一種副豬嗜血桿菌感染仔豬模型的構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種副豬嗜血桿菌感染仔豬模型的構(gòu)建方法，涉及動物模型構(gòu)建領(lǐng)域，包括將若干CD仔豬養(yǎng)殖至18～25日齡，均分為感染組A和對照組B，判定CD仔豬體內(nèi)不存在HPS病原、不含APP病原或APP抗體后，飼養(yǎng)至40～70日齡時，向感染組A中所有CD仔豬氣管內(nèi)接種HPS菌種；向?qū)φ战MB中所有CD仔豬氣管內(nèi)注射培養(yǎng)基，得到空白組B′，觀察并檢測攻毒組A′、空白組B′，提取攻毒組A′、空白組B′的肺臟組織的總DNA，判定攻毒組A′的肺臟組織中存在HPS病原的同時，空白組B′的肺臟組織的中不存在HPS病原。本發(fā)明能夠降低實驗成本、簡便建模流程，結(jié)果的準確度較高，更加符合動物福利的相關(guān)要求。
【專利說明】一種副豬嗜血桿菌感染仔豬模型的構(gòu)建方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及動物模型構(gòu)建領(lǐng)域，具體涉及一種副豬嗜血桿菌感染仔豬模型的構(gòu)建 方法。

【背景技術(shù)】
[0002] HPS (Haemophilus parasuis，副豬嗜血桿菌）是一種定居在豬上呼吸道部位的革 蘭氏陰性短小桿菌，HPS的毒力菌株侵入豬體后會使豬產(chǎn)生嚴重的系統(tǒng)性炎癥疾病，臨床表 現(xiàn)以格拉澤氏病（Glaser'S Disease)，即血纖維蛋白性心包炎、多發(fā)性關(guān)節(jié)炎和腦膜炎； 有些感染豬只還表現(xiàn)出急性肺炎和急性敗血癥。
[0003] 從上個世紀末至今，HPS感染給世界各國的養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴重的損失，HPS已成為 豬場最主要的細菌性病原體之一，在我國呈全國性病發(fā)趨勢。
[0004] 現(xiàn)階段沒有預(yù)防HPS感染的有效措施。通常，在豬感染HPS后大量使用抗生素進 行治療，但一方面抗生素使用會造成養(yǎng)殖成本上升；另一方面大量抗生素的使用會導(dǎo)致排 泄物和肉制品中存有抗生素殘留，排泄物排入環(huán)境中容易造成環(huán)境污染，人體攝入含有抗 生素的肉制品后，抗生素會在人體內(nèi)聚集，導(dǎo)致人體抵抗力降低。因此，需要降低豬感染HPS 后抗生素的使用量。
[0005] 目前降低抗生素使用量的途徑包括使用疫苗和培育抗病豬種，由于抗病育種可以 從根本上解決病原體感染，因此，抗病育種成為未來豬育種產(chǎn)業(yè)發(fā)展的新方向。研宄顯示： 常規(guī)的豬群中，不同的豬個體感染HPS后的表現(xiàn)存在差異，該差異與豬個體的遺傳基因有 關(guān)，該現(xiàn)象為通過遺傳改良培育出抗性品系和/或抗性品種提供了充分的依據(jù)。
[0006] 目前，本領(lǐng)域技術(shù)人員通過建立感染模型來篩選相關(guān)抗病基因，建立可靠的活體 感染模型是培育出抗性品系和/或抗性品種的關(guān)鍵。建立感染模型（以下簡稱建模）具體 是指：通過實施攻毒試驗，收集攻毒后（含對照）的豬只在臨床病征、生長發(fā)育、體溫變化、 血液參數(shù)和免疫指標表型數(shù)據(jù)用以評判建模效果，最終在實驗室（或?qū)嶒瀯游镏行牡葘嶒?性場地）復(fù)制出病原體感染豬只的相關(guān)生物學(xué)現(xiàn)象。
[0007] 根據(jù)實驗豬只的區(qū)別，可以將現(xiàn)有的感染模型分為普通級、⑶級 (Colostrum-Deprived,禁食母豬初乳）、CDCD 級（Caesarean-Derived and Colostrum-Deprived，剖腹產(chǎn)、禁食母豬初乳）和 SPF 級（Specific pathogen free，無特定 病原體）。
[0008] 普通級感染模型建立時，直接通過母體初乳對仔豬進行喂食，并對仔豬進行多次 疫苗免疫，由于母體初乳中含有大量的抗體，可能會導(dǎo)致仔豬機體產(chǎn)生免疫，同時，進行疫 苗免疫后也會產(chǎn)生抗體，產(chǎn)生抗體后的仔豬經(jīng)HPS攻毒后可能會自行康復(fù)，難以復(fù)制HPS感 染；HPS是一種寄居在豬上呼吸道部位的常見菌和機會性致病菌，母豬通常攜帶有HPS，因 此會直接感染豬仔，影響建模效果?？傊胀壐腥灸Ｐ徒⑦^程中存在較多影響因素， 尤其是模型不穩(wěn)定、結(jié)果不準確。
[0009] CDCD級感染模型建立時，仔豬是通過剖腹產(chǎn)得到的，對母豬實施剖腹產(chǎn)時，需要配 備專業(yè)能力較強的外科手術(shù)醫(yī)生和嚴格的無菌手術(shù)室，成本較高，難以推廣。
[0010] SPF級感染模型建立時，需要使用HPS陰性豬，現(xiàn)在，HPS陰性豬群已很難找到，建 模成本較高，操作難度較大，可靠性較低，難以推廣。
[0011] CD級感染模型建立時，仔豬經(jīng)母豬自然分娩后立即與豬舍隔離，一方面隔絕了 CD 仔豬出生早期HPS在上呼吸道的定植，另一方面由于禁食初乳最大程度上避免了母體抗體 的不利影響；建模期間不需要苛刻的無菌環(huán)境，飼養(yǎng)條件也相對寬松，操作較為簡單。所以 CD仔豬是最適合作為HPS活體感染建模的實驗動物，綜合比較來看有望使得格拉澤氏病的 復(fù)制更穩(wěn)定、更現(xiàn)實、更可靠。
[0012] 目前，Blanco等人所在的課題組（西班牙CISA)以及與之合作的PIC種豬公司和 美國Minnesota大學(xué)相關(guān)課題組利用CD仔豬進行HPS感染建模。
[0013] 現(xiàn)有的⑶級感染模型建立時存在以下缺陷：
[0014] (I)CD仔豬喂養(yǎng)時，先使用牛初乳喂食3天，通常來講，牛初乳的獲得并不方便且 需要做滅菌處理，不僅提高了實驗成本而且可能會因含有牛腸炎病毒增加 CD仔豬腹瀉風(fēng) 險，CD仔豬的死亡率較高。
[0015] (2)已有模型對21日齡的⑶仔豬進行攻毒，由于21日齡的⑶仔豬體內(nèi)器官發(fā)育 尚不完善，相關(guān)實驗結(jié)果可能難以全面反映豬只感染HPS后的癥狀，準確度較低；同時，使 用與生產(chǎn)上斷奶日齡（15?21日齡）相接近的CD仔豬進行實驗，不太符合動物福利的相 關(guān)舉措。
[0016] (3)現(xiàn)有的⑶仔豬至感染前存活率僅為50%?78. 9%，存活率較低，實驗成本較 尚。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0017] 針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種副豬嗜血桿菌感染仔豬 模型的構(gòu)建方法，能夠降低實驗成本、簡便建模流程，結(jié)果的準確度較高，更加符合動物福 利的相關(guān)要求。
[0018] 為達到以上目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：一種副豬嗜血桿菌感染仔豬模型的 構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟：
[0019] 步驟一、將自然分娩得到的若干禁食母豬初乳CD仔豬進行隔離，飼養(yǎng)至18?25 日齡，將未死亡的⑶仔豬隨機均分為兩組：感染組A和對照組B ;待感染組A和對照組B的 所有⑶仔豬生長至30?40日齡時，采集感染組A和對照組B中所有⑶仔豬的鼻拭子和 非抗凝外周血；判定鼻拭子中不存在副豬嗜血桿菌HPS病原、且非抗凝外周血中不含豬胸 膜肺炎放線桿菌APP病原或APP血清抗體，轉(zhuǎn)入步驟二；
[0020] 步驟二、待感染組A和對照組B的所有⑶仔豬生長至40?70日齡時，向感染組 A中所有CD仔豬的氣管內(nèi)接種劑量為107CFU?109CFU、分散于培養(yǎng)基中的HPS細菌，得到 攻毒組Y ;接種HPS細菌的同時，向?qū)φ战MB中所有CD仔豬氣管內(nèi)注射與HPS劑量相同 的培養(yǎng)基，得到空白組V，轉(zhuǎn)入步驟三；
[0021] 步驟三、接種HPS細菌1?20天后，分別提取攻毒組A'、空白組B'的肺臟組織 的總DNA，當攻毒組Y的肺臟組織的總DNA中存在HPS病原、且空白組^的肺臟組織的 總DNA中不存在HPS病原時，建模成功；當攻毒組Y的肺臟組織的總DNA中不存在HPS病 原，或空白組B'的肺臟組織的總DNA中存在HPS病原時，重新執(zhí)行步驟一?步驟三。
[0022] 在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，步驟一中所述將自然分娩得到的若干CD仔豬進行隔 離，養(yǎng)殖至18?25日齡包括以下步驟：母豬自然分娩時人工助產(chǎn)，防止仔豬分娩后接觸母 豬、地面、欄舍及其他豬場物品，立即放入溫度為33?35°C的無菌保溫箱中，待CD仔豬體表 干燥、保溫箱內(nèi)站立穩(wěn)定或行走自如后，使用奶瓶飼喂溫度為37°C的溫開水約40ml，出生 后3?5h內(nèi)，將⑶仔豬轉(zhuǎn)移至實驗動物中心負壓條件下，溫度為28?35°C的仔豬保育欄 中；
[0023] ⑶仔豬的1?12日齡均喂食人工乳，其中：1?2日齡每日喂食次數(shù)為5次，3? 4日齡每日喂食4次，5?14日齡每日喂食3次；每次的喂食量根據(jù)日齡的增長逐漸增加； CD仔豬自13日齡起，采用人工乳并輔助顆粒飼料喂食，其中：15?21日齡每日喂食3次， 22日齡后自由采食顆粒飼料和飲水，養(yǎng)殖至18?25日齡時，⑶仔豬的存活率為80 %? 85%〇
[0024] 在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，自⑶仔豬7日齡起開始訓(xùn)練采食顆粒料，⑶仔豬13日 齡后強制性在人工乳中添加 CD仔豬顆粒料，首次添加量為：每升流食中含人工乳粉112g、 顆粒料28g，之后按照顆粒料每日5?10 %的比例遞加，對應(yīng)人工乳粉以5?10 %的比例減 少。
[0025] 在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，步驟一中將自然分娩得到的若干禁食母豬初乳CD仔 豬進行隔離，飼養(yǎng)至18?25日齡，包括以下步驟：將⑶仔豬飼養(yǎng)至3日齡后，判定⑶仔豬 拉稀，根據(jù)CD仔豬的體重，自發(fā)現(xiàn)日起，連續(xù)3天，向?qū)?yīng)CD仔豬早晚分別注射50 μ Ι/kg的 土霉素注射液和頭孢噻呋鈉注射液，并每天灌食糖鹽水，每升糖鹽水中含20g葡萄糖、3. 5g 氯化鈉和2. 5g碳酸氫鈉。
[0026] 在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，步驟一中所述采集感染組A和對照組B中所有⑶仔豬 的鼻拭子和非抗凝外周血之后，還包括以下步驟：判定鼻拭子中存在HPS病原、且非抗凝外 周血中含有APP病原或者非抗凝外周血含有APP血清抗體，將對應(yīng)的CD仔豬移除，轉(zhuǎn)到步 驟二。
[0027] 在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，步驟二和步驟三之間還包括以下步驟：觀察攻毒組 A'、空白組B'中所有CD仔豬的行為舉止、呼吸、跛行、關(guān)節(jié)腫脹、神經(jīng)癥狀、咳嗽和進食情 況；
[0028] 采集所有攻毒組Y和空白組V中⑶仔豬的外周血，檢測所有外周血的血液參 數(shù)；攻毒1?20天，后將攻毒組A'、空白組B'中所有⑶仔豬麻醉并放血，采集每頭⑶ 仔豬的頸部淋巴結(jié)、腹股溝淋巴結(jié)、腹膜、腸系膜淋巴結(jié)、肝、脾、腎、肺臟、心、腦膜和大腦組 織；并對腹膜、脾臟、心臟、肺臟、腦膜、大腦組織進行切片并染色觀察。
[0029] 在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，步驟二包括具體以下步驟：待感染組A和對照組B的所 有⑶仔豬生長至45日齡時，向感染組A中所有⑶仔豬氣管內(nèi)接種劑量為109CFU、分散于 培養(yǎng)基中的HPS細菌進行攻毒實驗；向?qū)φ战MB中所有CD仔豬氣管內(nèi)注射相同體積的培養(yǎng) 基，得到空白組B'。
[0030] 在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，所述HPS細菌選用血清型為1、5、10、12、13或14的HPS 細菌中的任意一種。
[0031] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于：
[0032] (1)本發(fā)明中副豬嗜血桿菌感染仔豬模型的構(gòu)建方法，包括使用人工乳喂食至12 日齡；，13?21日齡，采用人工乳輔助顆粒飼料喂食，每日喂食3次，22日齡后，進行顆粒 飼料自由采食和飲水。期間，自CD仔豬7日齡起開始訓(xùn)練采食顆粒料。與現(xiàn)有技術(shù)中仔豬 存活率50 %?78. 9 %，存活率較低，實驗成本較高相比，本發(fā)明的CD仔豬存活率為80? 85%，能夠提高仔豬的存活率，有效降低實驗成本。
[0033] (2)本發(fā)明中副豬嗜血桿菌感染仔豬模型的構(gòu)建方法，包括對40?70日齡的⑶ 仔豬進行攻毒實驗，與現(xiàn)有技術(shù)中使用21日齡的CD仔豬，測定結(jié)果準確度較低，與動物福 利相違背相比，本申請的CD仔豬發(fā)育較完善，能夠準確反映實際養(yǎng)殖過程中的豬群感染 HPS后的癥狀，為研宄和預(yù)防HPS感染提供較好的研宄平臺，測定結(jié)果的準確度較高，符合 動物福利理論。
[0034] 本領(lǐng)域技術(shù)人員在進行模型的構(gòu)建時，通常采用的為21日齡仔豬，即使參考其他 文獻，由于不同仔豬的生長發(fā)育情況不同，本領(lǐng)域技術(shù)人員不能僅僅參考其他品種仔豬的 攻毒時間，輕易得到本發(fā)明的仔豬攻毒時間，即：該時間不是本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)實際情況 能夠輕易獲得的。
[0035] (3)本發(fā)明中副豬嗜血桿菌感染仔豬模型的構(gòu)建方法，包括判定非抗凝外周血中 含有APP或者非抗凝外周血含有APP血清抗體，將對應(yīng)的CD仔豬移除。本發(fā)明根據(jù)多次試 驗得到：APP或相關(guān)抗體的存在對HPS感染的影響較大，移除含有APP病原或者非抗凝外周 血含有APP血清抗體的CD仔豬，能夠提高結(jié)果的準確性和建模的成功率。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0036] 圖1為本發(fā)明實施例1和3中攻毒前⑶豬只體內(nèi)HPS病原檢測的PCR電泳圖；
[0037] 圖2為本發(fā)明實施例1中HPS攻毒前后通城⑶豬外周血總白細胞對比圖；
[0038] 圖3為本發(fā)明實施例1中HPS攻毒前后通城⑶豬外周血主要白細胞亞類對比圖；
[0039] 圖4為本發(fā)明實施例1中HPS攻毒后通城⑶豬對照組與攻毒組豬只體溫變化對 比圖；
[0040] 圖5為本發(fā)明實施例1中通城⑶豬攻毒組和對比組的腹膜、脾臟、肺臟、心臟、腦 膜、大腦組織細胞對比圖；
[0041] 圖6為本發(fā)明實施例1中通城⑶豬攻毒后肺臟組織中HPS的PCR鑒定電泳圖；
[0042] 圖7為本發(fā)明實施例3中HPS攻毒后杜長大⑶豬對照組與攻毒組豬只體溫變化 對比圖。
[0043] 圖4、5、6、7中：所有C表示對照組，所有I表示實驗組。

【具體實施方式】
[0044] 以下結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明。
[0045] 本發(fā)明實施例提供一種副豬嗜血桿菌感染仔豬模型的構(gòu)建方法，包括以下步驟：
[0046] Sl :將自然分娩得到的若干⑶仔豬進行隔離后、放入溫度為33?35°C的無菌保 溫箱中，待CD仔豬體表干燥、保溫箱內(nèi)站立穩(wěn)定或行走自如后，使用奶瓶飼喂溫度為37°C 的溫開水約40ml，出生后3?5h內(nèi)，將⑶仔豬轉(zhuǎn)移至實驗動物中心負壓條件下，溫度為 28?35°C的保育欄中。
[0047] S2 :參見表1所示，CD仔豬的1?12日齡均喂食人工乳（45°C溫開水沖泡，每升含 140g人工乳粉），其中：1?2日齡每日喂食次數(shù)為5次，3?4日齡每日喂食4次，5?14 日齡每日喂食3次。每次的喂食量根據(jù)日齡的增長逐漸增加。
[0048] ⑶仔豬自13日齡起，采用人工乳并輔助顆粒飼料喂食，其中：15?21日齡每日喂 食3次，18?25日齡后自由采食顆粒飼料和飲水，轉(zhuǎn)入步驟S3。
[0049] 步驟S2期間，所有⑶仔豬1日齡時肌肉注射濃度為10%、體積為Iml的右旋糖酐 鐵注射液；1?3日齡時，根據(jù)⑶仔豬的體重，每天向每頭⑶仔豬注射50 μ Ι/kg的肌注土 霉素注射液。
[0050] 3日齡后，若有⑶仔豬拉稀，則根據(jù)對應(yīng)⑶仔豬的體重，自發(fā)現(xiàn)日起，連續(xù)3天，向 對應(yīng)CD仔豬早晚分別注射50 μ Ι/kg的土霉素注射液和頭孢噻呋鈉注射液，并每天灌食糖 鹽水，每升糖鹽水中含20g葡萄糖、3. 5g氯化鈉和2. 5g碳酸氫鈉。攻毒前2周停用任何抗 生素藥品。
[0051] 其中，自⑶仔豬7日齡起開始訓(xùn)練采食顆粒料；⑶仔豬13日齡后強制性在人工 乳中添加 CD仔豬顆粒料，首次添加量為：每升流食中含人工乳粉112g、顆粒料28g，之后按 照顆粒料每日5?10%的比例遞加，對應(yīng)人工乳粉以5?10%的比例減少。
[0052] 通常，⑶仔豬2周齡可主動采食顆粒料，但仍有部分⑶仔豬不食，故13?21日 齡仍主要以人工乳輔助進行喂食，防止CD仔豬因為進食不足影響健康狀況和存活率，本發(fā) 明實施例中⑶仔豬的存活率為80%?85%，高于現(xiàn)有技術(shù)中的50%?78. 9%。
[0053] S3 :將未死亡的⑶仔豬隨機均分為兩組：感染組A和對照組B。待感染組A和對 照組B的所有⑶仔豬生長至30?40日齡時（最優(yōu)為35日齡），采集感染組A和對照組B 中所有CD仔豬的鼻拭子和非抗凝外周血。
[0054] 判定鼻拭子中不存在HPS病原、非抗凝外周血中不含APP(Actinobacillus pleuropneumoniae，豬胸膜肺炎放線桿菌）病原或APP血清抗體，轉(zhuǎn)入步驟S5。
[0055] 其中，HPS病原采用PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈式反應(yīng)）法檢測， APP病原或APP血清抗體米用ELISA (enzyme linked immunosorbent assay，酶聯(lián)免疫吸附 測定）法檢測。
[0056] 判定鼻拭子中存在HPS病原、非抗凝外周血中含有APP病原或者非抗凝外周血含 有APP血清抗體，將對應(yīng)的CD仔豬移除。
[0057] S4 :采集感染組A和對照組B中的所有⑶仔豬的外周血2ml，測定血液中的 WBC(血液總白細胞）、NEU (中性細胞）、LYM(淋巴細胞）、Μ0Ν0 (單核細胞）、E0S (嗜酸性粒 細胞）、BASO (嗜堿性粒細胞）、RBC (紅細胞）、HGB (血紅蛋白濃度）、HAT (紅細胞壓積）、 MCV (平均紅細胞體積）、MCH (平均紅細胞血紅蛋白含量）、RDW (紅細胞分布寬度）和PLT (血 小板），（以下簡稱血液參數(shù)）轉(zhuǎn)入S5。
[0058] S5 :待感染組A和對照組B的所有⑶仔豬生長至40?70日齡（最優(yōu)為45日齡） 時，向感染組A中所有CD仔豬氣管內(nèi)接種劑量為107CFU?109CFU的HPS病原，HPS病原 選用血清型為1、5、10、12、13或14的即3病原中的任意一種，得到攻毒組"，即3的培養(yǎng) 基選用TSB培養(yǎng)基（Tryptic Soy Broth，胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基）
[0059] 向?qū)φ战MB中所有⑶仔豬氣管內(nèi)注射相同體積的TSB培養(yǎng)基，得到空白組B'，轉(zhuǎn) 入步驟S6。
[0060] S6:觀察攻毒組A'、空白組B'中所有⑶仔豬的行為舉止、呼吸、跛行、關(guān)節(jié)腫脹、 神經(jīng)癥狀、咳嗽和進食情況。
[0061] 采集所有攻毒組Y和空白組V中⑶仔豬的外周血，檢測所有外周血的血液參 數(shù)，轉(zhuǎn)入步驟S7。
[0062] S7:攻毒1?20天后，將攻毒組Y、空白組V中所有⑶仔豬麻醉并放血，采集每 頭CD仔豬的頸部淋巴結(jié)、腹股溝淋巴結(jié)、腹膜、腸系膜淋巴結(jié)、肝、脾、腎、肺臟、心、腦膜和 大腦組織。并對腹膜、脾臟、心臟、肺臟、腦膜、大腦組織進行切片并染色觀察，轉(zhuǎn)入步驟S8。
[0063] S8:分別提取攻毒組A'、空白組B'的肺臟組織的總DNA，判斷攻毒組A'的肺臟 組織的總DNA中存在HPS病原的同時，空白組V的肺臟組織的總DNA中不存在HPS病原。 綜合臨床病征、組織病理和細菌鑒定判定HPS感染，若是，建模成功；否則，重復(fù)執(zhí)行步驟 Sl ?S8〇
[0064] 表1，⑶仔豬飼喂方案
[0065]

【權(quán)利要求】
1. 一種副豬嗜血桿菌感染仔豬模型的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟： 步驟一、將自然分娩得到的若干禁食母豬初乳CD仔豬進行隔離，飼養(yǎng)至18?25日齡， 將未死亡的⑶仔豬隨機均分為兩組：感染組A和對照組B ;待感染組A和對照組B的所有 ⑶仔豬生長至30?40日齡時，采集感染組A和對照組B中所有⑶仔豬的鼻拭子和非抗凝 外周血；判定鼻拭子中不存在副豬嗜血桿菌HPS病原、且非抗凝外周血中不含豬胸膜肺炎 放線桿菌APP病原或APP血清抗體，轉(zhuǎn)入步驟二； 步驟二、待感染組A和對照組B的所有⑶仔豬生長至40?70日齡時，向感染組A中 所有CD仔豬的氣管內(nèi)接種劑量為107CFU?109CFU、分散于培養(yǎng)基中的HPS細菌，得到攻毒 組A';接種HPS細菌的同時，向?qū)φ战MB中所有CD仔豬氣管內(nèi)注射與HPS劑量相同的培 養(yǎng)基，得到空白組B'，轉(zhuǎn)入步驟三； 步驟三、接種HPS細菌1?20天后，分別提取攻毒組A'、空白組B'的肺臟組織的總 DNA，當攻毒組f的肺臟組織的總DNA中存在HPS病原、且空白組V的肺臟組織的總DNA 中不存在HPS病原時，建模成功；當攻毒組A'的肺臟組織的總DNA中不存在HPS病原，或 空白組V的肺臟組織的總DNA中存在HPS病原時，重新執(zhí)行步驟一?步驟三。
2. 如權(quán)利要求1所述的副豬嗜血桿菌感染仔豬模型的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟一 中所述將自然分娩得到的若干CD仔豬進行隔離，養(yǎng)殖至18?25日齡包括以下步驟：母豬 自然分娩時人工助產(chǎn)，防止仔豬分娩后接觸母豬、地面、欄舍及其他豬場物品，立即放入溫 度為33?35°C的無菌保溫箱中，待⑶仔豬體表干燥、保溫箱內(nèi)站立穩(wěn)定或行走自如后，使 用奶瓶飼喂溫度為37°C的溫開水約40ml，出生后3?5h內(nèi)，將⑶仔豬轉(zhuǎn)移至實驗動物中 心負壓條件下，溫度為28?35°C的仔豬保育欄中； ⑶仔豬的1?12日齡均喂食人工乳，其中：1?2日齡每日喂食次數(shù)為5次，3?4日 齡每日喂食4次，5?14日齡每日喂食3次；每次的喂食量根據(jù)日齡的增長逐漸增加；⑶仔 豬自13日齡起，采用人工乳并輔助顆粒飼料喂食，其中：15?21日齡每日喂食3次，22日 齡后自由采食顆粒飼料和飲水，養(yǎng)殖至18?25日齡時，⑶仔豬的存活率為80 %?85%。
3. 如權(quán)利要求2所述的副豬嗜血桿菌感染仔豬模型的構(gòu)建方法，其特征在于：自CD仔 豬7日齡起開始訓(xùn)練采食顆粒料，CD仔豬13日齡后強制性在人工乳中添加 CD仔豬顆粒料， 首次添加量為：每升流食中含人工乳粉112g、顆粒料28g，之后按照顆粒料每日5?10%的 比例遞加，對應(yīng)人工乳粉以5?10%的比例減少。
4. 如權(quán)利要求1所述的副豬嗜血桿菌感染仔豬模型的構(gòu)建方法，其特征在于：步驟一 中將自然分娩得到的若干禁食母豬初乳CD仔豬進行隔離，飼養(yǎng)至18?25日齡，包括以下 步驟：將CD仔豬飼養(yǎng)至3日齡后，判定CD仔豬拉稀，根據(jù)CD仔豬的體重，自發(fā)現(xiàn)日起，連續(xù) 3天，向?qū)?yīng)CD仔豬早晚分別注射50 y 1/kg的土霉素注射液和頭孢噻呋鈉注射液，并每天 灌食糖鹽水，每升糖鹽水中含20g葡萄糖、3. 5g氯化鈉和2. 5g碳酸氫鈉。
5. 如權(quán)利要求1所述的副豬嗜血桿菌感染仔豬模型的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟一 中所述采集感染組A和對照組B中所有CD仔豬的鼻拭子和非抗凝外周血之后，還包括以下 步驟：判定鼻拭子中存在HPS病原、且非抗凝外周血中含有APP病原或者非抗凝外周血含有 APP血清抗體，將對應(yīng)的CD仔豬移除，轉(zhuǎn)到步驟二。
6. 如權(quán)利要求1所述的副豬嗜血桿菌感染仔豬模型的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟二 和步驟三之間還包括以下步驟：觀察攻毒組A'、空白組B'中所有⑶仔豬的行為舉止、呼 吸、跛行、關(guān)節(jié)腫脹、神經(jīng)癥狀、咳嗽和進食情況； 采集所有攻毒組A'和空白組B'中CD仔豬的外周血，檢測所有外周血的血液參數(shù)；攻 毒1?20天，后將攻毒組A'、空白組B'中所有⑶仔豬麻醉并放血，采集每頭⑶仔豬的 頸部淋巴結(jié)、腹股溝淋巴結(jié)、腹膜、腸系膜淋巴結(jié)、肝、脾、腎、肺臟、心、腦膜和大腦組織；并 對腹膜、脾臟、心臟、肺臟、腦膜、大腦組織進行切片并染色觀察。
7. 如權(quán)利要求1所述的副豬嗜血桿菌感染仔豬模型的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟二 包括具體以下步驟：待感染組A和對照組B的所有⑶仔豬生長至45日齡時，向感染組A中 所有CD仔豬氣管內(nèi)接種劑量為109CFU、分散于培養(yǎng)基中的HPS細菌進行攻毒實驗；向?qū)φ?組B中所有CD仔豬氣管內(nèi)注射相同體積的培養(yǎng)基，得到空白組B'。
8. 如權(quán)利要求1所述的副豬嗜血桿菌感染仔豬模型的構(gòu)建方法，其特征在于：所述HPS 細菌選用血清型為1、5、10、12、13或14的HPS細菌中的任意一種。
【文檔編號】A61K35/74GK104488823SQ201510011558
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2015年1月9日 優(yōu)先權(quán)日:2015年1月9日
【發(fā)明者】陳洪波, 程蕾, 趙書紅, 張晶, 向敏, 侯永清, 高其雙, 郭玲, 邱銀生, 黎旺明 申請人:武漢輕工大學(xué)