專利名稱：一種抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌復(fù)合特異性IgY抗體及其制備方法和牙膏的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及IgY抗體及其制備方法和該IgY制劑的應(yīng)用，特別涉及抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌復(fù)合特異性IgY制劑及其制備方法，以及用該IgY抗體制備的預(yù)防由這兩種菌引起的牙齦炎癥及其口臭的牙膏。
背景技術(shù)：
我國(guó)牙銀、牙周疾病發(fā)病率占人口的70%以上,牙銀P卜啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis)是慢性齦緣炎、慢性牙周炎、侵襲性牙周炎等牙周病的主要可疑致病菌，其菌毛能夠與口腔上皮細(xì)胞表面的甘油醛-3-磷酸脫氫酶結(jié)合，侵入牙齦上皮細(xì)胞和牙齦成纖維細(xì)胞，逃避免疫清除。牙齦卟啉單胞菌產(chǎn)生二肽酰氨肽酶降解結(jié)締組織，促進(jìn)MMP-2和MMP-1活性增加。牙齦卟啉單胞菌的精氨酸和賴氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(RgpA、RgpB,·Kgp)能水解L-12導(dǎo)致INNy產(chǎn)生減少。部分牙齦卟啉單細(xì)胞毛能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表達(dá)L-1a、L-1 β、L_6、TNF a導(dǎo)致牙槽骨破壞。在牙周病患者同時(shí)伴隨著口臭的發(fā)生，其口臭主要有具核梭桿菌引起。目前沒有有效的治療口臭的方法，使用抗菌素類藥物治療口臭有很多弊端。對(duì)于預(yù)防和治療牙周病及其口臭從主要的病因菌牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌中著手是關(guān)鍵所在。目前用于預(yù)防和治療牙周炎的牙膏一般為含有中草藥成分的牙膏。雖然這類的專利有很多，但均無(wú)明確療效?，F(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道表明臨床上使用特異性IgY抗體預(yù)防齲齒和治療嬰幼兒輪狀病毒性腹瀉，預(yù)防肺纖維化患者綠膿桿菌感染，減輕幽門螺桿菌引起的胃痛效果顯著，且無(wú)副作用和成癮性。在我們研究的許多種類的IgY中發(fā)現(xiàn)，有的牙周病因菌免疫母雞產(chǎn)生的IgY抗體經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明沒有或沒有明顯的抑制牙周病及其口臭的趨勢(shì)和療效。簡(jiǎn)單的說，不是所有的IgY都有明顯的治療作用。由于牙周病及其口臭的可疑病因菌有十一種之多，但主要的可疑病因菌包括牙齦卟啉單胞菌、具核梭桿菌、伴放線菌放線桿菌、棲牙密螺旋體、福氏擬桿菌、牙齦二氧化碳噬纖維菌等。在探索制備對(duì)應(yīng)的IgY用于治療牙周病及其口臭的同時(shí)，我們推測(cè)牙齦卟啉單胞菌、具核梭桿菌、伴放線菌放線桿菌、棲牙密螺旋體、福氏擬桿菌、牙齦二氧化碳噬纖維菌都有可能引起牙周病及其口臭；因?yàn)槲覀兪孪葻o(wú)法預(yù)測(cè)在這當(dāng)中的哪些菌是引起牙周病及其口臭的主要因素，哪些菌是引起牙周病及其口臭是次要因素。我們認(rèn)為必須有合適的抗牙周病及其口臭的試驗(yàn)來(lái)確定哪些菌是引起牙周病及其口臭的主要因素。從而指導(dǎo)制備抗牙周病及其口臭的藥物或衛(wèi)生產(chǎn)品。目前的現(xiàn)有技術(shù)沒有相關(guān)的提示指導(dǎo)技術(shù)人員發(fā)現(xiàn)抗牙齦卟啉單胞菌、具核梭桿菌復(fù)合IgY是解決治療牙周病及其口臭的關(guān)鍵。
技術(shù)人員無(wú)法預(yù)先在不做抗牙周病及其口臭的實(shí)驗(yàn)的前提下，預(yù)先得知牙齦卟啉單胞菌、具核梭桿菌是引起牙周病及其口臭的主要因素。技術(shù)人員無(wú)法預(yù)先在不做抗牙周病及其口臭的實(shí)驗(yàn)的前提下，預(yù)先得知抗牙齦卟啉單胞菌、具核梭桿菌復(fù)合IgY比單獨(dú)的抗牙齦卟啉單胞菌IgY、單獨(dú)的抗具核梭桿菌IgY的效果更好。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之一在于提供抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌復(fù)合特異性IgY制劑。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之二在于提供上述抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌復(fù)合特異性IgY制劑的制備方法。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之三在于提供含上述抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿 菌復(fù)合特異性IgY制劑的用于預(yù)防由這兩種菌引起的牙周炎癥及其口臭的牙膏。作為本發(fā)明第一方面的抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌復(fù)合特異性IgY制劑，其特征在于，由10 70重量份的牙齦卟啉單胞菌菌體和菌體碎片與30 90重量份的具核梭桿菌菌體和菌體碎片復(fù)合成抗原免疫產(chǎn)蛋母雞而制備。作為本發(fā)明第二方面的抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌復(fù)合特異性IgY制劑的制備方法，其特征在于，包括如下步驟A.牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌培養(yǎng)步驟A.1細(xì)菌種類牙銀P卜啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis)和具核梭桿菌(Fusobacterium nucleatum)；A. 2取牙齦卟啉單胞菌(P. g)ATCC33277菌株和具核梭桿菌(Fn)ATCC10953菌株，分別經(jīng)BH1-S培養(yǎng)基分離培養(yǎng)和擴(kuò)增培養(yǎng)的牙齦卟啉單細(xì)胞菌、具核梭桿菌，并經(jīng)鑒定確認(rèn)為牙齦卟啉單胞菌、具核梭桿菌而得到牙齦卟啉單胞菌菌體和菌體碎片、具核梭桿菌菌體和菌體碎片；B.免疫原制備步驟B.1取牙齦卟啉單胞菌菌體和菌體碎片10 70重量份，具核梭桿菌菌體和菌體碎片30 90重量份復(fù)合成菌液抗原；B. 2將等體積的菌液抗原與等體積的福氏完全佐劑復(fù)合，使用高速攪拌器攪拌乳化，最終制成油包水福氏完全佐劑牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌復(fù)合免疫原；每毫升福氏完全佐劑復(fù)合免疫原含有細(xì)菌10億-80億；B. 3將等體積的復(fù)合菌液與等體積的福氏不完全佐劑復(fù)合，使用高速攪拌器攪拌乳化，最終制成油包水福氏不完全佐劑牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌復(fù)合免疫原，每毫升福氏不完全佐劑復(fù)合免疫原中含有細(xì)菌10億-80億；C.免疫步驟使用注射器將福氏完全佐劑復(fù)合免疫原皮下和肌肉注射給產(chǎn)蛋母雞，每只產(chǎn)蛋母雞注射O. 5ml-3. Oml免疫原，然后每隔一周使用福氏不完全佐劑復(fù)合免疫原O. 5ml_3. Oml皮下和肌肉注射給產(chǎn)蛋母雞。加強(qiáng)免疫二次后，此后每隔十周再使用福氏不完全佐劑復(fù)合免疫原O. 5ml-3. Oml皮下和肌肉注射給產(chǎn)蛋母雞加強(qiáng)免疫五次，前后共免疫八次；
D.抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌復(fù)合特異性IgY提取物的制備收集免疫第一次免疫后第28天的免疫母雞雞蛋，使用75%的酒精進(jìn)行雞蛋表面消毒，打開蛋殼取蛋黃，去除蛋黃膜取蛋黃液，將蛋黃液與蒸餾水按體積比1:10的比例加蒸餾水，充分?jǐn)嚢?，并使用冰醋酸調(diào)節(jié)酸堿度至PH5. 30-5. 50,然后放置-20°c凍藏3天后取出解凍，取上清液，用凝膠過濾系統(tǒng)將蛋黃液濃縮20倍，用IN NaOH調(diào)節(jié)PH至7. 0-8. 0，置-20°C保藏。上述抗牙銀卟啉單胞菌和具核梭桿菌復(fù)合特異性IgY制劑的制備方法，在所述步驟D后增加一 IgY純化步驟，具體是將抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌復(fù)合特異性IgY提取物加硫酸胺至55%的飽和度，充分?jǐn)嚢?，室溫靜置2小時(shí)，然后高速離心10分鐘，取沉淀，將沉淀使用蒸餾水稀釋到原體積量，再加硫酸胺至33%的飽和度，充分?jǐn)嚢?，室溫靜置2小時(shí)，然后高速離心10分鐘，取沉淀，用蒸餾水稀釋溶解后裝入透析袋，用蒸餾水經(jīng)中空纖維 過濾器除鹽，即得抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌復(fù)合特異性IgY制劑純品。在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述步驟D用以下方法所取代收集免疫第一次免疫后第28天的免疫母雞雞蛋，用75%酒精消毒雞蛋外殼，打碎蛋殼，留取蛋黃。用去離子水10倍稀釋蛋黃后，用冰醋酸和無(wú)水乙酸鈉調(diào)節(jié)PH至5. 30-5. 50.，4°C沉降后取上清液，添加2%的殼聚糖和海藻酸鈉，2%氯化鈣和多聚磷酸鈉絮凝沉降，再取上清液用凝膠過濾系統(tǒng)超濾去除多余的去離子水，將蛋黃液濃縮20倍左右，用IN氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH至7. 0-8. 0，置-20°C保藏。作為本發(fā)明第三方面的用上述抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌復(fù)合特異性IgY制劑制備的用于預(yù)防牙齦炎及其口臭的牙膏，包含有抗牙周致病菌IgY制劑，所述抗牙周致病菌IgY制劑由占牙膏總質(zhì)量的質(zhì)量百分比原料組成抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌復(fù)合特異性IgY制劑O. 01 0.5%、洗必泰O. 01-2. 0%、甘油1. 0-30. 0%、聚乙烯吡咯烷酮O. 1-2. 0%，其中洗必泰、甘油、聚乙烯吡咯烷酮構(gòu)成抗牙銀卟啉單胞菌和具核梭桿菌復(fù)合特異性IgY制劑保護(hù)劑。在本發(fā)明所述用于預(yù)防牙齦炎及其口臭的牙膏的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，還包含牙膏膏劑，所述牙膏膏劑由占牙膏總質(zhì)量的質(zhì)量百分比原料組成卡波浦爾O.1 O. 5%、羧甲基纖維素鈉O. 5 1. 3%、卡拉膠O. 2 O. 5%,黃原膠O. 3 O. 7%,甘油5. O 20. 0%,山梨醇5. O 70. 0%,阿斯巴甜O.1 O. 5% ;糖精鈉O.1 O. 3%, PEG-6000. 5 5. 0%,PEG-12000. 5 5. 0%,椰油酰胺丙基甜菜堿O. 1-2. 0%,香精O. 8 2. 0%, Si021. O 30%,去離子水余量。本發(fā)明用于治療與預(yù)防牙周病及口臭的牙膏對(duì)預(yù)防和治療牙周病及其口臭具有明顯的效果。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)現(xiàn)方案。下面實(shí)施例所涉及的菌種皆由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供。實(shí)施例1 :抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌復(fù)合特異性IgY制劑的制備A.牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌培養(yǎng)步驟
A.1細(xì)菌種類牙銀卩卜啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis)和具核梭桿菌(Fusobacterium nucleatum)；A. 2取牙齦卟啉單胞菌(P. g)ATCC33277菌株和具核梭桿菌(Fn)ATCC10953菌株，分別經(jīng)BH1-S培養(yǎng)基分離培養(yǎng)和擴(kuò)增培養(yǎng)的牙齦卟啉單細(xì)胞菌、具核梭桿菌，并經(jīng)鑒定確認(rèn)為牙齦卟啉單胞菌、具核梭桿菌而得到牙齦卟啉單胞菌菌體和菌體碎片、具核梭桿菌菌體和菌體碎片；B.免疫原制備步驟B.1取牙齦卟啉單胞菌菌體和菌體碎片10 70重量份，具核梭桿菌菌體和菌體碎片30 90重量份復(fù)合成菌液抗原；B. 2將等體積的菌液抗原與等體積的福氏完全佐劑復(fù)合，使用高速攪拌器攪拌乳化，最終制成油包水福氏完全佐劑牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌復(fù)合免疫原；每毫升福氏完全佐劑復(fù)合免疫原含有細(xì)菌10億-80億； B. 3將等體積的復(fù)合菌液與等體積的福氏不完全佐劑復(fù)合，使用高速攪拌器攪拌乳化，最終制成油包水福氏不完全佐劑牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌復(fù)合免疫原，每毫升福氏不完全佐劑復(fù)合免疫原中含有細(xì)菌10億-80億；C.免疫步驟使用注射器將福氏完全佐劑復(fù)合免疫原皮下和肌肉注射給產(chǎn)蛋母雞，每只產(chǎn)蛋母雞注射O. 5ml-3. Oml免疫原，然后每隔一周使用福氏不完全佐劑復(fù)合免疫原O. 5ml_3. Oml皮下和肌肉注射給產(chǎn)蛋母雞。加強(qiáng)免疫二次后，此后每隔十周再使用福氏不完全佐劑復(fù)合免疫原O. 5ml-3. Oml皮下和肌肉注射給產(chǎn)蛋母雞加強(qiáng)免疫五次，前后共免疫八次；D.抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌復(fù)合特異性IgY提取物的制備收集免疫第一次免疫后第28天的免疫母雞雞蛋，使用75%的酒精進(jìn)行雞蛋表面消毒，打開蛋殼取蛋黃，去除蛋黃膜取蛋黃液，將蛋黃液與蒸餾水按體積比1:10的比例加蒸餾水，充分?jǐn)嚢?，并使用冰醋酸調(diào)節(jié)酸堿度至PH5. 30-5. 50,然后放置-20°c凍藏3天后取出解凍，取上清液，用凝膠過濾系統(tǒng)將蛋黃液濃縮20倍，用IN NaOH調(diào)節(jié)PH至7. 0-8. 0，置-20°C保藏。E.1gY純化步驟將抗牙銀卟啉單胞菌和具核梭桿菌復(fù)合特異性IgY提取物加硫酸胺至55%的飽和度，充分?jǐn)嚢瑁覝仂o置2小時(shí)，然后高速離心10分鐘，取沉淀，將沉淀使用蒸餾水稀釋到原體積量，再加硫酸胺至33%的飽和度，充分?jǐn)嚢?，室溫靜置2小時(shí)，然后高速離心10分鐘，取沉淀，用蒸餾水稀釋溶解后裝入透析袋，用蒸餾水經(jīng)中空纖維過濾器除鹽，即得抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌復(fù)合特異性IgY抗體直接純品?？寡例l卟啉單胞菌和具核梭桿菌復(fù)合特異性IgY制劑純品經(jīng)ELISA方法測(cè)定，抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌復(fù)合特異性IgY純品中每毫克蛋白中的特異性IgY抗體的效價(jià)為1:32000/mg蛋白，或者稱抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌復(fù)合特異性IgY純品中，每毫克蛋白中的特異性IgY抗體的比活性為1:32000。在IgY抗體純品中，IgY抗體的純度經(jīng)非還原性SDS-PAGE測(cè)定為89. 3%。實(shí)施例2:抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌復(fù)合特異性IgY制劑的制備
A.牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌培養(yǎng)步驟A.1細(xì)菌種類牙銀P卜啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis)和具核梭桿菌(Fusobacterium nucleatum)；A. 2取牙齦卟啉單胞菌(P. g)ATCC33277菌株和具核梭桿菌(Fn)ATCC10953菌株，分別經(jīng)BH1-S培養(yǎng)基分離培養(yǎng)和擴(kuò)增培養(yǎng)的牙齦卟啉單細(xì)胞菌、具核梭桿菌，并經(jīng)鑒定確認(rèn)為牙齦卟啉單胞菌、具核梭桿菌而得到牙齦卟啉單胞菌菌體和菌體碎片、具核梭桿菌菌體和菌體碎片；B.免疫原制備步驟B.1取牙齦卟啉單胞菌菌體和菌體碎片10 70重量份，具核梭桿菌菌體和菌體碎片30 90重量份復(fù)合成菌液抗原；
B. 2將等體積的菌液抗原與等體積的福氏完全佐劑復(fù)合，使用高速攪拌器攪拌乳化，最終制成油包水福氏完全佐劑牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌復(fù)合免疫原；每毫升福氏完全佐劑復(fù)合免疫原含有細(xì)菌10億-80億；B. 3將等體積的復(fù)合菌液與等體積的福氏不完全佐劑復(fù)合，使用高速攪拌器攪拌乳化，最終制成油包水福氏不完全佐劑牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌復(fù)合免疫原，每毫升福氏不完全佐劑復(fù)合免疫原中含有細(xì)菌10億-80億；C.免疫步驟使用注射器將福氏完全佐劑復(fù)合免疫原皮下和肌肉注射給產(chǎn)蛋母雞，每只產(chǎn)蛋母雞注射O. 5ml-3. Oml免疫原，然后每隔一周使用福氏不完全佐劑復(fù)合免疫原O. 5ml_3. Oml皮下和肌肉注射給產(chǎn)蛋母雞。加強(qiáng)免疫二次后，此后每隔十周再使用福氏不完全佐劑復(fù)合免疫原O. 5ml-3. Oml皮下和肌肉注射給產(chǎn)蛋母雞加強(qiáng)免疫五次，前后共免疫八次；D.抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌復(fù)合特異性IgY提取物的制備收集免疫第一次免疫后第28天的免疫母雞雞蛋，用75%酒精消毒雞蛋外殼，打碎蛋殼，留取蛋黃。用去離子水10倍稀釋蛋黃后，用冰醋酸和無(wú)水乙酸鈉調(diào)節(jié)PH至
5.30-5. 50.，4°C沉降后取上清液，添加2%的殼聚糖和海藻酸鈉，2%氯化鈣和多聚磷酸鈉絮凝沉降，再取上清液用凝膠過濾系統(tǒng)超濾去除多余的去離子水，將蛋黃液濃縮20倍左右，用IN氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH至7. 0-8. O,置-20°C保藏。E.1gY純化步驟將抗牙銀卟啉單胞菌和具核梭桿菌復(fù)合特異性IgY提取物加硫酸胺至55%的飽和度，充分?jǐn)嚢瑁覝仂o置2小時(shí)，然后高速離心10分鐘，取沉淀，將沉淀使用蒸餾水稀釋到原體積量，再加硫酸胺至33%的飽和度，充分?jǐn)嚢?，室溫靜置2小時(shí)，然后高速離心10分鐘，取沉淀，用蒸餾水稀釋溶解后裝入透析袋，用蒸餾水經(jīng)中空纖維過濾器除鹽，即得抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌復(fù)合特異性IgY抗體直接純品?？寡例l卟啉單胞菌和具核梭桿菌復(fù)合特異性IgY制劑純品經(jīng)ELISA方法測(cè)定，抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌復(fù)合特異性IgY純品中每毫克蛋白中的特異性IgY抗體的效價(jià)為1:32000/mg蛋白，或者稱抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌復(fù)合特異性IgY純品中，每毫克蛋白中的特異性IgY抗體的比活性為1:32000。在IgY抗體純品中，IgY抗體的純度經(jīng)非還原性SDS-PAGE測(cè)定為89. 3%。實(shí)施例3
單獨(dú)取牙齦卟啉單胞菌菌體和菌體碎片作為菌液；單獨(dú)制備抗牙齦卟啉單胞菌特異性IgY提取物。其余制備參照實(shí)施例1。實(shí)施例4 單獨(dú)取具核梭桿菌菌體碎片作為菌液；單獨(dú)制備抗具核梭桿菌特異性IgY提取物。其余制備參照實(shí)施例1。實(shí)驗(yàn)例1:牙齦卟啉單胞菌、具核梭桿菌等兩種細(xì)菌組合的免疫原按本發(fā)明的方法免疫產(chǎn)蛋母雞，取第一次免疫后30天免疫雞蛋，并按本發(fā)明的方法制備出抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌復(fù)合特異性IgY的提取物，應(yīng)用ELISA方法測(cè)定抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌復(fù)合特異性IgY結(jié)合不同抗原的生物學(xué)效價(jià)(見表I)表I抗牙齦卟啉單胞菌和抗具核梭桿菌IgY抗體提取物的效價(jià)
權(quán)利要求
1.抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌復(fù)合特異性IgY制劑，其特征在于，由10 70重量份的牙齦卟啉單胞菌菌體和菌體碎片與30 90重量份的具核梭桿菌菌體和菌體碎片復(fù)合成抗原免疫廣蛋母雞而制備。
2.權(quán)利要求1所述的抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌復(fù)合特異性IgY制劑的制備方法，其特征在于，包括如下步驟 A.牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌培養(yǎng)步驟 A.1細(xì)菌種類牙銀B卜啉單胞菌(Porphyromonas gingival is)和具核梭桿菌(Fusobacterium nucleatum)； A.2取牙齦卟啉單胞菌(P. g)ATCC33277菌株和具核梭桿菌(Fn)ATCC10953菌株，分別經(jīng)BH1-S培養(yǎng)基分離培養(yǎng)和擴(kuò)增培養(yǎng)的牙齦卟啉單細(xì)胞菌、具核梭桿菌，并經(jīng)鑒定確認(rèn)為牙齦卟啉單胞菌、具核梭桿菌而得到牙齦卟啉單胞菌菌體和菌體碎片、具核梭桿菌菌體和菌體碎片； B.免疫原制備步驟 B.1取牙齦卟啉單胞菌菌體和菌體碎片10 70重量份，具核梭桿菌菌體和菌體碎片30 90重量份復(fù)合成菌液抗原； B. 2將等體積的菌液抗原與等體積的福氏完全佐劑復(fù)合，使用高速攪拌器攪拌乳化，最終制成油包水福氏完全佐劑牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌復(fù)合免疫原；每毫升福氏完全佐劑復(fù)合免疫原含有細(xì)菌10億-80億； B.3將等體積的復(fù)合菌液與等體積的福氏不完全佐劑復(fù)合，使用高速攪拌器攪拌乳化，最終制成油包水福氏不完全佐劑牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌復(fù)合免疫原，每毫升福氏不完全佐劑復(fù)合免疫原中含有細(xì)菌10億-80億； C.免疫步驟 使用注射器將福氏完全佐劑復(fù)合免疫原皮下和肌肉注射給產(chǎn)蛋母雞，每只產(chǎn)蛋母雞注射O. 5ml-3. Oml免疫原，然后每隔一周使用福氏不完全佐劑復(fù)合免疫原O. 5ml_3. Oml皮下和肌肉注射給產(chǎn)蛋母雞。加強(qiáng)免疫二次后，此后每隔十周再使用福氏不完全佐劑復(fù)合免疫原O. 5ml-3. Oml皮下和肌肉注射給產(chǎn)蛋母雞加強(qiáng)免疫五次，前后共免疫八次； D.抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌復(fù)合特異性IgY提取物的制備 收集免疫第一次免疫后第28天的免疫母雞雞蛋，使用75%的酒精進(jìn)行雞蛋表面消毒，打開蛋殼取蛋黃，去除蛋黃膜取蛋黃液，將蛋黃液與蒸餾水按體積比1:10的比例加蒸餾水，充分?jǐn)嚢?，并使用冰醋酸調(diào)節(jié)酸堿度至PH5. 30-5. 50，然后放置-20°C凍藏3天后取出解凍，取上清液，用凝膠過濾系統(tǒng)將蛋黃液濃縮20倍，用IN NaOH調(diào)節(jié)PH至7. 0-8. 0，置_20°C保藏。
3.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，在所述步驟D后增加一IgY純化步驟，具體是將抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌復(fù)合特異性IgY提取物加硫酸胺至55%的飽和度，充分?jǐn)嚢?，室溫靜置2小時(shí)，然后高速離心10分鐘，取沉淀，將沉淀使用蒸餾水稀釋到原體積量，再加硫酸胺至33%的飽和度，充分?jǐn)嚢瑁覝仂o置2小時(shí)，然后高速離心10分鐘，取沉淀，用蒸餾水稀釋溶解后裝入透析袋，用蒸餾水經(jīng)中空纖維過濾器除鹽，即得抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌復(fù)合特異性IgY制劑純品。
4.如權(quán)利要求2或3所述的制備方法，其特征在于，所述步驟D用以下方法所取代收集免疫第一次免疫后第28天的免疫母雞雞蛋，用75%酒精消毒雞蛋外殼，打碎蛋殼，留取蛋黃。用去離子水10倍稀釋蛋黃后，用冰醋酸和無(wú)水乙酸鈉調(diào)節(jié)PH至5. 30-5. 50.，4°C沉降后取上清液，添加2%的殼聚糖和海藻酸鈉，2%氯化鈣和多聚磷酸鈉絮凝沉降，再取上清液用凝膠過濾系統(tǒng)超濾去除多余的去離子水，將蛋黃液濃縮20倍左右，用IN氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH至 7. 0-8. 0，置-20°C保藏。
5.用權(quán)利要求1所述的抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌復(fù)合特異性IgY制劑制備的牙膏，其特征在于，包含有抗牙周致病菌IgY制劑，所述抗牙周致病菌IgY制劑由占牙膏總質(zhì)量的質(zhì)量百分比原料組成 抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌復(fù)合特異性IgY制劑0.01 O. 5%、洗必泰O. 01-2. 0%、甘油1. 0-30. 0%、聚乙烯吡咯烷酮O. 1-2. 0%，其中洗必泰、甘油、聚乙烯吡咯烷酮構(gòu)成抗牙銀卟啉單胞菌和具核梭桿菌復(fù)合特異性IgY制劑保護(hù)劑。
6.如權(quán)利要求5所述的牙膏，其特征在于，還包含牙膏膏劑，所述牙膏膏劑由占牙膏總質(zhì)量的質(zhì)量百分比原料組成卡波浦爾O.1 O. 5%、羧甲基纖維素鈉O. 5 1. 3%、卡拉膠O. 2 O. 5%,黃原膠O. 3 O. 7%,甘油5. O 20. 0%,山梨醇5. O 70. 0%,阿斯巴甜O.1 O. 5% ;糖精鈉O.1 O. 3%, PEG-6000. 5 5. 0%, PEG-12000. 5 5. 0%，椰油酰胺丙基甜菜堿O. 1-2. 0%,香精O. 8 2. 0%, SiO2L O 30%,去離子水余量。
全文摘要
本發(fā)明公開的抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌復(fù)合特異性IgY制劑，其由10～70重量份的牙齦卟啉單胞菌菌體和菌體碎片與30～90重量份的具核梭桿菌菌體和菌體碎片復(fù)合成抗原免疫產(chǎn)蛋母雞而制備。本發(fā)明還公開了該抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌復(fù)合特異性IgY制劑的具體制備方法以及含抗牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌復(fù)合特異性IgY制劑的牙膏。本發(fā)明用于治療與預(yù)防牙齦炎及口臭的IgY牙膏對(duì)預(yù)防和治療牙齦炎及口臭具有明顯的效果。
文檔編號(hào)A61K39/395GK103007278SQ20121039658
公開日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2012年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月18日
發(fā)明者陳健芬, 羅鑫龍, 孫曉青, 張萍 申請(qǐng)人:上海美加凈日化有限公司