專利名稱：生物牙根支架材料的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開了一種生物牙根支架材料的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
目前，各種原因所致的牙齒缺失患病率隨年齡增長(zhǎng)而增加，到中老年患病率約為 80%。牙齒缺失與牙發(fā)育異常嚴(yán)重妨礙患者的咀嚼、語(yǔ)言等功能，并引起患者容貌畸形、認(rèn) 知缺陷、心理障礙，從而極大地危害了患者的身心健康，因此，尋求有效的治療途徑是迫切 而艱巨的任務(wù)。目前的牙齒缺失均采用人工材料贗復(fù)體修復(fù)，存在著生理功能恢復(fù)有限、使用壽 命短、損傷正常組織等缺陷，缺乏真正生理意義的修復(fù)。種植體修復(fù)缺失牙是目前治療牙缺 失的熱點(diǎn)和重點(diǎn)，但種植體與牙周組織只能實(shí)現(xiàn)骨性結(jié)合，無(wú)法獲得新生的牙周膜等缺點(diǎn)。 如何有效地在目前的修復(fù)方法基礎(chǔ)上，獲得新生的牙骨質(zhì)、牙周膜和牙槽骨，是治療牙缺失 的關(guān)鍵。支架材料和誘導(dǎo)微環(huán)境問(wèn)題是進(jìn)行牙根再生組織工程的重要問(wèn)題。近年來(lái)，隨著 對(duì)各種支架材料研究的深入，采用生物有機(jī)材料作為支架材料應(yīng)用于牙根組織工程已成為 研究熱點(diǎn)，腸系膜、煅燒牛骨、牙本質(zhì)基質(zhì)等均有應(yīng)用報(bào)道。對(duì)牙本質(zhì)的組織學(xué)和蛋白組學(xué) 的研究表明在牙本質(zhì)中存在多種對(duì)于牙齒發(fā)育和牙齒受到損傷后修復(fù)過(guò)程中重要的蛋白 和因子，其中很多都有很強(qiáng)的表達(dá)或者較高的含量。Guo等以大鼠的牙本質(zhì)為研究對(duì)象， 在牙本質(zhì)周圍成功的誘導(dǎo)了牙骨質(zhì)、牙周膜以及神經(jīng)血管的再生(Weihua Guo, Yong He, Xiaojun Zhang, et al, The use of dentin matrix scaffold and dental follicle cells for dentin regeneration, Biomaterials 2009 ；30: 6708-6723)。Guo 等的研究顯示相 對(duì)于其他生物支架材料，牙本質(zhì)基質(zhì)可以更好的誘導(dǎo)分化為成牙骨質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞、成骨細(xì) 胞樣細(xì)胞以及成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞，形成類似天然的牙周膜樣結(jié)締組織和牙周膜/牙骨質(zhì)復(fù) 合體的結(jié)構(gòu)，有利于生物牙根的重建，這是區(qū)別于其他生物支架材料的重要特征之一。但該 研究中所制備的牙本質(zhì)基質(zhì)為老鼠牙本質(zhì)，與人類等其他物種的牙本質(zhì)存在一定不同，構(gòu) 建出的組織為牙本質(zhì)、無(wú)法設(shè)計(jì)成為牙根形的支架材料，并且，生物牙根材料在不能破壞牙 本質(zhì)基質(zhì)中的重要生物活性物質(zhì)，以保證這些生物活性物質(zhì)可以持續(xù)的從材料中釋放到周 圍環(huán)境中的同時(shí)，需盡量保持牙根的形狀、保持該材料具有一定的力學(xué)強(qiáng)度并且充分脫礦， 以利于牙髓和牙周組織的軟組織和硬組織的共同構(gòu)建。同時(shí)，Guo的研究中使用的異位的 牙本質(zhì)的再生，對(duì)于牙槽骨內(nèi)的再生情況并沒(méi)有進(jìn)行相應(yīng)的討論。綜上所述，該研究并未實(shí) 現(xiàn)真正意義上的生物牙根支架材料的重建。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中所存在的上述不足，提供一種生物牙根支架材 料的構(gòu)建方法。本發(fā)明的構(gòu)建方法容易掌握、安全可行、成本低廉。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了以下技術(shù)方案一種生物牙根支架材料的構(gòu)建方法，包括以下步驟
(1)將供體新鮮的牙齒在無(wú)菌狀態(tài)下，用PBS緩沖液沖洗；
(2)將步驟(1)所得牙齒在有噴水裝置的牙科用慢速渦輪機(jī)上磨除牙冠部分，保留牙根 部分，所述牙科用慢速渦輪機(jī)的轉(zhuǎn)速為1000-10000轉(zhuǎn)/分，所得牙根部分保存于含有PBS 緩沖液的培養(yǎng)瓶或其他器皿中；
(3)用牙科用拔髓針拔出步驟(2)所得牙齒牙根內(nèi)的牙髓組織，用生理鹽水反復(fù)沖洗牙 齒根管內(nèi)部3-8次，每次10-30毫升；
(4)使用牙科用擴(kuò)大機(jī)器將步驟(3)所得牙齒內(nèi)部逐漸擴(kuò)大，去除牙髓組織和前期牙本 質(zhì)等組織，此過(guò)程中使用5%-17%的EDTA溶液反復(fù)沖洗根管內(nèi)部3-8次，每次10-30毫升；
(5)使用牙科用渦輪機(jī)按照生物牙根外形磨除部分牙齒組織，以去除牙周組織和牙骨 質(zhì)等組織。最終得到的材料厚度l_3mm，長(zhǎng)度1-2. 5cm ；
(6)將步驟(5)處理好的牙齒保存于PBS緩沖液中，于超聲震蕩器中處理3-8次，每次 處理 10-30min ；
(7)在轉(zhuǎn)速為100-500轉(zhuǎn)/分的磁力攪拌器中，使用不同濃度的EDTA對(duì)牙本質(zhì)進(jìn)行梯 度脫礦，得到牙本質(zhì)基質(zhì)。將步驟(7)處理好的牙本質(zhì)基質(zhì)保存于含有雙抗的PBS緩沖液中備用，所述含雙 抗的PBS中青霉素濃度為50-500unit/mL，鏈霉素濃度為50_500unit/mL。上述生物牙根支架材料的構(gòu)建方法中，步驟(4)中所述使用牙科用擴(kuò)大機(jī)器將步 驟(3)所得牙齒內(nèi)部逐漸擴(kuò)大的方法為首先使用15號(hào)牙科手用普通鎳鈦銼擴(kuò)大牙齒根管 內(nèi)部，20號(hào)普通鎳鈦銼擴(kuò)大牙齒根管內(nèi)部，然后從小號(hào)到大號(hào)使用號(hào)牙科用擴(kuò)大針擴(kuò)大 牙齒根管口部分，即依次用Sl號(hào)、S2號(hào)、Fl號(hào)、F2號(hào)牙科用擴(kuò)大針擴(kuò)大牙齒根管口部分，必 要時(shí)用F3號(hào)牙科用擴(kuò)大針擴(kuò)大牙齒根管口部分。步驟(5)所述使用牙科用渦輪機(jī)將步驟 (4)所得牙根外側(cè)磨除的方法為使用金剛砂車針，按照生物牙根外形磨除部分牙齒組織， 最終得到的材料厚度l_3mm，長(zhǎng)度1-2. 5cm。上述生物牙根支架材料的構(gòu)建方法中，步驟(7)中所述梯度脫礦的方法為
首先使用17%-25%的EDTA溶液脫礦處理5-15min，然后使用7%_15%的EDTA溶液脫礦 處理5-15min，最后使用5%的EDTA溶液脫礦處理5_15min。牙本質(zhì)作為一種生物材料，由于其本身具有一定的機(jī)械強(qiáng)度，可以作為一種新型 的實(shí)現(xiàn)牙根再生的支架材料；而且牙本質(zhì)本身來(lái)源于牙源性細(xì)胞，存在一些牙齒發(fā)育過(guò)程 中重要的蛋白和因子，又可以做為一種細(xì)胞牙向分化的誘導(dǎo)微環(huán)境。同時(shí)，由于各種臨床需 要而拔除的牙齒除了用于細(xì)胞培養(yǎng)外，牙齒的硬組織部分幾乎都被當(dāng)做醫(yī)療廢物處理，而 且牙本質(zhì)又是牙齒的主要組成部分，這就很好的解決了來(lái)源問(wèn)題。但是，利用牙本質(zhì)基質(zhì)作 為生物牙根支架材料，需要盡量保持牙根的形狀、并且充分脫礦，但又不能破壞牙本質(zhì)基質(zhì) 中的重要生物活性物質(zhì)，保證這些生物活性物質(zhì)可以持續(xù)的從材料中釋放到周圍環(huán)境中， 此外，還要保持該材料具有一定的力學(xué)強(qiáng)度。因而，本發(fā)明采用從小號(hào)到大號(hào)、逐漸使用牙 科用擴(kuò)大機(jī)將牙齒根管內(nèi)部擴(kuò)大，并采用梯度脫礦的方法對(duì)牙齒進(jìn)行脫礦處理。經(jīng)上述方 法，在沒(méi)破壞牙本質(zhì)基質(zhì)中的重要生物活性物質(zhì)的同時(shí)，盡量保持了牙根的形狀、保持該材 料具有一定的力學(xué)強(qiáng)度并且充分脫礦，有利于于牙髓和牙周組織的軟組織和硬組織的共同 構(gòu)建，最終構(gòu)建出具有生物活性的牙根支架材料。
本發(fā)明構(gòu)建的牙本質(zhì)基質(zhì)支架材料的評(píng)價(jià)①將處理好的牙本質(zhì)基質(zhì)至于培養(yǎng)基 中、37°C孵育3天后，培養(yǎng)基清亮、無(wú)混濁，證明該材料可以使用，消毒過(guò)關(guān)，對(duì)該培養(yǎng)基進(jìn) 行分析，發(fā)現(xiàn)里面含有大量具備成牙相關(guān)的蛋白和因子，如TGF-β 1、DMP-I、DSPP等。②掃 面電鏡觀察發(fā)現(xiàn)材料表面牙本質(zhì)小管通暢，管間牙本質(zhì)膠原充分暴露，細(xì)胞在材料表面生 長(zhǎng)良好。③細(xì)胞活性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)該材料有利于細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)。本發(fā)明的生物牙根支架材料的構(gòu)建方法，可從廢棄的人健康牙齒中獲得大量的人 牙本質(zhì)基質(zhì)，建立組織工程技術(shù)生物支架材料，充分利用有效資源。根據(jù)本發(fā)明的方法，制 備的生物牙根支架材料及誘導(dǎo)微環(huán)境，經(jīng)復(fù)合細(xì)胞處理后可以誘導(dǎo)種子細(xì)胞分化為牙骨 質(zhì)、牙周膜、牙本質(zhì)以及牙髓組織，實(shí)現(xiàn)真正意義的生物牙根的重建。與已有其他一些支架 材料相比，本材料的構(gòu)建操作簡(jiǎn)單容易掌握，安全可行，成本低廉，并且可以提供種子細(xì)胞 誘導(dǎo)分化的微環(huán)境。此外，該方法中所使用的牙齒均為因各種原因被拔除廢棄的牙齒，這大 大的節(jié)約了醫(yī)療資源。因此，該生物牙根支架材料及誘導(dǎo)微環(huán)境的制備有廣泛的應(yīng)用前景。本發(fā)明的生物牙根支架材料，首先具備牙根樣的外形，更加接近天然牙齒的外形； 其次，本發(fā)明制備的牙根支架材料中含有大量具備成牙相關(guān)的蛋白和因子，如TGF-βΙ、 DMP-1、DSPP，牙槽骨內(nèi)部對(duì)于細(xì)胞、材料的成牙能力具有一定的誘導(dǎo)性，支架材料本身也具 有一定的牙向誘導(dǎo)能力，兩者相輔相成，可以更好的解決誘導(dǎo)微環(huán)境的問(wèn)題，有利于將該生 物牙根支架材料進(jìn)行牙槽骨內(nèi)移植?？傊?，牙本質(zhì)基質(zhì)的制備為實(shí)現(xiàn)生物牙根的重建提供 了新思路，對(duì)治療牙齒缺失具有重要意義，而對(duì)牙本質(zhì)基質(zhì)的研究及臨床應(yīng)用則需要大量 的牙本質(zhì)基質(zhì)這種支架材料。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例1構(gòu)建的人前牙牙本質(zhì)基質(zhì)支架材料； 圖2為本發(fā)明實(shí)施例1構(gòu)建的人前牙牙本質(zhì)基質(zhì)支架材料的電鏡掃描圖； 圖3為本發(fā)明實(shí)施例1構(gòu)建的人前牙牙本質(zhì)基質(zhì)支架材料的細(xì)胞生長(zhǎng)圖； 圖4為本發(fā)明實(shí)施例1構(gòu)建的人前牙牙本質(zhì)基質(zhì)對(duì)細(xì)胞活性的影響； 圖5、6本發(fā)明實(shí)施例1構(gòu)建的人前牙牙本質(zhì)基質(zhì)分泌的相關(guān)的蛋白和因子； 圖7為本發(fā)明實(shí)施例2構(gòu)建的人前牙牙本質(zhì)基質(zhì)支架材料； 圖8為本發(fā)明實(shí)施例2構(gòu)建的人前牙牙本質(zhì)基質(zhì)支架材料的電鏡掃描圖； 圖9為本發(fā)明實(shí)施例2構(gòu)建的人前牙牙本質(zhì)基質(zhì)支架材料的細(xì)胞生長(zhǎng)圖；圖10為本發(fā) 明實(shí)施例3構(gòu)建的人前牙牙本質(zhì)基質(zhì)支架材料；
圖11為本發(fā)明實(shí)施例3構(gòu)建的人前牙牙本質(zhì)基質(zhì)支架材料的電鏡掃描圖； 圖12為本發(fā)明實(shí)施例3構(gòu)建的人前牙牙本質(zhì)基質(zhì)支架材料的細(xì)胞生長(zhǎng)圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合試驗(yàn)例及具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。但不應(yīng)將此理解 為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)施例，凡基于本發(fā)明內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本 發(fā)明的范圍。實(shí)例中操作均在嚴(yán)格無(wú)菌環(huán)境中進(jìn)行，為保證細(xì)胞不受污染，在所有使用的 PBS, DMEM中均加有100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素。實(shí)施例1、人前牙生物牙根支架材料及誘導(dǎo)微環(huán)境的制備 本實(shí)施例列舉的生物牙根支架材料的制備方法包括以下步驟(1)取健康前牙四顆，用PBS液沖洗三遍，保存于含有PBS的培養(yǎng)瓶或其他器皿中，封口 膜密封瓶口并儲(chǔ)存于4°C冰箱；
(2)在有噴水裝置的牙科用慢速渦輪機(jī)上安裝金剛砂片，調(diào)整轉(zhuǎn)速為3000轉(zhuǎn)/分，使用 金剛砂片磨除步驟(1)所得牙齒的牙冠部分，保留牙根部分并保存于含有PBS的培養(yǎng)瓶或 其他器皿中，封口膜密封瓶口并儲(chǔ)存于4°C冰箱；
(3)使用牙科用拔髓針完整拔出步驟(2)所得牙齒牙根內(nèi)的牙髓組織，并使用生理鹽水 反復(fù)沖洗根管內(nèi)部3次，每次約20mL ；
(4)使用牙科用擴(kuò)大機(jī)器對(duì)步驟(3)所得牙齒進(jìn)行牙齒內(nèi)部處理，首先使用15號(hào)牙科 手用普通鎳鈦銼擴(kuò)大牙齒根管內(nèi)部，20號(hào)普通鎳鈦銼擴(kuò)大牙齒內(nèi)部，然后從小號(hào)到大號(hào)使 用號(hào)牙科用擴(kuò)大針擴(kuò)大牙齒根管口部分，即依次用Sl號(hào)、S2號(hào)、Fl號(hào)、F2號(hào)牙科用擴(kuò)大 針擴(kuò)大牙齒根管口部分，并反復(fù)使用10%的EDTA溶液沖洗根管內(nèi)部3次，每次IOmL ；
(5)使用牙科用渦輪機(jī)對(duì)步驟(4)所得的牙齒按照前牙牙根外形磨除部分牙齒組織，以 去除牙周組織和牙骨質(zhì)等組織。最終得到的材料厚度1mm，長(zhǎng)度1. 5cm ；
(6)將步驟(5)處理好的牙齒保存于PBS緩沖液中，并于超聲震蕩器中處理4次，每次 處理IOmin ；
(7)在轉(zhuǎn)速為100轉(zhuǎn)/分的磁力攪拌器中，使用不同濃度的EDTA對(duì)牙本質(zhì)進(jìn)行梯度脫 礦，首先使用15%的EDTA溶液脫礦處理5min，然后使用10%的EDTA溶液脫礦處理5min，最 后使用5%的EDTA溶液脫礦處理5min ；
將步驟(7)處理好的牙本質(zhì)基質(zhì)保存于含有雙抗(青霉素濃度為100imit/ml，鏈霉素 濃度為100imit/ml)的PBS緩沖液中，使用時(shí)將上述所制作的牙本質(zhì)基質(zhì)按照臨床要求和 實(shí)際應(yīng)用進(jìn)行使用即可。本實(shí)施例構(gòu)建的牙本質(zhì)基質(zhì)支架材料的評(píng)價(jià)
D處理好的牙本質(zhì)基質(zhì)至于DMEM培養(yǎng)基中、37°C孵育3天后，檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基清亮、
無(wú)混濁，證明該材料可以使用，消毒過(guò)關(guān)。收集上述浸泡材料的培養(yǎng)基，并對(duì)該培養(yǎng)基進(jìn)行 分析，采用ELISA試劑盒檢測(cè)相關(guān)蛋白和因子。結(jié)果發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基里面含有大量具備成牙相 關(guān)的蛋白和因子，如TGF-β 1、DMP-1、DSPP等，而未浸泡過(guò)材料的培養(yǎng)基中無(wú)上述相關(guān)蛋白 和因子。②將本實(shí)施例所構(gòu)建的牙本質(zhì)基質(zhì)支架材料置于掃面電鏡觀察下觀察，發(fā)現(xiàn)材料 表面牙本質(zhì)小管通暢，管間牙本質(zhì)膠原充分暴露，細(xì)胞在材料表面生長(zhǎng)良好。③細(xì)胞活性檢測(cè)，采用CCK-8實(shí)驗(yàn)方法，即收集使用了該材料進(jìn)行培養(yǎng)的細(xì)胞和 未使用該材料、只是用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞，制備成細(xì)胞懸液，接種在96孔板中，每板 IOOy 1，同時(shí)加入 ομ 1CCK-8溶液，37°C孵育2小時(shí)后在450nm處使用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度， 檢測(cè)細(xì)胞活性。發(fā)現(xiàn)該材料有利于細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)。實(shí)施例2、人前磨牙生物牙根支架材料及誘導(dǎo)微環(huán)境的制備 本實(shí)施例列舉的生物牙根支架材料的制備方法包括以下步驟
(1)取前磨牙四顆，用PBS液沖洗三遍，保存于含有PBS的培養(yǎng)瓶或其他器皿中，封口膜 密封瓶口并儲(chǔ)存于4°C冰箱。(2)在有噴水裝置的情況下，在牙科用慢速渦輪機(jī)上安裝金剛砂片，調(diào)整轉(zhuǎn)速6500轉(zhuǎn)/分，使用金剛砂片磨除步驟(1)牙冠部分，保留牙根部分并保存于含有PBS的培養(yǎng)瓶或 其他器皿中，封口膜密封瓶口并儲(chǔ)存于4°C冰箱。(3)使用牙科用拔髓針完整拔出步驟(2)所得牙齒牙根內(nèi)牙髓組織，并使用生理鹽 水反復(fù)沖洗根管內(nèi)部5次，每次約15ml。(4)使用牙科用擴(kuò)大機(jī)器進(jìn)行牙齒內(nèi)部處理，首先使用15號(hào)牙科手用普通鎳鈦銼 擴(kuò)大牙齒根管內(nèi)部，20號(hào)普通鎳鈦銼擴(kuò)大牙齒內(nèi)部，然后從小號(hào)到大號(hào)使用號(hào)牙科用擴(kuò) 大針擴(kuò)大牙齒根管口部分，即依次用Sl號(hào)、S2號(hào)、Fl號(hào)、F2號(hào)牙科用擴(kuò)大針擴(kuò)大牙齒根管 口部分，并反復(fù)使用10%的EDTA溶液沖洗根管內(nèi)部5次，每次20mL ；
(5)使用牙科用渦輪機(jī)對(duì)步驟(4)所得的牙齒按照前磨牙牙根外形磨除部分牙根組織， 以去除牙周組織和牙骨質(zhì)等組織。最終得到的材料厚度1. 5mm，長(zhǎng)度1. 5cm ；
(6)將步驟(5)處理好的牙齒保存于PBS緩沖液中，并于超聲震蕩器中處理4次，每次 處理20min。(7)在轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分的磁力攪拌器中，使用不同濃度的EDTA進(jìn)行梯度脫礦， 20%的EDTA溶液脫礦處理5min，然后使用12%的EDTA溶液脫礦處理5min，最后使用5%的 EDTA溶液脫礦處理5min。將步驟(7)處理好的牙本質(zhì)基質(zhì)保存于含有雙抗(青霉素濃度為100imit/ml，鏈 霉素濃度為100imit/ml)的PBS中，使用時(shí)將上述所制作的牙本質(zhì)基質(zhì)按照臨床要求和實(shí) 際應(yīng)用進(jìn)行使用即可。本實(shí)施例構(gòu)建的牙本質(zhì)基質(zhì)支架材料的評(píng)價(jià)
I:處理好的牙本質(zhì)基質(zhì)至于DMEM培養(yǎng)基中、37°C孵育3天后，檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基清亮、 無(wú)混濁，證明該材料可以使用，消毒過(guò)關(guān)。②將本實(shí)施例所構(gòu)建的牙本質(zhì)基質(zhì)支架材料置于掃面電鏡觀察下觀察，發(fā)現(xiàn)材料 表面牙本質(zhì)小管通暢，管間牙本質(zhì)膠原充分暴露，細(xì)胞在材料表面生長(zhǎng)良好。實(shí)施例3、人磨牙(多根牙)生物牙根支架材料及誘導(dǎo)微環(huán)境的制備 本實(shí)施例列舉的生物牙根支架材料的制備方法包括以下步驟
(1)取健康磨牙四顆，用PBS液沖洗三遍，保存于含有PBS的培養(yǎng)瓶或其他器皿中，封口 膜密封瓶口并儲(chǔ)存于4°C冰箱；
(2)在有噴水裝置的牙科用慢速渦輪機(jī)上安裝金剛砂片，調(diào)整轉(zhuǎn)速為4000轉(zhuǎn)/分，使用 金剛砂片磨除步驟(1)所得牙齒的牙冠部分，保留牙根部分并保存于含有PBS的培養(yǎng)瓶或 其他器皿中，封口膜密封瓶口并儲(chǔ)存于4°C冰箱；
(3)使用牙科用拔髓針完整拔出步驟(2)所得牙齒牙根內(nèi)的牙髓組織，并使用生理鹽水 反復(fù)沖洗根管內(nèi)部7次，每次約20mL ；
(4)使用牙科用擴(kuò)大機(jī)器對(duì)步驟(3)所得牙齒進(jìn)行牙齒內(nèi)部處理，首先使用15號(hào)牙科 手用普通鎳鈦銼擴(kuò)大牙齒根管內(nèi)部，20號(hào)普通鎳鈦銼擴(kuò)大牙齒內(nèi)部，然后從小號(hào)到大號(hào)使 用號(hào)牙科用擴(kuò)大針擴(kuò)大牙齒根管口部分，即依次用Sl號(hào)、S2號(hào)、Fl號(hào)、F2號(hào)牙科用擴(kuò)大 針擴(kuò)大牙齒根管口部分，并反復(fù)使用10%的EDTA溶液沖洗根管內(nèi)部7次，每次20mL ；
(5)使用牙科用渦輪機(jī)對(duì)步驟(4)所得的牙根按照磨牙牙根外形磨除部分牙齒組織，以 去除牙周組織和牙骨質(zhì)等組織。最終得到的材料厚度1mm，長(zhǎng)度Icm ；(6)將步驟(5)處理好的牙齒保存于PBS緩沖液中，并于超聲震蕩器中處理4次，每次 處理20min ；
(7)在轉(zhuǎn)速為300轉(zhuǎn)/分的磁力攪拌器中，使用不同濃度的EDTA對(duì)牙本質(zhì)進(jìn)行梯度脫 礦，首先使用20%的EDTA溶液脫礦處理lOmin，然后使用10%的EDTA溶液脫礦處理lOmin， 最后使用5%的EDTA溶液脫礦處理IOmin ；
將步驟(7)處理好的牙本質(zhì)基質(zhì)保存于含有雙抗(青霉素濃度為100imit/ml，鏈霉素 濃度為100imit/ml)的PBS緩沖液中，使用時(shí)將上述所制作的牙本質(zhì)基質(zhì)按照臨床要求和 實(shí)際應(yīng)用進(jìn)行使用即可將上述所制作的牙本質(zhì)基質(zhì)按照臨床要求和實(shí)際應(yīng)用進(jìn)行使用即 可。 ①將處理好的亞本質(zhì)基質(zhì)至于培養(yǎng)基中、37°C孵育3天后，培養(yǎng)基清亮、無(wú)混濁， 證明該材料可以使用，消毒過(guò)關(guān)。②掃面電鏡觀察發(fā)現(xiàn)材料表面牙本質(zhì)小管通暢，管間牙本 質(zhì)膠原充分暴露，細(xì)胞在材料表面生長(zhǎng)良好。
權(quán)利要求
1.一種生物牙根支架材料的構(gòu)建方法，其特征在于包括以下步驟(1)將供體新鮮的牙齒在無(wú)菌狀態(tài)下，用PBS緩沖液沖洗；(2)將步驟(1)所得牙齒在有噴水裝置的牙科用慢速渦輪機(jī)上磨除牙冠部分，保留牙根 部分，所述牙科用慢速渦輪機(jī)的轉(zhuǎn)速為1000-10000轉(zhuǎn)/分，所得牙根部分保存于含有PBS 緩沖液的培養(yǎng)瓶或其他器皿中；(3)用牙科用拔髓針拔出步驟(2)所得牙齒牙根內(nèi)的牙髓組織，用生理鹽水反復(fù)沖洗牙 齒根管內(nèi)部3-8次，每次10-30毫升；(4)使用牙科用擴(kuò)大機(jī)器將步驟(3)所得牙齒內(nèi)部逐漸擴(kuò)大，去除牙髓組織和前期牙本 質(zhì)等組織，此過(guò)程中使用5%-17%的EDTA溶液反復(fù)沖洗根管內(nèi)部3-8次，每次10-30毫升；(5)使用牙科用渦輪機(jī)按照生物牙根外形磨除部分組織，以去除牙周組織和牙骨質(zhì)組 織，得到厚度為l_3mm、長(zhǎng)度1-2. 5cm的支架材料；(6)將步驟(5)處理好的支架材料保存于PBS緩沖液中，于超聲震蕩器中處理3-8次， 每次處理10-30min ；(7)在轉(zhuǎn)速為100-500轉(zhuǎn)/分的磁力攪拌器中，使用不同濃度的EDTA對(duì)牙本質(zhì)進(jìn)行梯 度脫礦，得到生物牙根支架材料。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物牙根支架材料的構(gòu)建方法，其特征在于步驟(4)中所述使用牙科用擴(kuò)大機(jī)器將步驟(3)所得牙齒內(nèi)部逐漸擴(kuò)大的方法為，首 先使用15號(hào)牙科手用普通鎳鈦銼擴(kuò)大牙齒根管內(nèi)部，20號(hào)普通鎳鈦銼擴(kuò)大牙齒根管內(nèi)部， 然后從小號(hào)到大號(hào)使用號(hào)牙科用擴(kuò)大針擴(kuò)大牙齒根管口部分，即依次用Sl號(hào)、S2號(hào)、Fl 號(hào)、F2號(hào)牙科用擴(kuò)大針擴(kuò)大牙齒根管口部分，必要時(shí)用F3號(hào)牙科用擴(kuò)大針擴(kuò)大牙齒根管口 部分。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的生物牙根支架材料的構(gòu)建方法，其特征在于步驟(7) 中所述梯度脫礦的方法為，首先使用17%-25%的EDTA溶液脫礦處理5-15min，然后使用 7%-15%的EDTA溶液脫礦處理5-15min，最后使用5%的EDTA溶液脫礦處理5_15min。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種生物牙根支架材料的構(gòu)建方法，包括以下步驟牙齒在無(wú)菌狀態(tài)下，用PBS液沖洗三遍；用金剛砂片磨除牙冠部分，保留牙根部分；拔出牙根內(nèi)牙髓組織，用生理鹽水反復(fù)沖洗根管內(nèi)部；使用牙科用擴(kuò)大機(jī)器將牙齒內(nèi)部逐漸擴(kuò)大，用5%-17%的EDTA溶液反復(fù)沖洗根管內(nèi)部；使用牙科用渦輪機(jī)磨除牙根外側(cè)部分組織按照需要構(gòu)建的生物牙根外形制備出特定形狀的支架；將牙齒保存于PBS緩沖液中，于超聲震蕩器中處理3-8次；在轉(zhuǎn)速為100-500轉(zhuǎn)/分的磁力攪拌器中，使用不同濃度的EDTA對(duì)牙本質(zhì)進(jìn)行梯度脫礦，得到牙本質(zhì)基質(zhì)；將牙本質(zhì)基質(zhì)保存于含有雙抗的PBS中。本發(fā)明的生物牙根支架材料，具備牙根樣的外形，界定為厚度1-3mm，長(zhǎng)度1-2.5cm，含有大量具備成牙相關(guān)的蛋白和因子，并可持續(xù)釋放這些蛋白和因子，具有一定的牙向誘導(dǎo)能力，可以更好的解決誘導(dǎo)微環(huán)境的問(wèn)題，有利于將該生物牙根支架材料進(jìn)行牙槽骨內(nèi)原位移植。
文檔編號(hào)A61C8/00GK102068318SQ201010597640
公開日2011年5月25日 申請(qǐng)日期2010年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月21日
發(fā)明者李銳, 楊波, 田衛(wèi)東, 盛磊, 郭維華, 陳崗 申請(qǐng)人:四川大學(xué)