專利名稱：人精子特異性轉(zhuǎn)移因子口服制劑及其制備工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及人精子特異性轉(zhuǎn)移因子口服制劑及其制備工藝。
背景技術(shù)：
隨著人口的不斷增長，許多國家都制定和頒布了適合本國國情的計(jì)劃生育政策以控制人口的增長速度，在此背景下，節(jié)育或避孕成為人們研究的熱點(diǎn)課題之一。傳統(tǒng)的措施由于存在許多弊端而受到人們的排斥和反對，如避孕環(huán)由于容易脫落、結(jié)扎造成人體損傷、避孕藥具有副作用、避孕套影響感覺等。于是，研究一種無損傷、可復(fù)性的避孕產(chǎn)品成為當(dāng)代人迫切的需要，免疫避孕的理念隨之產(chǎn)生，并迅速成為生殖與避孕領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。目前，研究者根據(jù)存在于生殖系統(tǒng)的多種抗原，已經(jīng)研制出許多避孕疫苗。SP-10是一種特異性表達(dá)于睪丸組織的蛋白，定位于精子頂體內(nèi)膜和赤道區(qū)域，可能參與頂體反應(yīng)和精卵結(jié)合。Kurth等利用重組SP-10蛋白抗原免疫雌性狒狒、短尾猴，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其生殖道和血清中均產(chǎn)生高滴度的特異性抗體，體外實(shí)驗(yàn)顯示該抗體可特異性的與精子頂體的SP-10結(jié)合，干擾精卵融合。人精子上有一種與精卵融合有關(guān)的免疫球蛋白超家族蛋白(Izumo),Naz等將抗人Izumo抗體與倉鼠精子共孵育，再將孵育后的精子與鼠卵融合，結(jié)果發(fā)生精卵融合障礙，接種Izumo蛋白的雌鼠生殖道和血清中也會產(chǎn)生高滴度的抗體，使得其生育力下降。Eppin蛋白是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種可由睪丸和附睪分泌的特異性蛋白，可通過特異性位點(diǎn)結(jié)合于精子表面，參與調(diào)控精液液化和精子運(yùn)動。體外實(shí)驗(yàn)表明抗Eppin抗體會干擾PSA對精囊凝固蛋白的水解，導(dǎo)致精液固化異常，影響精子前向運(yùn)動和結(jié)合卵細(xì)胞，故可作為避孕的候選疫苗。除此之外，還有針對P18、LDH-C4、SPRASA, rSMP_B、CABYR、E_3、TSA-I等抗原的避孕疫苗，但無論哪種疫苗，綜歸起來具有一個明顯的缺點(diǎn)，即免疫原性較弱，持續(xù)時間短，需要不斷注射方可維持抗體濃度。因此，研究一種可用于增強(qiáng)機(jī)體對避孕疫苗免疫應(yīng)答的佐劑成為必要。特異性轉(zhuǎn)移因子(specific transfer factor, STF)是采用某種特定病原免疫動物后，取其脾臟或外周血淋巴細(xì)胞制備的具有針對該抗原特異活性的小分子物質(zhì)，其主要成分是核苷酸、多肽，并含有18種游離氨基酸，包括人體必需的8種氨基酸，以及6種微量元素。STF最突出的特點(diǎn)是無免疫原性，無種屬特異性，即由某一種屬動物制備的STF，可轉(zhuǎn)移免疫活性給另一種屬的動物而不會發(fā)生超敏反應(yīng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種涉及人精子特異性轉(zhuǎn)移因子口服制劑的研制工藝，為人類避孕節(jié)育提供一種有效的免疫佐劑。本發(fā)明所述的人精子特異性轉(zhuǎn)移因子口服制劑及其制備工藝，采用以下技術(shù)方案
I.免疫原的制備
取健康人的精子，以無菌生理鹽水洗滌3次后，配制成濃度為4. OX 106/ml的混懸液，在_4°C以超聲細(xì)胞粉碎儀破碎完全，儲存于_20°C冰箱，備用。
2.免疫動物
(I)免疫前觀察及檢測
免疫前3d，5只白兔均精神好、進(jìn)食正常、無腹瀉；抽取靜脈血，以試管凝集法檢測布氏桿菌抗體，效價均小于I :80。(2)免疫白兔
以配制好的人精子抗原懸液免疫白兔，每周一次，免疫方式為背部、腹部、頸部及腋下多點(diǎn)皮下注射。第一次免疫劑量為免疫原Iml+弗氏完全佐劑0. 5ml+弗氏不完全佐劑
0.5ml ;第二次和第三次僅注射2ml精子抗原懸液；第四次、第五次也是僅注射4ml精子抗原懸液。(3)—般情況觀察
每天觀察免疫后白兔的精神、進(jìn)食、有無腹瀉等狀況，以及注射局部有無潰瘍、壞死。(4)抗體效價檢測
末次免疫后一周，抽取白兔靜脈血，以試管凝集試驗(yàn)檢測血清中的精子抗體效價，達(dá)到I 1280為免疫成功。3.制備人精子特異性轉(zhuǎn)移因子
(I)取材、勻漿末次免疫后第10天處死白兔，取脾臟及淋巴結(jié)置于_20°C冰箱備用。取免疫的白兔脾臟，剪去筋膜和大血管，用無菌生理鹽水沖洗，以12000r/min低溫勻漿2次，每次lmin，制備勻漿液。(2)破碎、凍融、透析將勻漿液置于滅菌塑料離心管中，用超聲細(xì)胞破碎儀破碎，取破碎液計(jì)數(shù)殘存細(xì)胞，鏡檢確定破碎完全后，則將其置于冰箱冷凍4 6h，然后取出置于37°C水浴，完全融解后再冷凍，連續(xù)6次，最后裝入IOKD透析袋中，以兩倍量的無菌雙蒸水透析48小時，24小時換液一次，期間振動透析袋6次，收集透析液，以0. 22 y m濾器過濾除菌。(3 )檢定和分裝多肽含量測定(改良Lowry法)后,按lmg/ml多肽為I個單位,每小瓶分裝2ml。儲存于-20°C冰箱備用。本發(fā)明所述人精子特異性轉(zhuǎn)移因子口服制劑及其制備工藝具有以下特點(diǎn)
(1)以健康人精子無菌洗滌后配制成一定濃度作為免疫原免疫白兔，使白兔免疫系統(tǒng)受到人精子多種抗原的刺激，并產(chǎn)生相應(yīng)抗體；
(2)以白兔作為免疫動物，建立抗人精子抗體的動物模型，白兔來源豐富，價格便宜也易于免疫；
(3)免疫動物的精子免疫原濃度適宜、多點(diǎn)皮下免疫、免疫時間適當(dāng)，保證了最佳的免疫效果；
(4)制備的人精子特異性轉(zhuǎn)移因子具有轉(zhuǎn)移對人精子特異性應(yīng)答信息的活性，能夠增強(qiáng)人免疫系統(tǒng)對精子抗原的特異性免疫應(yīng)答能力，沒有種屬特異性，不會引起超敏反應(yīng)；
(5)制備的人精子特異性轉(zhuǎn)移因子制劑通過口服途徑使用，方便、有效。本發(fā)明所述的人精子特異性轉(zhuǎn)移因子口服制劑及其制備工藝，包括制備免疫原、動物體內(nèi)免疫、制備人精子特異性轉(zhuǎn)移因子等步驟。本口服制劑具有轉(zhuǎn)移細(xì)胞免疫信息、介導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)、特異性地抑制和殺傷人精子的功能，并且能增強(qiáng)非特異性免疫功能；該口服制劑服用無過敏反應(yīng)，實(shí)用安全，效果明顯，使用后不會產(chǎn)生抗藥性；本產(chǎn)品采用口服給藥途徑，服用不受條件的限制，既方便，又不影響有效成分本身的生物學(xué)活性，是一種安全、有效的制劑，具有潛在的社會價值和市場應(yīng)用前景。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明所述的人精子特異性轉(zhuǎn)移因子口服制劑及其制備工藝，具體實(shí)施例如下
I.免疫原的制備
取健康人的精子，以無菌生理鹽水洗滌3次后，配制成濃度為4. OX 109/ml的混懸液，在_4°C以超聲細(xì)胞粉碎儀破碎完全，儲存于_20°C冰箱，備用。2.免疫動物
(I)免疫前觀察及檢測
免疫前3天，5只白兔均精神好、進(jìn)食正常、無腹瀉；抽取靜脈血，以試管凝集法檢測布氏桿菌抗體，效價均小于I :80。(2)免疫白兔
以配制好的人精子抗原懸液免疫白兔，每周一次，免疫方式為背部、腹部、頸部及腋下多點(diǎn)皮下注射。第一次免疫劑量為免疫原Iml+弗氏完全佐劑0.5ml+弗氏不完全佐劑0. 5ml ;第二次和第三次僅注射2ml精子抗原懸液；第四次、第五次也是僅注射精子抗原懸液，劑量為4ml。(3)—般情況觀察
每天觀察免疫后白兔的精神、進(jìn)食、有無腹瀉等狀況，以及注射局部有無潰瘍、壞死。(4)抗體效價檢測
末次免疫后一周，抽取白兔靜脈血，以試管凝集試驗(yàn)檢測血清中的精子抗體效價，達(dá)到I 1280為免疫成功。3.制備人精子特異性轉(zhuǎn)移因子
(I)取材、勻漿末次免疫后第10天處死白兔，取脾臟及淋巴結(jié)置于_20°C冰箱備用。取免疫的白兔脾臟，剪去筋膜和大血管，用無菌生理鹽水沖洗，以12000r/min低溫勻漿2次，每次lmin，制備勻漿液。(2)破碎、凍融、透析將勻漿液置于滅菌塑料離心管中，用超聲細(xì)胞破碎儀破碎，取破碎液計(jì)數(shù)殘存細(xì)胞，鏡檢確定破碎完全后，則將其置于冰箱冷凍4 6h，然后取出置于37°C水浴，完全融解后再冷凍，連續(xù)6次，最后裝入IOKD透析袋中，以兩倍量的無菌雙蒸水透析48小時，24小時換液一次，期間振動透析袋6次，收集透析液，以0. 22 y m濾器過濾除菌。(3)檢定和分裝多肽含量測定(改良Lowry法)后,按lmg/ml多肽為I個單位,每小瓶分裝2ml。儲存于-20°C冰箱備用。本發(fā)明產(chǎn)品的檢定
I.理化性質(zhì)檢定 (I)外觀微黃色、清晰透明的液體。(2) PH值經(jīng)奧力龍-818 PH計(jì)測定，PH為6. 8 7. 2。(3)最大吸收波長258±6 nm。
(4)蛋白質(zhì)試驗(yàn)20%磺基水楊酸法檢測，結(jié)果為陰性。(5)無菌試驗(yàn)合格。(6)熱原質(zhì)試驗(yàn)合格。(7)安全試驗(yàn)合格。(8)核糖含量苔黑酚顯色法測得含量為0. 717±0. 043 mg/ml。(9)多肽含量改良Lorry法檢測多肽含量為2. 34±0. 31 mg/ml。(10)氨基酸含量采用色譜分析法，以氨基酸儀測得人精子特異性轉(zhuǎn)移 因子含有17種氨基酸，各氨基酸含量不盡相同，其中以甘氨酸含量最高，半胱氨酸含量最低(如表I所示)。表I 人精子特異性轉(zhuǎn)移因子的氨基酸含量(Pg/ml)
mm 含量 sm 含量 mm 含量 Sm 含量 mm 含量 精氨酸 11.4 絲氨酸 8.8 苯丙氨酸 11.6纟顏氨酸 13.7 甘氨酸 38.8 賴氨酸 33.1 脯氨酸 9.9 谷氨酸 36.3 組氨酸 7.9 甲硫氨酸3.4 丙氨酸 22.7 異亮氨酸8.4 天冬氨酸7.9 絡(luò)氨酸 13.1 半胱氨酸2.2 蘇氨酸 3.6 亮氨酸 ld5
2.免疫學(xué)活性檢定
抽取健康成人人靜脈血10 ml，常規(guī)方法分離淋巴細(xì)胞，分別配制3X 106/ml、5X106/ml的淋巴細(xì)胞懸液。(I)淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)
取濃度為3 X 106/ml的100 W淋巴細(xì)胞懸液，加入96孔板的7孔中，前6孔再加入50W PHA, 50 W適宜濃度的人精子抗原混懸液和50耵人精子特異性轉(zhuǎn)移因子，第七孔加入100耵細(xì)胞懸液，然后以含20%小牛血清的RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液補(bǔ)足至300 W，每孔同時作2個復(fù)孔，在37°C，5% C02條件下培養(yǎng)68 h,再加入20 MTT和200 DMSO, 20分鐘后以雙波長(450nm和630nm)測定每孔的光密度(optical density, OD值),根據(jù)以下公式計(jì)算刺激指數(shù)(stimulation index, SI) SI = OD實(shí)驗(yàn)/OD對照。結(jié)果與對照相比，人精子特異性轉(zhuǎn)移因子能夠顯著促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖，且刺激活性具有劑量依賴性的特點(diǎn)，在多肽含量為0. 63 mg/ml時，刺激指數(shù)最大(SI=L 84)，隨著濃度的增高，活性反而降低。(2)白細(xì)胞粘附抑制試驗(yàn)
取濃度為5X 106/ml的100 W淋巴細(xì)胞懸液，加入到96孔板的9孔中，前6孔均再加入多肽濃度為0. 63 mg/ml的人精子特異性轉(zhuǎn)移因子50 W，后3孔加入10%小牛血清的RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液50 W，在37°C，5% C02條件下培養(yǎng)2h，前3孔加入50耵適宜濃度的人精子抗原混懸液和50 W PHA,后6孔則加入50 W PHA和10%小牛血清的RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液50耵，繼續(xù)培養(yǎng)2h，然后吸取上清液，加入180 W不含小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液和20 m MTT,孵育4h，再加入20 DMSO，20min后以雙波長(450nm和630nm)測OD值，根據(jù)以下公式計(jì)算粘附抑制率(leukocyte adhesion inhibition rate ，LAIR) LAIR=[(OD 對照-OD 實(shí)驗(yàn))/OD 對照]X 100%。結(jié)果經(jīng)與人精子特異性轉(zhuǎn)移因子共孵育后，白細(xì)胞粘附抑制率為37. 7%，顯著高于僅用人精子抗原或PHA刺激的粘附抑制率，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈0. 05)。
(3)免疫調(diào)節(jié)功 能檢測
取濃度為5X 106/ml的100 W淋巴細(xì)胞懸液，加入到96孔板的9孔中，前3孔作為實(shí)驗(yàn)孔，加入多肽濃度為0. 63 mg/ml的人精子特異性轉(zhuǎn)移因子50 W，中間3孔和后3孔分別作為對照I和對照2，均加入10%小牛血清的RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液50 W，在37°C，5%C02條件下培養(yǎng)2h，然后向?qū)嶒?yàn)孔和對照I孔加入50 W人精子抗原混懸液，對照3孔則再加入50 W10%小牛血清的RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)2h，收集上清液，以ELISA方法檢測IL-4、y-IFN.IL-21的濃度。結(jié)果在人精子特異性轉(zhuǎn)移因子作用下，淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清的Y-IFN濃度為(595± 118)pg/ml，IL-21 濃度為 403± 147 pg/ml，顯著高于兩對照組(P〈0. 05), M IL-4 水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0. 05)。
權(quán)利要求
1.人精子特異性轉(zhuǎn)移因子口服制劑及其制備工藝，其特征在于采用以下技術(shù)方案 免疫原的制備 取健康人的精子，以無菌生理鹽水洗滌3次后，配制成濃度為4. O X 106/ml的混懸液，在_4°C以超聲細(xì)胞粉碎儀破碎完全，儲存于_20°C冰箱，備用； 免疫動物 (1)免疫前觀察及檢測 免疫前3d，5只白兔均精神好、進(jìn)食正常、無腹瀉；抽取靜脈血，以試管凝集法檢測布氏桿菌抗體，效價均小于1:80; (2)免疫白兔 以配制好的人精子抗原懸液免疫白兔，每周一次，免疫方式為背部、腹部、頸部及腋下多點(diǎn)皮下注射，第一次免疫劑量為免疫原Iml+弗氏完全佐劑0. 5ml+弗氏不完全佐劑0.5ml ;第二次和第三次僅注射2ml精子抗原懸液；第四次、第五次也是僅注射4ml精子抗原懸液； (3)—般情況觀察 每天觀察免疫后白兔的精神、進(jìn)食、有無腹瀉等狀況，以及注射局部有無潰瘍、壞死； (4)抗體效價檢測 末次免疫后一周，抽取白兔靜脈血，以試管凝集試驗(yàn)檢測血清中的精子抗體效價，達(dá)到I 1280為免疫成功； 制備人精子特異性轉(zhuǎn)移因子 (1)取材、勻漿末次免疫后第10天處死白兔，取脾臟及淋巴結(jié)置于_20°C冰箱備用； 取免疫的白兔脾臟，剪去筋膜和大血管，用無菌生理鹽水沖洗，以12000r/min低溫勻漿2次，每次lmin，制備勻漿液； (2)破碎、凍融、透析將勻漿液置于滅菌塑料離心管中，用超聲細(xì)胞破碎儀破碎，取破碎液計(jì)數(shù)殘存細(xì)胞，鏡檢確定破碎完全后，則將其置于冰箱冷凍4 6h，然后取出置于37°C水浴，完全融解后再冷凍，連續(xù)6次，最后裝入IOKD透析袋中，以兩倍量的無菌雙蒸水透析48小時，24小時換液一次，期間振動透析袋6次，收集透析液，以0. 22 y m濾器過濾除菌； (3)檢定和分裝多肽含量測定(改良Lowry法)后,按lmg/ml多肽為I個單位，每小瓶分裝2ml ;儲存于_20°C冰箱備用。
全文摘要
一種人精子特異性轉(zhuǎn)移因子口服制劑及其制備工藝，該工藝主要包括制備免疫原、動物體內(nèi)免疫、制備人精子特異性轉(zhuǎn)移因子等步驟。本口服制劑具有轉(zhuǎn)移細(xì)胞免疫信息、介導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)、特異性地抑制和殺傷人精子的功能，并且能增強(qiáng)非特異性免疫功能；該口服制劑服用無過敏反應(yīng)，實(shí)用安全，效果明顯，使用后不會產(chǎn)生抗藥性；本產(chǎn)品采用口服給藥途徑，服用不受條件的限制，既方便，又不影響有效成分本身的生物學(xué)活性，是一種安全、有效的制劑，具有潛在的社會價值和市場應(yīng)用前景。
文檔編號A61P15/18GK102626422SQ20121011227
公開日2012年8月8日 申請日期2012年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月17日
發(fā)明者周建偉, 孔翠 申請人:周建偉