專利名稱：含有血漿蛋白藥物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及應(yīng)用檸檬酸鹽血漿或者含有檸檬酸鹽的血漿級分物，制備一種含血漿蛋白藥物的方法，該藥物基本不含有非需要金屬。
人類白蛋白以其35-50g/l的濃度為血漿中的主要成分。其治療性應(yīng)用早已被熟知，例如當血液或血漿突然喪失時，或者當血管舒縮神經(jīng)調(diào)節(jié)功能衰竭時，可以應(yīng)用白蛋白。因為其20％(25％)的白蛋白溶液的滲透壓約為正常人類血清的4倍(5倍)，白蛋白的作用原理主要是其維持滲透壓平衡的能力。
人類白蛋白制劑通過將人類血漿多次級分獲得，例如通過孔恩氏級分，或者通過重組合方法制備而得。由于制備過程中所使用的材料各不相同，或者在白蛋白溶液在玻璃容器中的貯藏過程中，會有鋁進入白蛋白制劑，使得相應(yīng)制劑中鋁的終含量已經(jīng)相當可觀。
鋁為自然界最常見的元素之一，早先時代常常與人體各種疾病聯(lián)系在一起，尤其是神經(jīng)系統(tǒng)和骨骼系統(tǒng)的疾病。盡管肺和胃腸道形成了針對鋁吸收的有效屏障，當病人靜脈內(nèi)用藥時，此屏障發(fā)生紊亂，那么可能存在于所使用藥物中的鋁可以暢通無阻地被吸收。例如D.S.Milliner等曾經(jīng)報道(新英格蘭醫(yī)學雜志(1985),312期，165-167頁)幾種含有大量鋁的白蛋白制品導致骨骼疾病或大腦炎。另外，越來越多地認為鋁與阿爾茨海默氏癡呆有關(guān)。
因此有許多的努力，力圖減少例如白蛋白制劑中的鋁含量。例如由US-PS5372997已知一種減少白蛋白制劑中鋁含量的方法，該方法一方面應(yīng)用了專門的玻璃器皿，另一方面是應(yīng)用陰離子交換劑進行處理。通過應(yīng)用特殊的無鋁玻璃以及通過用硫酸銨溶液或硫酸將內(nèi)表面進行去堿化處理，可以防止鋁從玻璃器皿中溶解出來。此外還可以應(yīng)用陽離子交換劑進行處理。在對白蛋白溶液進行加熱處理時，添加合適的穩(wěn)定劑，例如鈉-N-乙酰色氨酸或辛酸鈉。
由EP-0484464-B1已知一種從與其結(jié)合的多價金屬離子清除白蛋白方法，即用一價金屬離子，例如銨離子或堿金屬離子替代之。
由US-PS5250663已知可獲得基本上不含鋁的白蛋白的一種方法。該方法由含白蛋白的級分物，例如以孔恩氏級分物開始，首先進行各種沉淀處理，然后在辛酸鈉作為穩(wěn)定劑和10-20％乙醇存在的條件下進行熱震蕩處理。最后將溶液進行超濾處理和滲濾處理。滲濾后去除了鋁和其它雜質(zhì)，作為鹽可使用弱鹽溶液應(yīng)用于滲濾處理，例如3％NaCl，乙酸鈉或者在某些情況下應(yīng)用辛酸鈉溶液。但是在此應(yīng)用辛酸鹽的情況下沒有鹽的交換，因為滲濾前即已添加了辛酸鹽作為熱震蕩處理的穩(wěn)定劑；也就是說制劑中始終存在著相當大劑量的檸檬酸鹽離子。
例如J.C.May等(1992)(血液之聲，62期，65-69頁)所說明的，檸檬酸鹽離子對鋁具有高度親和力，其存在對鋁的吸收起主要作用(對此還可以參見例如R.B.Martin(1986)，無機生物化學雜志，28期，181-187頁)，因此僅僅檸檬酸鹽的存在，對于所有的制劑而言都是一個金屬離子污染的危險因素。
EP-0696595-A1說明了將辛酸鹽應(yīng)用于白蛋白級分的一種方法，該方法將檸檬酸鹽離子在DEAE-交聯(lián)葡聚糖-色譜分離的過程中去除。這里并非是簡單的檸檬酸鹽離子與其它離子的交換，而是一個價格昂貴的檸檬酸鹽的分離問題，因為DEAE-交聯(lián)葡聚糖-陰離子交換劑的價格昂貴。
本發(fā)明的目的是，尋求一種新的簡單可行的方法，可以避免和減少含血漿蛋白藥物中的非需要金屬，應(yīng)用此方法既可以在制備方法的過程中去除非需要金屬，又可以避免或減少在含金屬器皿中貯藏時成品制劑的污染。
通過本文開頭所提及方式的方法達到了此目的，它包括以下步驟
-在非沉淀條件下，使在含有血漿蛋白的溶液中的檸檬酸鹽和任選結(jié)合在檸檬酸鹽上的金屬，與水溶性單-或二羧酸鹽、或者一種有機的單-或二羧酸發(fā)生交換，-獲得血漿蛋白或血漿蛋白類和-制備藥物。
令人驚異地現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)正是含血漿蛋白的溶液中所含有的陰離子，對去除金屬陽離子起著決定性的作用。
與US-PS5250663中說明的方法相反，不僅在含檸檬酸鹽的溶液或含檸檬酸鹽的沉淀中添加辛酸鈉，而且還用一種水溶性單-或二羧酸鹽替代出檸檬酸鹽，該檸檬酸鹽一方面可以攜帶有復合形式的結(jié)合金屬離子，而且還師職于在制備方法過程中或成品藥物的貯藏過程中溶解出非需要金屬。
這表明，如果將含有檸檬酸鹽離子的制劑沉淀，然后又吸收至無檸檬酸鹽離子的緩沖劑中，新溶液仍然含有大量的檸檬酸鹽離子。因為大多數(shù)由血漿獲取藥物制劑的級分方法具有一個或多個沉淀步驟，這些血漿在去除時幾乎無一例外地添加了檸檬酸鹽，因此本發(fā)明檸檬酸鹽離子的交換方法，為一種簡單的、價廉的和有效的去除檸檬酸鹽離子的有意義方法，而且易于轉(zhuǎn)入已成熟的方法過程。
作為血漿級分物例如可以是通過孔恩氏級分處理所獲得的級分物。例如為了制備白蛋白，應(yīng)用孔恩氏級分處理所獲得的含有白蛋白的沉淀物。
為了盡可能完全地交換檸檬酸鹽，交換步驟必須在非沉淀條件下進行，否則正如所提及過的，存在著這樣的危險，即因為檸檬酸鹽對沉淀的蛋白質(zhì)具有高度親和力而不能被充分去除。優(yōu)選在制備方法的早期進行檸檬酸鹽的交換。
按照本發(fā)明方法優(yōu)選的實施方式所制備的含血漿蛋白的藥物，為含有凝血因子和纖維蛋白溶解因子、免疫球蛋白、糖蛋白和/或白蛋白中的一種或多種的藥物。作為凝血因子和纖維蛋白溶解因子，尤其考慮纖維蛋白原、凝血酶原、第Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ和ⅩⅢ因子，任選以其激活形式，維勒布蘭德氏因子，還有抗凝血劑，如肝素、類肝素或香豆素衍生物，或纖維蛋白溶解劑，如鏈激酶、尿激酶、尿激酶原、激活酶(t-PA)或胞漿素。作為免疫球蛋白，可以制備各種含有IgG、IgA、IgM免疫球蛋白及其混合物的制劑，任選為高滴定度。
作為糖蛋白，考慮例如血清類粘蛋白。
優(yōu)選應(yīng)用帶有2-20個碳原子的有機羧酸鹽，用于檸檬酸鹽的交換，其中特別優(yōu)選辛酸鹽、或酒石酸鹽、或其混合物。
適合于本發(fā)明目的的有機單-或二羧酸還可以是單-或二羧酸鹽，因為溶液中檸檬酸鹽的交換總是針對酸陰離子的交換。優(yōu)選在檸檬酸鹽的交換中應(yīng)用帶有2-4個碳原子的有機單-或二羧酸。
本發(fā)明方法已證明完全適合于制備含血漿蛋白的藥物，特別是在鋁污染方面具有優(yōu)異的特性，即基本不含可檢測劑量的鋁。
正如所提及過的那樣，必須在非沉淀條件下進行檸檬酸鹽的交換。優(yōu)選在滲濾、超濾或在色譜分離方法的過程中進行交換步驟，因為這些步驟特別適合于簡單、價廉而又有效的交換。
交換步驟中的條件與所應(yīng)用的方法有關(guān)，其選擇尤其應(yīng)該是，使檸檬酸鹽和任選的結(jié)合檸檬酸鹽的金屬盡可能完全地被交換。因此應(yīng)最佳選擇相應(yīng)的決定方法的參數(shù)，尤其是溫度、交換步驟的持續(xù)時間和相應(yīng)的單-或二羧酸或單-或二羧酸鹽的濃度。
交換時的溫度優(yōu)選在0-50℃范圍之間的溫度，尤其優(yōu)選10-30℃范圍之間的溫度，最優(yōu)選室溫左右。交換過程的時間長短尤其取決于需要交換的容積量與膜表面的比例以及溫度，優(yōu)選至少30分鐘，尤其是在30分鐘和幾個小時的范圍內(nèi)。
一般而言，某一參數(shù)如時間長短還取決于相應(yīng)材料的交換容積。優(yōu)選交換容積至少為起始溶液的5倍，最為優(yōu)選的是至少30倍，相應(yīng)地測算交換的時間長短。
單-或二羧酸鹽或單-或二羧酸的濃度優(yōu)選在0.001-10摩爾/升的范圍內(nèi)，最為優(yōu)選的是在0.001-1摩爾/升的范圍內(nèi)。
例如添加濃度在1.0毫摩爾/升至1.5摩爾/升范圍之間的，優(yōu)選在1.0-25毫摩爾/升范圍之間的辛酸鈉。
例如添加濃度在1毫摩爾/升至5.5摩爾/升范圍之間的，優(yōu)選在50毫摩爾/升至1.0摩爾/升范圍之間的乙酸鈉。
例如添加濃度在1.0毫摩爾/升至1.0摩爾/升范圍之間的，優(yōu)選在5.0毫摩爾/升至0.1摩爾/升之間范圍的己酸鈉。
可以例如添加濃度在1.0毫摩爾/升至1.2摩爾/升范圍之間的，優(yōu)選在10.0毫摩爾/升至0.2摩爾/升范圍之間的酒石酸鈉。
較高級酸的鹽其有效劑量在0.001-0.1摩爾/升范圍之間，而較低級酸的鹽優(yōu)選以較高濃度添加。
另外一個決定方法的參數(shù)是溶液的pH-值，該值優(yōu)選為pH6-8，最為優(yōu)選的是pH6.5-7.5。
為了提高離子強度，溶液中除含有羧酸鹽或羧酸以外，還可以含有有機鹽，如鈉鹽或鉀鹽。例如可以含有至少4％的氯化鈉溶液。此外還可以含有各種緩沖鹽。
作為用于交換方法的材料，尤其可以考慮市面上可以獲得的材料，例如滲濾膜、超濾單位、多種的色譜分離凝膠、分子篩和其它。所有這些材料都可以是基于有機或無機材料；可以是合成的或者是生物來源的。
已經(jīng)證明，如果將含有血漿蛋白的溶液在交換前提純和/或濃縮，本發(fā)明方法則尤顯優(yōu)越。
正如所有以血漿為原材料基礎(chǔ)的藥物一樣，在本發(fā)明制備方法的范圍內(nèi)也可以預(yù)設(shè)一個或多個步驟使可能存在的病毒失活。
因此本發(fā)明方法的優(yōu)選實施方式是，將含血漿蛋白的溶液在交換前和/或交換后進行處理，使可能存在的病毒失活，優(yōu)選進行熱處理。在本發(fā)明方法范圍內(nèi)可以應(yīng)用的常見病毒失活處理方法在EP-0159311、EP-0519901或EP-0674531中有說明。
特別合適的是，在病毒失活處理之前，將所獲得的血漿蛋白再次針對無鹽試劑如水進行滲濾。在此仍然可以得到對血漿蛋白的附加穩(wěn)定作用，因為存在單-或二羧酸鹽。獲得血漿蛋白類和制備藥物時，應(yīng)優(yōu)選僅僅應(yīng)用無檸檬酸鹽成分，以避免制劑重新污染檸檬酸鹽，后者造成長時間貯藏時的再度金屬離子污染。
本發(fā)明方法特別適合于去除鋁離子，以及防止藥物長時間貯藏時重新污染鋁離子。同時還可以有效地減少其它金屬離子，已知它們可以污染含血漿蛋白藥物，例如與鋁類似的金屬，鎘、鋅、鉛、鐵、和其它等等。
本發(fā)明的目的還有含血漿蛋白藥物，可以按照本發(fā)明方法獲得，并且其所含非需要金屬少于100μg/l，優(yōu)選少于10μg/l，特別是少于200ng/l，例如其劑量通過原子吸收光譜測得，即使長時間貯藏甚至于貯藏5年以上，也不能超過此最高含量值。
本發(fā)明含血漿蛋白藥物可以貯藏于各種不同的現(xiàn)有技術(shù)已知的器皿(容器)中。這些器皿可以由玻璃、塑料、金屬或其復合材料構(gòu)成。還可以將這些器皿進行特殊預(yù)處理，例如將表面硅化處理。作為玻璃既可以應(yīng)用硬玻璃又可以應(yīng)用軟玻璃(參見例如玻璃類、分類USP23,1781頁)。
尤其是本發(fā)明含血漿蛋白藥物在硬玻璃中貯藏時非需要金屬含量甚微，特別優(yōu)選的是其含量低于100μg/l，更優(yōu)選低于10μg/l，最優(yōu)選低于200ng/l。
以下實施例進一步說明本發(fā)明，但并非局限于此。
實施例1將孔恩氏級分的沉淀物，它含有的白蛋白純度為＞95％，以1+2(G/V；1kg于21中)在中性pH-值下溶解于50g/l NaCl溶液中。在+4℃溫度下，用再生的纖維素膜將溶液針對水進行連續(xù)滲濾。在此過程中每克蛋白添加0.1毫摩爾辛酸鹽。
下面的表1a)顯示，在不添加羧酸鹽，例如辛酸鹽、酒石酸鹽、己酸或乙酸的鹽，的情況下進行滲濾后的鋁減少情況和檸檬酸鹽減少情況。表1a)未添加羧酸鹽
下面的表1b)顯示，在添加0.1毫摩爾辛酸鹽的情況下進行滲濾后的鋁減少情況和檸檬酸鹽減少情況。
b)添加辛酸鹽后
將此表與表1a)比較，也即與不添加辛酸鹽的相應(yīng)減少情況相比較，結(jié)果明顯表示每克蛋白添加0.1毫摩爾辛酸鹽后，比較未添加羧酸鹽如辛酸鹽，檸檬酸鹽減少和鋁減少明顯升高。
實施例2按照實施例1說明的方法，將含白蛋白沉淀溶解，接著滲濾。同時每克蛋白添加0.5毫摩爾己酸的鈉鹽。滲濾結(jié)束后得出以下鋁減少情況和辛酸鹽減少情況(表2)。
表2
由此表與表1a)比較，結(jié)果明顯表示與未添加己酸鹽的情況相比較，每克蛋白添加0.5毫摩爾己酸的鈉鹽后，辛酸鹽減少和鋁減少明顯升高。
實施例3孔恩氏級分的沉淀物，它含有的白蛋白純度為＞95％，以1+2(G/V；1kg于2l中)在中性pH-值下溶解于50g/l NaCl溶液中。在+4℃溫度下，用再生的纖維素膜將溶液針對水持續(xù)進行滲濾。在此過程中每克蛋白添加0.5毫摩爾辛酸鹽。
以下表3顯示，在每克蛋白不添加0.5毫摩爾辛酸鹽的情況下進行滲濾后的鋁減少情況和檸檬酸鹽減少情況。
表3
由此表與表1a)比較，結(jié)果明顯表示與未添加乙酸鹽的情況相比較，每克蛋白添加0.5毫摩爾乙酸鹽后，辛酸鹽減少和鋁減少明顯升高。
實施例4按照實施例1說明的方法，將含白蛋白沉淀溶解，接著滲濾。同時每克蛋白添加1.0毫摩爾酒石酸鹽。滲濾結(jié)束后得出以下鋁減少情況和辛酸鹽減少情況(表4)。表4
由此表與表1a)比較，結(jié)果明顯表示與未添加酒石酸鹽的情況相比較，每克蛋白添加1.0毫摩爾酒石酸鹽后，辛酸鹽減少和鋁減少明顯升高。
權(quán)利要求
1．應(yīng)用檸檬酸鹽血漿或者含有檸檬酸鹽的血漿級分物，制備一種含血漿蛋白藥物的方法，該藥物基本不含有非需要金屬，并且即使在含金屬器皿中貯藏時也不吸收金屬，該方法包括以下步驟-在非沉淀條件下，使在含有血漿蛋白的溶液中的檸檬酸鹽和任選結(jié)合在檸檬酸鹽上的金屬，與水溶性單-或二羧酸鹽、或者一種有機的單-或二羧酸發(fā)生交換，-獲得血漿蛋白或血漿蛋白類和-制備藥物。
2．按照權(quán)利要求1的方法，其特征為，所制備的含血漿蛋白的藥物，為含有一種或多種血漿蛋白的藥物，血漿蛋白選自凝血因子和纖維蛋白溶解因子、免疫球蛋白、糖蛋白和白蛋白。
3．按照權(quán)利要求1或2的方法，其特征為，應(yīng)用帶有2-20個碳原子的有機羧酸鹽，用于檸檬酸鹽的交換。
4．按照權(quán)利要求1至3之一的方法，其特征為，應(yīng)用辛酸鹽和/或酒石酸鹽用于檸檬酸鹽的交換。
5．按照權(quán)利要求1至3之一的方法，其特征為，應(yīng)用帶有2-4個碳原子的有機單-或二羧酸，用于檸檬酸鹽的交換。
6．按照權(quán)利要求1至5之一的方法，其特征為，所制備的含血漿蛋白藥物基本上不含鋁。
7．按照權(quán)利要求1至6之一的方法，其特征為，在滲濾、超濾或凝膠滲透色譜法或色譜分離方法的過程中進行檸檬酸鹽的交換，這些方法能夠?qū)Ⅺ}與蛋白分離。
8．按照權(quán)利要求1至7之一的方法，其特征為，在交換前將含血漿蛋白溶液提純和/或濃縮。
9．按照權(quán)利要求1至8之一的方法，其特征為，將含血漿蛋白的溶液在交換前和/或交換后進行處理，使可能存在的病毒失活，優(yōu)選進行熱處理。
10．按照權(quán)利要求1至9之一的方法，其特征為，在獲得血漿蛋白后，在單-或二羧酸鹽存在的條件下，直接進行病毒失活處理。
11．按照權(quán)利要求1至10之一的方法，其特征為，僅僅用不含檸檬酸鹽的成分制備藥物。
12．按照權(quán)利要求1至11之一的方法，其特征為，在氯化鈉存在的條件下，優(yōu)選用至少4重量％氯化鈉溶液，進行檸檬酸鹽的交換。
13．含血漿蛋白藥物，可以按照權(quán)利要求1至12之一的方法獲得，其非需要金屬的含量，尤其是鋁含量，低于100μg/l，優(yōu)選低于10μg/l，尤其是低于200ng/l。
全文摘要
本文說明了應(yīng)用檸檬酸鹽血漿或者含有檸檬酸鹽的血漿級分物,制備一種含血漿蛋白藥物的方法,該藥物基本不含有非需要金屬,該方法包括以下步驟:在非沉淀條件下,使在含有血漿蛋白的溶液中的檸檬酸鹽和任選結(jié)合在檸檬酸鹽上的金屬,與水溶性單－或二羧酸鹽、或者一種有機的單－或二羧酸發(fā)生交換;獲得血漿蛋白或血漿蛋白類和制備藥物。
文檔編號A61K38/00GK1230967SQ97197989
公開日1999年10月6日 申請日期1997年9月10日 優(yōu)先權(quán)日1996年9月16日
發(fā)明者W·特施內(nèi), Y·林諾, S·薩瓦托斯, H·伊格爾 申請人:伊姆諾股份公司