或中性氨基酸的D殘基均可用于7位，任何氨基酸的D殘基均可用于8位，同樣與胰島素刺激活性有關(guān)。7位和8位中的一個(gè)或兩個(gè)也可酰基化或烷基化。這些修飾形式不僅可用于GLP-1(7-37)，也可用于較短的截短類似物。
因此，發(fā)明′618中的優(yōu)選類似物是以下類似物，其中GLP-1的(7-34)，(7-35)或(7-36)形式僅通過中性氨基酸、精氨酸或D型賴氨酸取代26位和/或34位賴氨酸和/或中性氨基酸，賴氨酸或D型精氨酸取代36位精氨酸(A部分)進(jìn)行修飾。特別優(yōu)選的是以下類似物，其中取代26和34位賴氨酸的氨基酸選自K+，G，S，A，L，I，Q，R，R+和M，取代36位精氨酸的氨基酸選自K，K+，G，S，A，L，I，Q，M和R+。(此處+代表D型)。
還優(yōu)選以下類似物，其中唯一的修飾是抗氧化氨基酸取代31位的色氨酸(B部分)。特別優(yōu)選的取代選自F，V，L，I，A和Y。
也優(yōu)選以下類似物，其中唯一的修飾是C部分中列出的至少一個(gè)具體取代。特別優(yōu)選以下類似物，其中S取代22位的G，R分別取代23和24位的Q和A，并且Q取代26位的K，或Y取代16位的V，K取代18位的S，或者這些取代加上D取代21位的E。
也優(yōu)選以下類似物，其中唯一的修飾是D部分中列出的。特別優(yōu)選的是以下類似物，其中取代8位丙氨酸的小的中性氨基酸選自S，S+，GC，C+，Sar，A+，β-ala和Aib；和/或取代9位谷氨酸的酸性或中性氨基酸選自E+，D，D+，Cya T，T+，N，N+，Q，Q+，Cit，MSO和乙?；腒；和/或另一個(gè)取代10位甘氨酸的中性氨基酸選自S，S+，Y，Y+，T，T+，N，N+，Q，Q+，Cit，MSO，乙酰化的K，F(xiàn)和F+；和/或其中D取代15位的E。
也優(yōu)選以下類似物，其中僅7位發(fā)生改變(E部分)。優(yōu)選的取代如下，其中取代7位組氨酸的氨基酸選自H，Y，Y+，F(xiàn)，F(xiàn)+，R，R+，Orn，Orn+，M，M+，N-甲酰-H，N-甲酰-H+，N-乙酰-H，N-乙酰-H+，N-異丙基-H，N-異丙基-H+，N-乙酰-K，N-乙酰-K+，P和P+。
也優(yōu)選上述類別修飾形式中的兩個(gè)組合的實(shí)施方案，還包括以下具體實(shí)施方案。
以下具體類似物是優(yōu)選的(H+)7-GLP-1(7-37)；(Y)7-GLP-1(7-37)；(N-乙酰-H)7-GLP-1(7-37)；(N-異丙基-H)7-GLP-1(7-37)；(A+)8-GLP-1(7-37)；(E+)9-GLP-1(7-37)；(D)9-GLP-1(7-37)；
(D+)9-GLP-1(7-37)；(F+)10-GLP-1(7-37)；(S)22(R)23(R)24(Q)26-GLP-1(7-37)；(S)8(Q)9(Y)16(K)18(D)21-GLP-1(7-37)；具有較高穩(wěn)定性的類似物的優(yōu)選形式也具有一個(gè)，或至多兩個(gè)氨基酸修飾。
7位組氨酸的優(yōu)選取代包括D型的酸性或中性氨基酸或D型組氨酸。優(yōu)選的是P+，D+，E+，Q+，L+，V+，I+和H+。
7位組氨酸或其取代形式(D或L)也可以是N烷基化(1-6C)或N酰基化(1-6C)。烷基是指定數(shù)目C的直鏈或支鏈(包括環(huán)狀)烴殘基。?；耐ㄊ綖镽CO-，其中R為烷基。優(yōu)選的烷基是t-丙基，α-丙基和乙基；優(yōu)選的?；且阴；捅；?。可以烷基化或?；膬?yōu)選殘基包括D或L型的P，D，E，N，Q，V，L，I，K和H。
8位組氨酸的優(yōu)選取代是D型P，V，L，I和A；也優(yōu)選D型D，E，N，Q，K，T，S和H。
某些特定的類似物同時(shí)具有較高的胰島素釋放刺激活性和較高的穩(wěn)定性。
用于本發(fā)明的一組優(yōu)選的GLP-1類似物和衍生物，由如下結(jié)構(gòu)式的分子及其可藥用的鹽組成R1-X-Glu-Gly10-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp15-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu20-Y-Gly-Gln-Ala-Ala25-Lys-Z-Phe-Ile-Ala30-Trp-Leu-Val-Lys-Gly35-Arg-R2(SEQ ID NO2)其中R1選自L-組氨酸，D-組氨酸，脫氨基組氨酸，2-氨基組氨酸，β-羥基組氨酸，高組氨酸，α-氟甲基組氨酸和α-甲基組氨酸；X選自丙氨酸，甘氨酸，纈氨酸，蘇氨酸，異亮氨酸和α-甲基丙氨酸；Y選自谷氨酸，谷氨酰胺，丙氨酸，蘇氨酸，絲氨酸和甘氨酸；Z選自谷氨酸，谷氨酰胺，丙氨酸，蘇氨酸，絲氨酸和甘氨酸；R2選自NH2，和甘氨酸-OH；還必須此化合物的等電點(diǎn)在大約6.0-9.0的范圍內(nèi)，并且進(jìn)一步要求當(dāng)R1是組氨酸，X是丙氨酸，Y是谷氨酸，以及Z是谷氨酸時(shí)，R2必須是NH2。
已公開了許多等電點(diǎn)范圍在約6.0到約9.0的GLP-1類似物和衍生物，包括例如GLP-1(7-36)NH2Gly8-GLP-1(7-36)NH2Gln9-GLP-1(7-37)D-Gly9-GLP-1(7-37)酰胺基-Lys9-GLP-1(7-37)Thr9-GLP-1(7-37)D-Thr9-GLP-1(7-37)Asn9-GLP-1(7-37)D-Asn9-GLP-1(7-37)Ser22-Arg23-Arg24-Gln26-GLP-1(7-37)Thr16-Lys18-GLP-1(7-37)Lys18-GLP-1(7-37)Arg23-GLP-1(7-37)Arg24-GLP-1(7-37)在WO 91/11457(與US 5,545,618相關(guān))中還公開了另一組可用于本發(fā)明的優(yōu)選活性化合物，包括GLP-1(7-34)，GLP-1(7-35)，GLP-1(7-36)，或GLP-1(7-37)，或者其酰胺形式，以及其可藥用的鹽，此化合物具有至少一種選自如下的修飾(a)以如下氨基酸之一取代位置26和/或位置34的賴氨酸甘氨酸，絲氨酸，半胱氨酸，蘇氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，酪氨酸，丙氨酸，纈氨酸，異亮氨酸，亮氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，精氨酸，或D-賴氨酸；或者以如下氨基酸之一取代位置36的精氨酸甘氨酸，絲氨酸，半胱氨酸，蘇氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，酪氨酸，丙氨酸，纈氨酸，異亮氨酸，亮氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，賴氨酸，或D-精氨酸；
(b)以抗氧化作用氨基酸取代位置31的色氨酸；(c)至少如下之一的取代以酪氨酸取代位置16的纈氨酸；以賴氨酸取代位置18的絲氨酸；以天冬氨酸取代位置21的谷氨酸；以絲氨酸取代位置22的甘氨酸；以精氨酸取代位置23的谷氨酰胺；以精氨酸取代位置24的丙氨酸，以及以谷氨酰胺取代位置26的賴氨酸；和(d)至少如下之一的取代以甘氨酸，絲氨酸，或半胱氨酸取代位置8的丙氨酸；以天冬氨酸，甘氨酸，絲氨酸，半胱氨酸，蘇氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，酪氨酸，丙氨酸，纈氨酸，異亮氨酸，亮氨酸，甲硫氨酸，或苯丙氨酸取代位置9的谷氨酸；以絲氨酸，半胱氨酸，蘇氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，酪氨酸，丙氨酸，纈氨酸，異亮氨酸，亮氨酸，甲硫氨酸，或苯丙氨酸取代位置10的甘氨酸；以及以谷氨酸取代位置15的天冬氨酸；和(e)以甘氨酸，絲氨酸，半胱氨酸，蘇氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，酪氨酸，丙氨酸，纈氨酸，異亮氨酸，亮氨酸，甲硫氨酸，或苯丙氨酸，或者組氨酸的D-或N-?；问交蛲榛问饺〈恢?的組氨酸；其中取代作用是(a)，(b)，(d)和(e)時(shí)，被取代的氨基酸可任選地是D-構(gòu)型，并且，在位置7被取代的氨基酸可以任選地是N-?；騈-烷基化形式。
因?yàn)槎幕?肽酶IV (DPP IV)可能與所觀察到的在體內(nèi)給予的GLP-1迅速失活有關(guān)[參見例如Mentlein，R.，et al.，Eur.J.Biochem.，214829-835(1993)]，所以優(yōu)選的是給予能抵抗DPP IV活性的GLP-1類似物和衍生物，更優(yōu)選的是給予Gly8-GLP-1(7-36)NH2，Val8-GLP-1(7-37)OH，α-甲基-Ala8-GLP-1(7-36)NH2，和Gly8-Gln21-GLP-1(7-37)OH，或者其可藥用的鹽。
把在美國(guó)專利5,188,666(′666)中要求專利保護(hù)的分子用于本發(fā)明也是優(yōu)選的。這種分子包括具有如下氨基酸序列之一的肽或該肽的衍生物NH2-His7-Ala-Glu-Gly10-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp15-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu20-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala25-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala30-Trp-Leu-Val-X(SEQ ID NO3)
其中，X可以是Lys和Lys-Gly；其中所述肽可以是該肽的可藥用的酸加成鹽；該肽的可藥用的羧酸鹽；該肽的可藥用的低級(jí)烷基酯；以及該肽的可藥用的酰胺，其選自酰胺，低級(jí)烷基酰胺，和低級(jí)二烷基酰胺。
發(fā)明′666涉及促胰島肽片段，其衍生自天然存在的氨基酸序列。
本發(fā)明包括選自以下的化合物A.包括以下序列的肽His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-X其中X選自(a)Lys，(b)Lys-Gly，(c)Lys-Gly-Arg；和B.該肽的衍生物；其中該化合物基本無天然污染物，具有超過GLP-1(1-36)或GLP-1(1-37)的促胰島活性。
本發(fā)明還包括選自以下的化合物A.包括以下序列的肽His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-X其中X選自(a)Lys，(b)Lys-Gly，(c)Lys-Gly-Arg；和B.該肽的衍生物；其中該化合物基本無天然污染物，在濃度至少為10-10M時(shí)具有促胰島活性。
尤為關(guān)注的是具有以下通式的肽(1)H2N-X-CO-R1其中，R1為OH，OM或-NR2R3；M為可藥用的陽離子或低級(jí)分支或不分支烷基；R2和R3相同或不同，選自氫和低級(jí)分支或不分支烷基；X為包括以下序列的肽His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg
NH2為X氨基末端的氨基；CO為X羧基末端的羰基；(2)其酸加成鹽；和(3)其保護(hù)或部分保護(hù)的衍生物；其中，所述化合物具有超過GLP-1(1-36)或GLP(1-37)的促胰島活性。
另一組用于本發(fā)明的優(yōu)選分子，由在美國(guó)專利5,512,549中要求專利保護(hù)的化合物及其可藥用的鹽組成，這些化合物具有如下通式
其中R1可以是4-咪唑丙?；?，4-咪唑乙酰基，或4-咪唑-a，a二甲基-乙?；籖2可以是無分支鏈C6-C10酰基，或者不存在；R3可以是Gly-OH或NH2；Xaa是Lys或Arg。
用于本發(fā)明更優(yōu)選的SEQ ID NO4化合物，是那些其中Xaa是Arg，R2是無分支鏈C6-C10?；幕衔铩?br> 用于本發(fā)明高度優(yōu)選的SEQ ID NO4化合物，是那些其中Xaa是Arg，R2是無分支鏈C6-C10酰基，R3是Gly-OH的化合物。
用于本發(fā)明更高度優(yōu)選的SEQ ID NO4化合物，是那些其中Xaa是Arg，R2是無分支鏈C6-C10?；?，R3是Gly-OH，并且R1是4-咪唑丙?；幕衔?。
用于本發(fā)明最優(yōu)選的SEQ ID NO4化合物，是其中Xaa為Arg，R2是無分支鏈C8?；琑3是Gly-OH，R1是4-咪唑丙酰基的化合物。
把在美國(guó)專利5,120,712中要求專利保護(hù)的分子用于本發(fā)明是高度優(yōu)選的。這種分子包括具有如下氨基酸序列的肽，以及該肽的衍生物NH2-His7-Ala-Glu-Gly10-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp15-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu20-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala25-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala30-Trp-Leu-Val-Lys-
Gly35-Arg-Gly37-OH(SEQ ID NO1)其中所述肽可以是該肽的可藥用的酸加成鹽，該肽的可藥用的羧酸鹽；該肽的可藥用的低級(jí)烷基酯；或該肽的可藥用的酰胺，其中酰胺可以是酰胺，低級(jí)烷基酰胺，或低級(jí)二烷基酰胺。
將GLP-1(7-36)酰胺，或其可藥用的鹽用于本發(fā)明是最高度優(yōu)選的。GLP-1(7-36)的氨基酸序列是NH2-His7-Ala-Glu-Gly10-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp15-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu20-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala25-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala30-Trp-Leu-Val-Lys-Gly35-Arg-NH2(SEQ ID NO5)將Val8-GLP-1(7-37)OH，或其可藥用的鹽用于本發(fā)明是最高度優(yōu)選的。Val8-GLP-1(7-37)OH的氨基酸序列是NH2-His7-Val-Glu-Gly10-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp15-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu20-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala25-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala30-Trp-Leu-Val-Lys-Gly35-Arg-Gly37-OH(SEQ ID NO6)化合物的制備制備用于本發(fā)明的活性化合物的方法，即GLP-1，GLP-1類似物，或GLP-1衍生物，或任何包括外周給藥時(shí)有效減輕體重的活性片段的相關(guān)化合物的方法是熟知的，并在美國(guó)專利5,118,666，5,120,712，和5,523,549中已有描述。
用于本發(fā)明的活性化合物的氨基酸部分，或者其前體部分，可通過如下幾種方法制備1>固相化學(xué)合成法，2>從天然來源的GLP分子純化，或者3>采用重組DNA技術(shù)，或4>上述方法的組合。
多肽的固相化學(xué)合成法是本領(lǐng)域熟知的，可以在一般教科書的范圍內(nèi)找到，例如Dugas和Penney 1981；Merrifield 1962；Stewart和Young 1969。
例如，氨基酸部分可使用430A肽合成儀(PE-Applied Biosystems，Inc.，850 Lincoln Center Drive，F(xiàn)oster City，CA94404)，通過固相法合成，合成循環(huán)由PE-Applied Biosystems提供。BOC-氨基酸的其它試劑可從PE-Applied Biosystems和其它化學(xué)試劑商店購得。為了生成C-末端的氨甲酰，采用雙偶聯(lián)方案的順序Boc化學(xué)法用于起始的對(duì)-甲基二苯甲基胺樹脂。為了生成C-末端的酸，可使用相應(yīng)的PAM樹脂。使用預(yù)先形成的羥基苯并三唑酯，可偶聯(lián)天冬酰胺，谷氨酰胺和精氨酸。可使用如下的側(cè)鏈保護(hù)基精氨酸，甲苯磺酰基天冬氨酸，環(huán)己基谷氨酸，環(huán)己基絲氨酸，芐基蘇氨酸，芐基酪氨酸，4-溴芐氧羰基Boc去保護(hù)可在二氯甲烷中用三氟乙酸來實(shí)現(xiàn)。合成完成之后，可用含有10％間-甲酚的無水氫氟酸(HF)，使肽去保護(hù)，并從樹脂上斷裂下來。側(cè)鏈保護(hù)基的斷開，以及肽與樹脂斷開是在-5℃-5℃下進(jìn)行，優(yōu)選地是在冰浴上持續(xù)60分鐘。除去HF之后，用乙醚洗肽和樹脂，然后用冰醋酸抽提出肽，并冷凍干燥。
還可采用重組DNA技術(shù)領(lǐng)域中普通技術(shù)人員熟知的技術(shù)，制備用于本發(fā)明的活性化合物。實(shí)際上，由于其較高的產(chǎn)率，重組DNA法可能更優(yōu)越。重組體生產(chǎn)過程的基本步驟是a). 分離編碼本發(fā)明GLP-1分子的天然DNA序列，或者構(gòu)建一個(gè)合成或半合成的GLP-1分子DNA編碼序列，b). 將此編碼序列以適合于表達(dá)單獨(dú)的蛋白質(zhì)或融合蛋白質(zhì)的方式放入一種表達(dá)載體中，c). 用此表達(dá)載體轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)恼婧嘶蛟怂拗骷?xì)胞，
d). 在將允許表達(dá)GLP-1分子的條件下培養(yǎng)此轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，以及e). 回收和純化重組產(chǎn)生的GLP-1分子。
如以前所述，此編碼序列可能是全合成的，或者是較大的，天然編碼胰高血糖素的DNA修飾產(chǎn)物。在Lund et al.1982中報(bào)導(dǎo)了編碼前胰高血糖素原的DNA序列，通過將其天然序列改變成所需的序列，它可以被用作半合成產(chǎn)物的起始原料。
可以借助于本領(lǐng)域熟知的技術(shù)構(gòu)建合成基因，使之在體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄和翻譯，生成GLP-1分子產(chǎn)物。由于遺傳密碼的天然簡(jiǎn)并性，技術(shù)人員將意識(shí)到，可能需要構(gòu)建相當(dāng)大量而限定數(shù)量的DNA序列，它們都能編碼本發(fā)明的GLP-1分子。
合成基因的構(gòu)建法是本領(lǐng)域熟知的(Brown，et al.1979)?？蓱?yīng)用遺傳密碼，根據(jù)所需要的氨基酸序列設(shè)計(jì)這種DNA序列。普通的生物學(xué)技術(shù)人員都易探明這種設(shè)計(jì)。一旦設(shè)計(jì)完成，此序列本身可用常規(guī)的DNA合成儀如380A型或380B型DNA合成儀(PE-Applied Biosystems，Inc.，850 Lincoln Center Drive，F(xiàn)oster City，CA 94404)來產(chǎn)生。
為了表達(dá)用于本發(fā)明的化合物的氨基酸部分，可通過使用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切核酸酶，將工程化的合成DNA序列插入多種適當(dāng)?shù)闹亟MDNA表達(dá)載體中的任何一種(Maniatis et al.，1989)。可將限制性內(nèi)切核酸酶的作用位點(diǎn)，設(shè)計(jì)在編碼GLP-1分子的DNA的二端，以便于分離，并便于整合進(jìn)入，擴(kuò)增和表達(dá)本領(lǐng)域熟知的載體。所采用的特定內(nèi)切核酸酶將由限制性內(nèi)切核酸酶對(duì)使用的原代表達(dá)載體的切割方式來確定。選擇限制性位點(diǎn)，以便使此編碼序列與各調(diào)控序列正確定向，從而達(dá)到適當(dāng)?shù)目騼?nèi)讀碼，并表達(dá)所需要的蛋白質(zhì)。必須使此編碼序列定位在適當(dāng)?shù)淖x框內(nèi)，此讀框帶有表達(dá)載體的啟動(dòng)子和核糖體結(jié)合位點(diǎn)，它們二者在表達(dá)此蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞內(nèi)都具有功能。
為了使此合成基因?qū)崿F(xiàn)有效的轉(zhuǎn)錄，必須使它與啟動(dòng)子操縱基因區(qū)有效地相結(jié)合。因此，可將此合成基因的啟動(dòng)子-操縱基因區(qū)置于與合成基因的ATG起始密碼子相同順序的取向。
本領(lǐng)域已熟知多種可用于轉(zhuǎn)化原核細(xì)胞和真核細(xì)胞的表達(dá)載體(Promega目錄，1992；Stratagene目錄，1992)。還有美國(guó)專利4,710,473描述了幾種可用于在大腸桿菌中高水平表達(dá)外源性基因的環(huán)形DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化載體。這些質(zhì)?？稍谥亟MDNA程序中用作轉(zhuǎn)化載體，并且(a)可使此質(zhì)粒具有在宿主細(xì)胞內(nèi)自主復(fù)制的能力，(b)可在維持宿主細(xì)胞培養(yǎng)物的溫度下控制質(zhì)粒自主復(fù)制，(c)可使此質(zhì)粒穩(wěn)定地保留在宿主細(xì)胞群內(nèi)，(d)可指導(dǎo)合成指示質(zhì)粒在宿主細(xì)胞群內(nèi)保存的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，(e)可順序地提供該質(zhì)粒單一的限制性內(nèi)切核酸酶識(shí)別位點(diǎn)，以及(f)可終止mRNA轉(zhuǎn)錄。這些環(huán)形DNA質(zhì)?？稍跒楂@得高水平外源性基因表達(dá)的重組DNA程序中用作載體。
在完成構(gòu)建用于本發(fā)明化合物的氨基酸部分的表達(dá)載體之后，下一步是將此載體置于適當(dāng)?shù)募?xì)胞中，從而構(gòu)建一種可用于表達(dá)多肽的重組宿主細(xì)胞。用于以重組DNA載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的，可以如Maniatis，et al.，同上的這樣一些綜合文獻(xiàn)中找到。宿主細(xì)胞可由真核細(xì)胞或原核細(xì)胞構(gòu)建。
原核宿主細(xì)胞通常以較高的速度產(chǎn)生蛋白質(zhì)，并較易培養(yǎng)。在高水平細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的蛋白質(zhì)，特征性地凝聚成顆?；虬w，其中含有高濃度超量表達(dá)蛋白質(zhì)。對(duì)這種蛋白質(zhì)凝集物，一般都必須用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)回收，溶解，變性和重折疊(Kreuger et al.，1990和美國(guó)專利4,923,967)。GLP-1類似物和衍生物的制備為了產(chǎn)生所需的GLP-1類似物或GLP-1衍生物，或其活性片段，對(duì)前體GLP-1或GLP-1類似物氨基酸序列的改變可通過已知的方法制備GLP-1前體的化學(xué)修飾，酶修飾，或者化學(xué)和酶修飾的組合。經(jīng)典的溶液相技術(shù)和半合成技術(shù)對(duì)于制備用于本發(fā)明的GLP-1分子，也可能是有用的。制備本發(fā)明GLP-1分子的方法，對(duì)于普通的肽化學(xué)技術(shù)人員是熟知的。
用本領(lǐng)域已知的多種方法中的任何一種，可實(shí)現(xiàn)將?；尤隠ys34的ε-氨基(Bioconjugate Chem.1990；Hashimoto et al.，1989)。
例如，使用在硼酸鹽緩沖液中配制的50％乙腈，可將辛酸的N-羥基-琥珀酰亞胺酯，加到賴氨酰-ε-胺中?？稍诩尤脒溥蚧埃蚣尤胫髮⒋穗孽；?。而且，如此肽是通過重組技術(shù)制備的，就可能在酶促斷裂之前?；?。如在WO 96-29342中所描述的，GLP-1衍生物中的賴氨酸也可以被?；?。
本領(lǐng)域?qū)Χ喾N被保護(hù)、未被保護(hù)和部分被保護(hù)的，天然的和非天然的GLP-1(7-36)酰胺和GLP-1(7-37)分子的功能性類似物和衍生物的存在和制備法已有論述[美國(guó)專利5,120,712；5,545,618和5,118,666；Orskov et al.，1989；WO 91/11457]。
任選地，可以保護(hù)GLP-1衍生物的氨基端和羧基端氨基酸殘基，或者任選地僅保護(hù)其中一端。形成和除去這種保護(hù)基的反應(yīng)在本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的著作中已有論述，包括例如“有機(jī)化學(xué)中的保護(hù)基”，1973；Green1981；Schroder和Lubke 1965。代表性的氨基保護(hù)基包括例如甲?；阴；?，異丙基，丁氧羰基，芴基甲氧羰基，芐氧羰基等。代表性的羧基保護(hù)基包括例如芐基酯，甲基酯，乙基酯，叔-丁基酯，對(duì)-硝基苯基酯等。
用于本發(fā)明的羧基末端低級(jí)烷基酯GLP-1衍生物，可通過在催化性酸如鹽酸存在下，使所需的(C1-C4)鏈烷醇與所需的多肽反應(yīng)來制備。這種烷基酯形成的適當(dāng)條件包括約50℃的反應(yīng)溫度，以及大約1-3小時(shí)的反應(yīng)時(shí)間。相似條件下，可形成天冬氨酸和/或谷氨酸殘基的烷基酯衍生物。
例如，按Stewart et al.，1984中所述的方法，可制備用于本發(fā)明化合物的氨甲酰衍生物。
GLP-1，GLP-1類似物或GLP-1衍生物的可藥用的鹽形式可用于本發(fā)明。通常用于形成酸加成鹽的酸可以是無機(jī)酸如鹽酸，氫溴酸，氫碘酸，硫酸，磷酸等，以及有機(jī)酸如對(duì)-甲苯磺酸，甲磺酸，草酸，對(duì)-溴苯磺酸，碳酸，琥珀酸，檸檬酸，苯甲酸，乙酸等。這類鹽的實(shí)例包括硫酸鹽，焦硫酸鹽，硫酸氫鹽，亞硫酸鹽，亞硫酸氫鹽，磷酸鹽，一氫磷酸鹽，二氫磷酸鹽，偏磷酸鹽，焦磷酸鹽，氫化物，溴化物，碘化物，乙酸鹽，丙酸鹽，癸酸鹽，辛酸鹽，丙烯酸鹽，甲酸鹽，異丁酸鹽，己酸鹽，康酸鹽，丙炔酸鹽，草酸鹽，丙二酸鹽，琥珀酸鹽，辛二酸鹽，癸二酸鹽，富馬酸鹽，馬來酸鹽，丁炔-1，4-二酸鹽，乙烯-1，6-二酸鹽，苯甲酸鹽，氯苯甲酸鹽，甲基苯甲酸鹽，二硝基苯甲酸鹽，羥基苯甲酸鹽，甲氧基苯甲酸鹽，鄰苯二甲酸鹽，磺酸鹽，二甲苯磺酸鹽，苯乙酸鹽，苯丙酸鹽，苯丁酸鹽，檸檬酸鹽，乳酸鹽，γ-羥基丁酸鹽，乙醇酸鹽，酒石酸鹽，甲磺酸鹽，丙磺酸鹽，萘-1-磺酸鹽，萘-2-磺酸鹽，扁桃酸鹽等。優(yōu)選的酸加成鹽是那些與無機(jī)酸如鹽酸和氫溴酸，特別是鹽酸形成的鹽。
堿加成鹽包括那些從無機(jī)堿生成的鹽如銨或者堿金屬或堿土金屬的氫氧化物，碳酸鹽，碳酸氫鹽等。因此，可用于制備本發(fā)明鹽的堿包括氫氧化鈉，氫氧化鉀，氫氧化銨，碳酸鉀等。這類鹽形式是特別優(yōu)選的。
用于本發(fā)明的GLP-1，GLP-1類似物或GLP-1衍生物，在用于本發(fā)明之前，可以用一種或幾種賦形劑形成制劑。例如，可將用于本發(fā)明的活性化合物，通過熟知的方法與二價(jià)金屬陽離子絡(luò)合。此類金屬陽離子包括例如Zn++，Mn++，F(xiàn)a++，Co++，Cd++，Ni++，等。本發(fā)明的組合物任選地，用于本發(fā)明的活性化合物還可以用可藥用的緩沖劑混合，調(diào)節(jié)pH以便提供必要的穩(wěn)定性，以及使其pH適合于非腸道給藥。
還可任選地加入一種或幾種可藥用的抗微生物劑。偏-甲氧甲酚和苯酚是優(yōu)選的可藥用的抗微生物劑。還可以加入一種或幾種可藥用的鹽，以便調(diào)節(jié)其離子強(qiáng)度或張力。并可加入一種或幾種賦形劑，以便進(jìn)一步調(diào)節(jié)本制劑的等張性。甘油是等張性調(diào)節(jié)賦形劑的一個(gè)實(shí)例。
GLP-1受體和由配體與GLP-1受體結(jié)合起始的信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)在WO 96/25487中已有敘述；Thorens，1992；Thorens et al.，1993；Widmann etal.，1994。GLP-1受體是一種膜蛋白，具有7個(gè)跨膜區(qū)，與異源三聚體G蛋白偶聯(lián)，所述G蛋白通過配體結(jié)合產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)二級(jí)信使，特別是環(huán)腺苷單磷酸(cAMP)，與受體激活聯(lián)系。cAMP則激活特定蛋白激酶cAMP依賴的蛋白激酶(蛋白激酶A，PKA)。這種酶使多種存在于某些基因的啟動(dòng)子區(qū)的關(guān)鍵應(yīng)答元件磷酸化。在胰腺b細(xì)胞和其它神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞中，調(diào)控分泌途徑的某些特定蛋白的磷酸化通過刺激分泌顆粒的胞吐作用刺激肽分泌。
已知多種化合物可刺激內(nèi)源GLP-1的分泌。例如，STC-1細(xì)胞暴露于某些促分泌素如腺苷酸環(huán)化酶激活物毛猴素或蛋白激酶C刺激物12-O-四癸酰佛波醇-13-乙酸酯(TPA)，引起GLP-1釋放的明顯增加(Abello et al.，1994)。STC-1細(xì)胞系源自攜帶促胰島素癌基因的轉(zhuǎn)基因小鼠的腸腫瘤，已知STC-1細(xì)胞含有胰高血糖素原的mRNA轉(zhuǎn)錄本，由其產(chǎn)生GLP-1。已知其它化合物如促生長(zhǎng)素抑制素，胃抑制性多肽，葡萄糖依賴性促胰島肽，蛙皮素，降鈣素基因相關(guān)肽，胃泌素釋放肽，膽堿能激動(dòng)劑，b腎上腺能激動(dòng)劑，異丙基腎上腺素，和毒蠅堿膽堿能激動(dòng)劑，烏拉膽堿，同樣引起內(nèi)源GLP-1釋放(Plaisancie et al.，1994；Orskov et al.，1986；Brubaker，1991；Buchan，et al.，1987)。組合物的給藥可以通過普通醫(yī)生認(rèn)為有效的任何途徑給藥，但非腸道給藥直接進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)不是本發(fā)明教導(dǎo)或要求保護(hù)的途徑。優(yōu)選的是外周，非腸道給藥。在醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)中非腸道給藥通常理解為，借助于無菌注射器或某種其它醫(yī)療設(shè)備如輸注泵，將一種劑型的藥劑注射進(jìn)入體內(nèi)。為本發(fā)明目的，外周非腸道途徑包括靜脈內(nèi)、肌肉、皮下、腹膜內(nèi)給藥途徑。對(duì)用于本發(fā)明的化合物，較優(yōu)選的是靜脈內(nèi)，肌肉和皮下給藥途徑。對(duì)用于本發(fā)明的化合物，更高度優(yōu)選的是靜脈內(nèi)和皮下給藥途徑。為了非腸道給藥，優(yōu)選的是將用于本發(fā)明的活性化合物，與適當(dāng)pH的蒸餾水組合。
用于本發(fā)明有效減輕體重的某些化合物也可通過口服，直腸，鼻腔或下呼吸道途徑給藥，這也是非腸道途徑。所述的非腸道途徑中，下呼吸道途徑對(duì)用于本發(fā)明的肽的給藥是優(yōu)選的。通過下呼吸道途徑給藥的肽化合物的各種制劑公開于美國(guó)專利5,284,656和5,364,838。WO 96/19197公開了可促進(jìn)用于本發(fā)明的化合物的下呼吸道吸收的各種肽的氣霧劑。對(duì)用于本發(fā)明的化合物，口服給藥途徑是優(yōu)選的。
另一些藥劑學(xué)方法可用于控制作用的持續(xù)時(shí)間。通過使用聚合物混合或吸附用于本發(fā)明的活性化合物，可獲得控制釋放的制劑。為了延長(zhǎng)釋放時(shí)間，通過選擇適當(dāng)?shù)拇蠓肿?，并選擇大分子的濃度，以及摻入的方法，可得到適當(dāng)?shù)某掷m(xù)時(shí)間，適當(dāng)?shù)拇蠓肿影ɡ?，聚酯，聚氨基酸，聚乙烯吡咯烷酮，乙烯醋酸乙烯酯，甲基纖維素，羧甲基纖維素，或硫酸精蛋白。另一種通過控制釋放制劑而延長(zhǎng)作用持續(xù)時(shí)間的可能方法是，將用于本發(fā)明的活性化合物摻入聚合物材料如聚酯，聚氨基酸，水凝膠，聚(乳酸)或乙烯醋酸乙烯酯共聚體的微粒中。另一種方法不是將化合物摻入這些聚合物微粒，可能是將用于本發(fā)明的化合物捕獲進(jìn)入例如通過凝聚技術(shù)或通過界面聚合作用制備的微囊中，例如分別進(jìn)入羧甲基纖維素或明膠微囊中，或者捕獲進(jìn)入膠體藥物投遞系統(tǒng)例如脂質(zhì)體，白蛋白微球，微乳劑粒，毫微顆粒，及毫維小囊中，或者捕獲進(jìn)入大乳劑粒中。這些技術(shù)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的，在如《雷明頓制藥科學(xué)》(1980)中已公開。劑量可使具體受試者減輕體重的GLP-1，GLP-1類似物，或GLP-1衍生物，或活性片段的劑量，將取決于多種因素，其中包括，受試者的性別，體重和年齡，肥胖的根本原因，給藥途徑和生物有效度，所給予化合物在體內(nèi)保持時(shí)間，制劑，以及藥效。在斷續(xù)給藥的情況下，每次給藥的劑量應(yīng)該考慮到給藥的間隔時(shí)間，所給予化合物的生物有效度。在持續(xù)給藥的情況下，適當(dāng)?shù)膭┝克俣葹?.25-6pmol/kg/min，優(yōu)選地為約0.5-1.2pmol/kg/min。確定含GLP-1，GLP-1類似物，或GLP-1衍生物，或其活性片段的組合物的給藥劑量和速度，以獲得理想的臨床效果，即減輕體重，在普通醫(yī)生的能力范圍之內(nèi)。
“可藥用的”意為適合向人給藥，即不含毒性成分，不希望有的污染物等，并不干擾活性化合物的活性。
通過參考具體的實(shí)施例，更容易理解本發(fā)明，提供這些實(shí)施例，僅為了說明，而不是限制本發(fā)明。
實(shí)施例14名非胰島素依賴性糖尿病(NIDDM)患者(3名男性，一名女性；年齡60.2±1.8歲；起始BMI33.5±1.4kg/m2；起始體重97.5±6.5kg；起始腰/臀比0.946±0.036；起始HbAlc7.1±0.3％；禁食血糖7.2±1.1mM)接受連續(xù)的GLP-1(7-36)酰胺的皮下輸注，共4周。GLP-1溶液的制備方法如下合并100nmol GLP-1(7-36)酰胺和0.025mL人白蛋白溶液(20％)，然后用5摩爾乙酸調(diào)節(jié)pH為4，最后加入生理鹽水至1mL。以1.2pmol/kg/min的劑量速度給予GLP-1溶液。用于GLP-1給藥的Minimed泵(Minimed Europe，Paris)的體積輸注速率為0.05-0.07mL/h。皮下給藥的部位是腹部。
這種GLP-1治療在GLP-1輸注前后分別與兩周的強(qiáng)化胰島素治療相比。在胰島素治療期間，每次進(jìn)食之前皮下注射胰島素(見表1)。在GLP-1輸注期間，不給予胰島素。在兩次胰島素治療期間，以及GLP-1治療期間，患者進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)糖尿病飲食，其由(基于熱量)大約55％碳水化合物，30％脂肪和15％蛋白質(zhì)組成。無運(yùn)動(dòng)安排?；颊卟蛔≡?，整個(gè)試驗(yàn)期間均為門診病人。
GLP-1治療期間，四名患者體重平均減輕3.5±1.2kg，而在頭兩周強(qiáng)化胰島素治療期間，體重僅減輕1.3±0.6kg，而在第二次強(qiáng)化胰島素治療期間，體重平均還有所增加。所有數(shù)值均為個(gè)人數(shù)值，或均值±SEM(均值標(biāo)準(zhǔn)誤)。第二次胰島素治療期間未得到患者M(jìn)P數(shù)據(jù)。
表1. 胰島素治療方案。4個(gè)值代表每日4次進(jìn)食前每名患者皮下給予(IU)胰島素的量。第一次胰島素治療在前，第二次胰島素治療在4周GLP-1治療之后患者 第一次胰島素治療(2周)第二次胰島素治療(2周)VN 47，39，35，53 21，20，28，26NW 12，13，11，12 11，10，12，12HF 11，10，12，56 11，10，12，12MP 20，14，34，30 -表2. 患者體重和體重變化。在兩次強(qiáng)化胰島素治療之間總共4周，GLP-1(7-36)酰胺通過連續(xù)皮下輸注給藥患者體重(kg)體重變化(kg)患者 初始第一次胰GLP-1治 第二次胰 第一次胰 GLP-1治 第二次胰島素治療 療4周 島素治療 島素治療療4周島素治療2周 2周 2周 2周VN 101.5 99.0 92.0 95.0 -2.5 -7.0 3.0NW 113.0 111.0 108.0 108.0 -2.0 -3.0 0.0HF 94.0 93.5 91.5 91.5 -0.5 -2.0 0.0MP 82.0 81.9 80.0 --0.1 -1.9-97.5±6.5 96.4±6.0 92.9±5.8 98.2±5.0 -1.3±0.6 -3.5±1.2 +1.0±1.0參考文獻(xiàn)以下引用的文獻(xiàn)提供了對(duì)實(shí)施本發(fā)明有用的信息；美國(guó)專利供在美國(guó)參考。Abello，J.，et al.，Endocrinol.1342011-2017(1994)美國(guó)糖尿病協(xié)會(huì)，糖尿病中脂紊亂的檢測(cè)和控制，一致聲明，Diabetes Care1886-93(1995)美國(guó)糖尿病協(xié)會(huì)，糖尿病患者的醫(yī)療護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)，一致聲明，Diabetes Care188-15(1995)Billock，B.P.，et al.，Endocrinology 1372968-2978(1996)Bioconjugate Chem.“蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾歷史和應(yīng)用”1，2-12(1990)Brown，et al.酶學(xué)方法，Academic Press，N.Y.，68109-151(1979)Brubaker，P.L.Endocrinlo.1283175-3182(1991)Buchan，A.M.J.，et al.，Gastroenterol.93791-800(1987)Dugas，H.and Penny，C.，“生物有機(jī)化學(xué)”Springer-Verlag，New York，pp.54-92(1981)Fehmann，H.-C.，et al.，Endocrinology 130159-166(1992)Fehmann，H.-C.，et al.，Endocr.Rev.16390-410(1995)Green，T.H.，“有機(jī)合成中的保護(hù)基團(tuán)”，Wiley，New York(1981)Gutniak M.，et al.，New England J.Med.3261316-1322(1992)Hashimoto et al.，Pharmaceutical Res.6(2)171-176(1989)Kanse，S.M.，et al.，F(xiàn)EBS Lett.241209-212(1988)Krcymann B.，et al.，Lancet 21300-1303(1987)Krcymann B.，et al.，Brain Research 502325-331(1989)Kreuger，et al.見“蛋白質(zhì)折疊”Gierasch and King編，pp136-142，美國(guó)科學(xué)促進(jìn)會(huì)出版物89-18S，Washington，D.C.(1990)Lund，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.79345-349(1982)Manistis et al.，“分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)”冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，N.Y.，Vol1-3(1989)Mentlein，R.，et al.，Eur.J.Biochem.，214829-835(1993)Merrifield，J.M.，Chem.Soc.，852149(1962)Mojsov，S.，et al.，J.Biol.Chem.26111880-11889(1986)Mojsov，S.，et al.，Int.J.Peptide Protein Research，40333-343(1992)Morley，J.E.，Endocr.Rev.8256-287(1987)Nauck，M.A.et al.，J.Clin.Invest.91301-307(1993)Nilsson，O.，et al.，Endocrinol.129139-148(1991)Oben，J.，et al.，J Endocrinol.130267-272(1991)Orskov，C.，et al.，Endocrinol.1191467-1475(1986)Orskov，C.，et al.，J.Biol.Chem.264(22)12826-12829(1989)Orskov，C.，et al.，Iiabetologia 38(Suppl.1，Abstract)A39(1995)Orskov，C.，et al.，Diabetes 45832-835(1996)O′Shea，et al.，NeuroReport 7830-832(1996)Plaisancie，P.，et al.，Endocrinol.1352398-2403(1994)Promega生物研究產(chǎn)品目錄，Promega Corp.，2800 Woods Hollow Road，Madison，WI，53711-5399(1992)“有機(jī)化學(xué)中的保護(hù)基團(tuán)”，Plenum Press，London & New York(1973)雷明頓制藥科學(xué)(1980)Rowland，N.E.，et al.，Nutrition 12626-639(1996)Ruiz-Grande，C.，et al.，Peptides 1313-16(1992)Schroder and Lubke，“肽”Vol.I，Academic Press London & New York(1965)Stewart and Young，“固相肽合成”，F(xiàn)reeman，San Francisco pp.24-66(1966)Stewart，J.M.，et al.，“固相肽合成”，Pierce Chemical Company Press，(1984)Stratagene克隆系統(tǒng)目錄，Stratagene Corp.，11011 North Torrey Pines Road，La Jolla，CA，92037(1992)Suzuki，S.，et al.，Endocrinol.，1253109-3114(1989)Thorens，B.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 898641-8645(1992)Thorens，B.，et al.，Diabetes 421678-1682(1993)Turton，M.D.，et al.，Nature 37969-72(1996)美國(guó)專利4,710,473美國(guó)專利4,923,967美國(guó)專利5,118,666美國(guó)專利5,120,712美國(guó)專利5,284,656美國(guó)專利5,364,838美國(guó)專利5,512,549美國(guó)專利5,523,549美國(guó)專利5,545,618Valverde，I.，et al.Endocrinology 13275-79(1993)Villanueva，M.L.，et al.，Diabetologia 371163-1166(1994)Widmann，C.，et al.，Mol.Pharmacol.451029-1035(1994)WO 91/11457(Bickley，D.I.，et al，1991-8-8)WO 96/19197WO 96/25487(Thorens，B.et al.，1996-8-22)WO 96/29342WO 97/31943(Thim，L.et al.，1997-9-4)
權(quán)利要求
1.包含胰高血糖素樣肽1或其類似物或衍生物的組合物在減輕體重方面的用途。
2.包含胰高血糖素樣肽1或其類似物或衍生物的組合物在制備治療肥胖的藥物中的用途。
3.減輕體重的方法，包括向受試者給予包含選自以下化合物的組合物GLP-1，GLP-1類似物，GLP-1衍生物，GLP-1受體激動(dòng)劑，GLP-1信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)激動(dòng)劑，刺激內(nèi)源GLP-1合成的化合物，刺激內(nèi)源GLP-1釋放的化合物和其可藥用的鹽，其劑量足以導(dǎo)致體重減輕。
4.權(quán)利要求3的方法，其中組合物選自GLP-1，GLP-1類似物，GLP-1衍生物和其可藥用的鹽。
5.權(quán)利要求3的方法，其中組合物的給藥方法是外周非腸道途徑。
6.權(quán)利要求5的方法，其中組合物的給藥方法是靜脈內(nèi)給藥。
7.權(quán)利要求6的方法，其中組合物的給藥方法是皮下給藥。
8.權(quán)利要求3，5，6或7的方法，其中給藥是連續(xù)的。
9.權(quán)利要求8的方法，其中組合物的給藥速率是0.25-6pmol/kg/min。
10.權(quán)利要求8的方法，其中組合物的給藥速率是0.6-2.4pmol/kg/min。
11.權(quán)利要求6的方法，其中靜脈內(nèi)給藥是斷續(xù)的。
12.權(quán)利要求3的方法，其中化合物是GLP-1(7-36)酰胺或其可藥用的鹽。
13.權(quán)利要求3的方法，其中給予的化合物是Val8-GLP-1(7-37)OH或其可藥用的鹽。
14.減輕體重的方法，包括向受試者給予包含選自以下化合物的組合物GLP-1受體激動(dòng)劑，GLP-1信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)激動(dòng)劑，刺激內(nèi)源GLP-1合成的化合物，刺激內(nèi)源GLP-1釋放的化合物和其可藥用的鹽，其劑量足以導(dǎo)致體重減輕。
15.用于減輕體重的組合物，所述組合物包括胰高血糖素樣肽1或其類似物，衍生物或活性片段。
全文摘要
本發(fā)明涉及GLP－1,GLP－1類似物或GLP－1衍生物等胰高血糖素樣肽在減輕體重的方法和組合物中的用途。
文檔編號(hào)A61K38/26GK1242707SQ97181232
公開日2000年1月26日 申請(qǐng)日期1997年11月4日 優(yōu)先權(quán)日1996年11月5日
發(fā)明者R·D·蒂馬赤, S·埃芬迪克 申請(qǐng)人:伊萊利利公司