專利名稱：一種液體制劑靜脈注射用免疫血清球蛋白及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到一種血制品及其制備方法，具體說明是一種液體制劑靜脈注射用免疫血清球蛋白及其制備方法。
肌肉注射丙種球蛋白產(chǎn)品如用于靜脈注射是不安全的，引發(fā)相當?shù)牟涣挤磻?yīng)率，特別是丙種球蛋白缺乏癥的病人。反應(yīng)時血清補體水平降低主要是由于注射的丙種球蛋白與補體結(jié)合所致。丙種球蛋白結(jié)合補體的能力，稱為抗補體性，在血漿級分過程中由于蛋白變性而大大地增強，特別是與大分子量的物質(zhì)的聚合。這些聚合物的補體結(jié)合機理是抗體一抗原復合物的形成機理。如用超速離心方法除去這類聚合物，就可得到靜脈注射耐受性較好的低抗補體活性的產(chǎn)品。
已有好幾種途徑致力于使丙種球蛋白安全地用于靜脈注射。所有方法都依賴于消除它的抗補體活性。超速離心法技術(shù)上不太實用，而且用此法制成的丙種球蛋白貯存時其抗補體活性又會增強。在PH4.0下用胃蛋白酶處理丙種球蛋白以裂解分子得到沉降因子為5S的分子量約100，000的片段。雖然此片段保留了二價抗體活性，免除了抗補體活性，注射耐受性和效果較好，但治療有效時間很短，因它的半排出期僅為18小時，在丙種球蛋白缺乏癥患者身上半排出期可略長，相比未經(jīng)修飾的丙種球蛋白半排出期為19.8天，故很快的被排泄掉。雖然用胃蛋白酶處理的丙種球蛋白半排出期明顯縮短可能部分是由于其分子體積大大地被減小的緣故，但有證據(jù)表明代謝速率與被胃蛋白酶消化的分子部分的特殊性能有關(guān)。在本發(fā)明中，分子的這部分保持完整。用胃蛋白酶處理的另一個缺點是產(chǎn)品中剩余的胃蛋白酶具有動物屬性，能夠刺激人體中抗體的產(chǎn)生，特別是在重復注射用時。使用具有人體屬性的纖溶酶可以避免這個困難，也是另一種方法的基礎(chǔ)所在。
人纖溶酶處理的丙種球蛋白使其裂解為3個分子量約為50000的組分。當足夠低濃度的纖溶酶被使用時，只有15%的分子被裂解，85%仍保持為完整的丙種球蛋白。此完整的未被消化的丙種球蛋白僅有很小的抗補體活性，靜脈注射時無不良作用。此法的缺點是無法除去本部的纖溶酶。所以，即使產(chǎn)品貯存在4℃時降解仍繼續(xù)發(fā)生。
在PH4.0，37℃培養(yǎng)丙種球蛋白不同長的時間，觀察到抗補體活性降低到很低的水平。推測這是因為少量的血清酶成分存在于丙種球蛋白之中。和纖溶酶處理的丙種球蛋白相比較，發(fā)現(xiàn)這個“PH4.0丙種球蛋白”在貯存過程中以不可預料的速率抗補體活性重新增強，所以在注用時必須重新確認抗補體活性。纖溶酶處理的丙種球蛋白和PH4.0丙種球蛋白，在體內(nèi)與未經(jīng)修飾的丙種球蛋白相比，有較短的半排出期。例如，正常病人PH4.0丙種球蛋白半排出期為14天，纖溶酶處理的為16天。
在巴黎的法國國立輸血中心通過對嚴格挑選的新鮮血漿的仔細的級分和過濾，制造出含有低抗補體活性的靜脈注射丙種球蛋白。很明顯，它沒有完全的除去抗補體活性，需小心注射，而一些病人仍發(fā)生不良反應(yīng)。為避免此不良反應(yīng)，可在注射前用可的松，但抗補體活性的不完全去除限制了它的廣泛應(yīng)用。
還原丙種球蛋白分子中二硫鍵，然后用中止劑反應(yīng)，這對抗補體活性的影響也有研究。用0.2M胱胺酸處理7%的丙種球蛋白液，然后與0.2M碘乙酰胺反應(yīng)，可從幾乎完全地去除抗補體活性，而單獨使用上述兩個試劑效果則不明顯。由于碘乙酰胺的毒性，故研究者沒有進一步考慮有此方法制備靜脈注射丙種球蛋白。
也有方法首先還原丙種球蛋白分子中的雙硫鍵成-SH基團，然后再烷化這個-SH基因。然后分出產(chǎn)物，進行除菌。產(chǎn)品可靜脈注射，無明顯的和潛在的抗補體活性，而且半排出期和抗體活性與非修飾丙種球蛋白比較無改變。還有用羥丙酸β-內(nèi)酯處理制得的靜脈注射丙種球蛋白。然羥丙酸β-內(nèi)酯被認為是致癌物質(zhì)。胰蛋白酶也應(yīng)用于靜脈注射丙種球蛋白的制備。近年來，離子交換色譜法，聚乙二醇和樹脂級分法也已被發(fā)展起來。
國內(nèi)迄今尚無衛(wèi)生部批準的正式銷售的IVIG產(chǎn)品。衛(wèi)生部成都生物制品研究所研制的靜脈注射丙種球蛋白產(chǎn)品已獲得衛(wèi)生部試生產(chǎn)批準文號。其制劑是一種凍干產(chǎn)品，制品PH為4.0。
本發(fā)明的目的在于提供一種具有特定的酸度，其中單體含量大于90%，具有適宜的抗補體活性，可廣譜地治療病人的經(jīng)過非化學修飾和裂解處理的一種液體制靜脈注射用免疫血清球蛋白及其制備方法。
本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的發(fā)明制造過程的原料是健康人新鮮冰凍血漿、原料血漿或回收血漿，和免疫血漿如抗破傷風、麻疹等特種免疫血漿。在正常情況下，健康人血漿中含有白蛋白，α球蛋白，β球蛋白，γ球蛋白等多種成分，其中白蛋白占約55%，α球蛋白占約14%，β球蛋白占約16%，γ球蛋白占約11%?！叭嗣庖哐迩虻鞍住庇脕矶x這樣一個物質(zhì)。在文獻中通常也稱為丙種球蛋白(γ球蛋白)，免疫丙種球蛋白和免疫球蛋白G。在電泳分析中，免疫血清球蛋白主要出現(xiàn)在γ球蛋白部分，γ球蛋白幾乎全部是Ig，因此過去曾將γ球蛋白用作Ig的同義語。按Ig的免疫化學特異性，可將Ig分成五類，即IgG、IgA、IgM、IgD、和IgE，分子量和分子大小各有不同。
上述血漿原料通過經(jīng)典的孔氏法除去組分Ⅰ沉淀后，又通過我們稱之為“改良的孔氏冷酒精分離法”進行分離。具體的操作如下。加入-15℃或更冷的95%酒精使其溶液中酒精濃度達到20%，用PH4.0的緩沖液調(diào)節(jié)PH6.9。在此過程中隨著酒精濃度的增大，溫度逐漸的降低到-5℃，隨后維持這個-5℃的溫度。所用的PH4.0緩沖液，其中醋酸鈉對醋酸的摩爾比為0.2，較方便的配制方法是200ML4M醋酸鈉和400ML10M醋酸混合，用水稀釋至1升即可。此PH4.0緩沖液在水稀釋8倍后在25℃下用PH計測量，PH仍應(yīng)為4.00+(-)0.02。組分Ⅱ+Ⅲ沉淀形成，通過在-5℃下的離心可分離出來，電泳測定表明其主要成分是β和γ球蛋白。它含有幾乎所有的免疫球蛋白和協(xié)同凝聚因素，也含有大量的膽甾醇和脂類物質(zhì)。組分Ⅱ＋Ⅲ沉淀可貯藏于-20℃以下的冰庫中，以備用來制造靜脈注射免疫球蛋白。
組分Ⅱ＋Ⅲ沉定重新懸浮于含有醋酸鹽(如醋酸鈉)和糖醇(或碳水化合物)的水溶液中，此時醋酸鹽可以是醋酸鈉或相似物質(zhì)，糖醇可以是甘露糖醇，山梨醇或相似物質(zhì);碳水化合物可以是葡萄糖、麥芽糖，果糖、蔗糖、乳糖或相似物質(zhì)。溶液溫度需維持在0-10℃之間，太高的溫度會使蛋白變性。通過加入-15℃或更冷的95%酒精使得其溶液中酒精濃度達到18-22%，及調(diào)節(jié)溶液PH至PH至5.0-7.0，在此過程中逐漸的降低產(chǎn)品溫度到-4.0--6.0℃，這樣組分Ⅱ＋Ⅲ-W沉淀可形成，選擇這樣的條件，除去了大部分的膽固醇及類胡蘿卜素色素，絕大部分的抑制活性物質(zhì)也被除去。在這沉淀中，主要含有丙種球蛋白，協(xié)同凝聚因素，纖溶酶原和凝血酶原。在溫度-4.0--6.0℃條件下，控制流速不大于70Kg/小時，通過離心得到組分Ⅱ＋Ⅲ-W沉淀重新懸浮含有醋酸鹽和糖醇(或碳水化合物)的水溶液中，此時醋酸鹽可以是醋酸鈉或相似物質(zhì)，糖醇可以是甘露糖醇，山梨醇或相似物質(zhì)，碳水化合物可以是葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、果糖或相似物質(zhì)。PH調(diào)節(jié)用PH4.0緩沖液。當懸浮溶解結(jié)束后PH4.0緩沖液調(diào)節(jié)溶液PH至5.5+(-)0.5，加入95%-15℃或更冷的酒精以提高懸浮液酒精濃度，在加酒精過程中降低溫度至-6.0℃，但降低溫度需防止結(jié)冰。充分的攪拌數(shù)小時使沉淀形成完全。沉淀用離心方法除去，離心時溫度為-5.0--7.0℃，流速控制在不大于70kg/小時。得到沉淀為組分Ⅲ，放棄不用。組分Ⅲ沉淀其中含有協(xié)同凝聚因素，纖溶酶原和凝血酶原，在這步離心時除去。剩余組分Ⅱ離心上清液然后用過濾方法澄清，溫度仍控制在-4.0--7.0℃。此離心上清液過濾后稱之為組分Ⅲ濾液，含有大量的丙種球蛋白成分，可進一步應(yīng)用孔氏法沉淀離心得到組分Ⅱ沉淀。組分Ⅱ，根據(jù)超速離心研究表明，主要含有平均分子量為160000的沉降系數(shù)為7的丙球(占85%)，其它蛋白主要是9S(沉降系數(shù)為9)物質(zhì)，分子量約300000。組分Ⅱ沉淀(大約含有30%固體)可冷凍干燥得到免疫血清球蛋白粉未，再溶解就可制成16.5%的肌注無菌溶液。在本發(fā)明中，上述免疫血清球蛋白粉未，濕的組分Ⅱ膏體或組分Ⅲ濾液都可用于下一步的制造過程。濕的組分Ⅱ膏體或凍干的免疫血清球蛋白粉未溶解于適當?shù)乃谢蚱渌磉m用的溶液中，制備成濃度約為1-10%的溶液。組分Ⅲ濾液可直接用于下一步。
上述溶液通過加入生理適應(yīng)的酸溶液如鹽酸調(diào)節(jié)PH至3.5-5.0，最好在3.8-4.2之間，通常來，PH需恰當?shù)恼{(diào)節(jié)，使溶液中蛋白單體物質(zhì)濃度達到最大。當然，PH也不能太低，否則易引起凝聚。溫度也應(yīng)對免疫血清球蛋白物質(zhì)沒有有害的影響。如溫度控制在0-20℃(對組分Ⅱ或凍干免疫血清球蛋白)，或與-5-+5℃(對組分Ⅲ濾液)可得到較好的結(jié)果。此時不必將溶液放置一段時間后再進下一步;當然，如果沒有什么不利影響，也可放置一段時間。
PH調(diào)節(jié)后需降低蛋白溶液的離子強度。組分Ⅲ濾液PH調(diào)節(jié)后需先用常用的方法適當?shù)慕档推渚凭珴舛龋龃笃涞鞍诐舛冗_到1-10%的范圍。離子強度(Γ/2)定義如下Γ/2＝ (Σ{[C＋]2(Z＋)2+[C-]2(Z-)2})/2C+＝陽離子濃度，包括金屬離子如Na+，K+，Ca+2，Mg+2，等;
C-＝陰離子濃度，包括鹵素離子如Cl-，Br-，羥酸鹽離子如醋酸，草酸陰離子;
Z+＝C+的電價;
Z-＝C-的電價需使溶液的離子強度降低到0.001以下?？捎贸瑸V，透析等或相結(jié)合方法。例如，蛋白溶液在適宜的PH下至少需用5倍體積的水進行透析，通常需5-8倍體積的水進行交換洗滌才能使溶液離子強度降低到至少0.001。在此步處理過程中，小分子多肽類物質(zhì)及一些雜質(zhì)如酒精等的濃度降低到很小的水平。
降低離子強度后，調(diào)節(jié)蛋白濃度至接近終產(chǎn)品的濃度范圍。比如，5%，10%，15%等。濃縮步驟可采用常規(guī)技術(shù)，以不損壞免疫血清球蛋白為目的，如，超濾，反滲透，蒸發(fā)等。上述洗滌和濃縮過程中溶液PH保持在3.5-5.0的范圍內(nèi)，最好在3.8-4.2范圍內(nèi)。溫度在0-20℃范圍內(nèi)。
接下來，加入穩(wěn)定劑以使上述蛋白溶液能夠承受高溫的處理。加入山梨醇至其濃度達33%，然后進行巴氏滅菌，溫度60℃＋/-0.5℃時間10-11小時。
經(jīng)過病毒滅活處理后，用酸如鹽酸等調(diào)節(jié)PH至4.5-5.5，又經(jīng)過洗滌和濃縮步驟以除去過量的穩(wěn)定劑，最后使穩(wěn)定劑濃度達到適宜的濃度，以使溶液的滲透性到人體能接受。溫度控制在0℃-20℃之間。蛋白濃度也用上述方法調(diào)節(jié)。PH維持在4.5-5.5，抗補體活性為0.5mg/CH50。
上述溶液然后除菌，通常用適當?shù)臑V器進行無菌過濾，然后罐裝到成品瓶中適宜人體使用。
用上述方法制備的液體制劑靜脈注射用免疫血清球蛋白，其積極效果在于沒有經(jīng)化學修飾和裂解，諸如還原烷化，羥丙酸β-內(nèi)酯處理，總蛋白濃度為5%其濁度小于15NTU，PH在4.5-5.5范圍內(nèi)，含有穩(wěn)定劑，具有生理耐受的品體滲透壓，具有低鈉離子濃度，單體含量大于90%，純度大于96%，抗補體活性不小于0.3mg/CH50。聚合物含量低。免疫球蛋白的物理特性和生物功能基本上無改變。所含的穩(wěn)定劑可以是氨基酸類物質(zhì)，碳水化合物，或糖醇，或基混合物。產(chǎn)品中的抗體滴度于原料的抗體滴度沒有明顯的不同。
上述制品主要用于靜脈注射。雖然也可肌注。使用時可視情況配制或稀釋到所需濃度，再注射。靜脈注射時可單獨使用，也可與其它血液制品混用，如全血，血漿，血漿蛋白組分，纖維蛋白元，凝血因子如八因子，九因子濃縮制劑等，及白蛋白。本發(fā)明丙球產(chǎn)品基本上無抗補體活性。
實施例血漿原料通過經(jīng)典的孔氏法除去組分Ⅰ沉淀后，加入-15℃或更冷的95%酒精使其溶液中酒精濃度達到20%，用PH4.0的緩沖液調(diào)節(jié)PH至6.9。在此過程中隨著酒精濃度的增大，溫度逐漸的降低到-5℃，隨后維持這個-5℃的溫度。組分Ⅱ＋Ⅲ沉淀形成，通過在-5℃下的離心分離，組分Ⅱ＋Ⅲ沉淀貯藏于-20℃以下的冰庫中備用。
組分Ⅱ＋Ⅲ沉淀50.7kg重新懸浮于含有醋酸鹽和穩(wěn)定劑的水溶液中，以混合成懸浮液。溶液溫度維持在0-10℃之間。通過加入-15℃或更冷的95%酒精使得其溶液中酒精濃度達到18-22%，及調(diào)節(jié)溶液PH至PH到5.0-7.0，在此過程中逐漸的降低產(chǎn)品溫度到-4.0--6℃，這樣組分Ⅱ＋Ⅲ-W沉淀就可形成。在溫度-4.0--6.0℃條件下，控制流速不大于70kg/小時，通過離心得到組分Ⅱ＋Ⅲ-W42.5kg。
上述組分Ⅱ＋Ⅲ-W沉淀重新懸浮于含有醋酸鹽和穩(wěn)定劑的水溶液中，見前所述，PH調(diào)節(jié)PH4.0緩沖液。當懸浮溶解結(jié)束后用PH4.0緩沖液調(diào)節(jié)溶液PH至5.2+(-)0.3，加入95%-15℃或更冷的酒精以提高懸浮液酒精濃度，在加酒精過程中降低溫度至-6.0℃。充分的攪拌數(shù)小時使沉淀形成完全。沉淀用離心方法除去，離心時溫度為-5.0--7.0℃，流速控制在不大于70kg/小時。得到沉淀為組分Ⅲ，重30kg，放棄不用。剩余組分Ⅱ離心上清液重880kg，用過濾方法澄清，溫度仍控制在-4.0--7.0℃。此離心上清液過濾后稱之為組分Ⅲ濾液。
上述溶液通過加入鹽酸調(diào)節(jié)PH至3.5-5.0，最好在3.8-4.2之間。溫度控制在-5-+5℃。
用超濾方法進行洗滌和濃縮。先濃縮蛋白溶液至較小的體積，再適宜的用注射用水洗滌降低酒精濃度，然后用5-8倍體積的水進行交換洗滌。使溶液離子強度降低到小于0.001(估計值)。在此步處理過程中，小分子多肽類物質(zhì)及一些雜質(zhì)如酒精等的濃度降低到很小的水平，蛋白濃度調(diào)節(jié)至接近終產(chǎn)品的濃度范圍(5%)，濃縮步驟仍用超濾技術(shù)。上述洗滌和濃縮過程中溶液PH保持在3.5-5.0的范圍，最好在3.8-4.2范圍內(nèi)。溫度在0-20℃范圍內(nèi)。
接下來，加入穩(wěn)定劑以使上述蛋白溶液能夠承受高溫處理。加入山梨醇25kg至其濃度達33%，除菌過濾后進行巴氏滅菌，溫度在60＋/-0.5℃時間用10-11小時。
經(jīng)過病毒滅活處理后，用鹽酸調(diào)節(jié)PH至4.5-5.5，又經(jīng)過洗滌和濃縮步驟(見上)以除去過量的穩(wěn)定劑，最后使穩(wěn)定劑濃度達到5%。溫度控制在0-20℃之間。蛋白濃度也用上述方法調(diào)節(jié)。得到半成品重54kg。
上述溶液然后除菌，通常用適當?shù)臑V器進行無菌過濾，然后罐裝到成品瓶中。
成品經(jīng)質(zhì)量檢驗，主要指標均符合要求。見下表檢測項目結(jié)果外觀合格純度97.8%蛋白質(zhì)總量5.01%IgA含量4.44mg/dlPKG<35IU/ml抗補體活性(ACA)0.50mg/CH50熱穩(wěn)定性(57℃,4小時)合格聚合物(高效液相)1.68%單體+雙聚體(高效液相)98.21%碎片(高效液相)0.11%
權(quán)利要求
1.一種液體制劑靜脈注射用免疫血清球蛋白的制備方法，用冷酒精沉淀法進行血漿級分除去組分Ⅰ沉淀得到組分Ⅱ+Ⅲ沉淀，處理組分Ⅱ+Ⅲ沉淀得組分Ⅱ+Ⅲ-W沉淀，處理組分Ⅱ+Ⅲ-W沉淀除去組分Ⅲ沉淀得組分Ⅱ沉淀或免疫血清球蛋白粉未或組分Ⅲ濾液，進一步處理組分Ⅲ濾液最終制備靜脈注射免疫血清球蛋白，本發(fā)明特征在于用冷酒精沉淀法進行血漿級分得到組分Ⅱ+Ⅲ沉淀后，進一步處理而得到Ⅱ沉淀或免疫血清球蛋白粉未或組分Ⅲ濾液，最終制備靜脈注射免疫血清球蛋白產(chǎn)品過程中，應(yīng)用一種或多種物質(zhì)加入到產(chǎn)品溶液中，此類物質(zhì)可以是糖醇或碳水化合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種液體制劑靜脈注射用免疫血清球蛋白的制備方法，其特征在于所述的糖醇，可以是甘露糖醇或山梨醇。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種液體制劑靜脈注射用免疫血清球蛋白的制備方法，其特征在于所述的碳水化合物可以是葡萄糖、麥芽糖、果糖、蔗糖、乳糖。
4.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述方法制備的一種液體制劑靜脈注射用免疫血清球蛋白，其特征在于沒有經(jīng)化學修飾和裂解，總蛋白濃度5±1%，其濁度小于15NTU，PH在4.5-5.5范圍內(nèi)，含有穩(wěn)定劑，具有生理耐受的晶體滲透壓，單體含量大于90%，純度大于96%，抗補體活性不小于0.3mg/CH50。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種液體制劑靜脈注射用免疫血清球蛋白，其特征在于所述的穩(wěn)定劑可以是氨基酸類物質(zhì)，碳水化合物，糖醇或其混合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種液體制劑靜脈注射用免疫血清球蛋白，其特征在于在液體狀態(tài)下，穩(wěn)定劑存在下，溫度為60＋/-0.5℃加熱靜脈注射免疫血清球蛋白成品或中間產(chǎn)品10-11小時進行病毒滅活和滅菌。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種液體制劑靜脈注射用免疫血清球蛋白及其制備方法。通過血漿級分得到組分II+III沉淀后，進一步處理而得到II沉淀或免疫血清球蛋白粉末或組分III濾液，最終制備靜脈注射免疫血清球蛋白產(chǎn)品過程中，應(yīng)用一種或多種物質(zhì)加入到產(chǎn)品溶液中，此類物質(zhì)可以是糖醇或碳水化合物。所制成品沒有經(jīng)化學修飾和裂解，總蛋白濃度5±1％，其濁度小于15NTU，pH在4.5～5.5范圍內(nèi)，含有穩(wěn)定劑，具有生理耐受的晶體滲透壓，單體含量大于90％，純度大于96％，抗補體活性不小于0.3mg/CH50。
文檔編號A61K9/08GK1091979SQ93112619
公開日1994年9月14日 申請日期1993年12月3日 優(yōu)先權(quán)日1993年12月3日
發(fā)明者黃凱, 何秋, 徐俊, 王玲, 肖煜, 虞波, 沈積慧 申請人:中美合資上海萊士血制品有限公司