專利名稱：miRNA-23a反義核苷酸在制備用于治療心臟病藥物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種內(nèi)源性的非編碼小RNAs的新用途，尤其涉及一種miRNA-23a反義核苷酸在治療心臟疾病中的用途，屬于生物制藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
心血管疾病主要包括高血壓、冠心病、充血性心力衰竭等。目前，心血管疾病仍然是人類健康的頭號(hào)殺手，全世界范圍內(nèi)每年有一千七百萬人死于心血管疾病，其死亡率已接近所有癌癥死亡率的總和。在我國(guó)，隨著人民生活水平日益提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變，心血管疾病死亡率呈明顯上升趨勢(shì)，已超過癌癥成為第一大致死原因。毫無疑問，預(yù)防和治療心血管疾病仍然是醫(yī)學(xué)與生物學(xué)的重大任務(wù)。心肌肥大是指組織水平上心肌組織的增厚和細(xì)胞水平上心肌細(xì)胞體積的增大的總稱。它是由于心肌細(xì)胞體積增大而導(dǎo)致心臟體積增大所發(fā)生的一種疾病。該病是由一些生理和病理因素的共同刺激而發(fā)生的，它是許多心血管疾病的綜合性表現(xiàn)。心肌肥大是心肌病的一種，是心肌細(xì)胞針對(duì)于血液動(dòng)力學(xué)增加的一種應(yīng)答反應(yīng)。多種情況可以引起人體內(nèi)血液動(dòng)力的增加，比如高血壓，心臟瓣膜疾病。長(zhǎng)期的超負(fù)荷血液動(dòng)力刺激會(huì)引起以心肌細(xì)胞體積增大為特征的心肌細(xì)胞重塑過程，也就是心肌肥大?，F(xiàn)在一般認(rèn)為存在兩種情況的心肌肥大，一種是正常的生理性肥大，比如出生后伴隨者發(fā)育發(fā)生的心肌肥大，還有體育鍛煉引起的心肌肥大；另外一種是病理性心肌肥大，其早期特征是室壁和室間隔增厚，心肌收縮功能增強(qiáng)，因此被視為代償性肥大，如果病情一直未得到緩解，心肌肥大后期會(huì)發(fā)生心室壁間質(zhì)纖維化、心肌細(xì)胞收縮功能失調(diào)以及能量代謝，基因表達(dá)和電生理特征的異常，最終導(dǎo)致心臟功能衰竭。鑒于心肌肥大的發(fā)生是一個(gè)進(jìn)行性不可逆過程，而且最終會(huì)引起心力衰竭，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)已經(jīng)把它作為心臟發(fā)生臨床病變的一個(gè)里程碑式的心肌形態(tài)變化，認(rèn)為它是導(dǎo)致心臟疾病和心臟猝死的一個(gè)危險(xiǎn)因素。隨著近來miRNA研究的熱潮，這種內(nèi)源性非編碼小RNAs已經(jīng)作為一個(gè)基因表達(dá)調(diào)節(jié)的中心因子顯露，參加許多重要的生理過程。對(duì)于miRNA來說，它調(diào)控方式的特點(diǎn)決定了它的靶基因不會(huì)只有一個(gè)，而是一對(duì)多的方式，這就是使得miRNA的功能研究?jī)?nèi)容非常豐富。許多研究表明miRNA對(duì)于維持心臟正常生理功能具有重要作用，心臟中的miRNA異常表達(dá)與許多心臟疾病的發(fā)生相關(guān)。因此，將miRNA作為心臟疾病治療的靶點(diǎn)，開發(fā)相關(guān)藥物具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。盡管越來越多的miRNA作為人類疾病的生物標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)被發(fā)現(xiàn)，但在心臟肥厚和心肌纖維化心臟疾病中的關(guān)鍵miRNA仍沒有確定，其所發(fā)揮的功能是對(duì)該領(lǐng)域科研人員的挑戰(zhàn)。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種miRNA-23a反義核苷酸在制備用于診斷、預(yù)防或治療心臟疾病藥物中的用途，確定或發(fā)現(xiàn)調(diào)控心肌細(xì)胞肥大的在心臟中表達(dá)的miRNA，進(jìn)一步確定其在心肌肥厚、冠心病、心肌纖維化等心臟疾病中的關(guān)鍵作用，將其應(yīng)用到這些心臟疾病的診斷、防治中。針對(duì)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下一方面，本發(fā)明提供一種miRNA-23a的反義核苷酸在制備用于診斷、預(yù)防或治療心臟疾病藥物中的用途。優(yōu)選地，所述miRNA_23a的核苷酸序列如下述SEQ ID NO 1的序列所示5' -GGAAAUCCCUGGCAAU⑶GAU-3‘。優(yōu)選地，所述心臟疾病包括心肌肥厚、心肌纖維化、冠心病及心衰。另一方面，本發(fā)明提供一種藥物組合物，該藥物由有效量的miRNA-23a反義核苷酸和藥學(xué)上可接受的載體、病毒或輔料組成。優(yōu)選地，所述載體為膽固醇、納米顆?；蛑|(zhì)體。再一方面，本發(fā)明提供一種藥物組合物在制備用于預(yù)防或治療心臟疾病藥物中的用途。優(yōu)選地，所述心臟疾病包括心肌肥厚、心肌纖維化、冠心病及心衰。本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miRNA_23a(其核苷酸序列如SEQ ID NO :2序列的所示 5' -AUCACAUUGCCAGGGAUUUCC-3 ‘)在肥大的心肌細(xì)胞和心臟肥厚中表達(dá)顯著上調(diào)。通過構(gòu)建miRNA-23a過表達(dá)腺病毒或miRNA_23a轉(zhuǎn)基因小鼠加強(qiáng)miRNA_23a的表達(dá)，發(fā)現(xiàn) miRNA-23a過表達(dá)在細(xì)胞水平能誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的發(fā)生，miRNA-23a的轉(zhuǎn)基因小鼠的心臟在用肥大刺激因子處理后與對(duì)照組相比有了明顯的肥大表型及纖維化程度，同時(shí)一些肥大基因的表達(dá)也與對(duì)照組相比有了明顯的增加。具體的，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)miRNA-23a在肥大的心肌細(xì)胞中與對(duì)照組相比有了明顯的提高，對(duì)其進(jìn)行肥大指標(biāo)的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，心肌肥大的指標(biāo)如細(xì)胞表面積，蛋白/DNA的比值及肌小節(jié)的重組也與對(duì)照組相比都有了明顯的增加。miRNA-23a的轉(zhuǎn)基因小鼠在用肥大刺激因子(苯腎上腺素)后的心臟表型，心臟體重比，邊緣區(qū)的心肌細(xì)胞橫截面積(WGA染色)及心肌纖維化(Masson染色)與野生型相比都有了明顯的增加。以上實(shí)驗(yàn)說明miRNA-23a能夠誘導(dǎo)心肌肥大的發(fā)生，這意味著miRNA_23a可作為一種早期診斷和早期預(yù)防心肌肥大，心肌纖維化等心臟疾病的生物標(biāo)志物。另外，本發(fā)明通過大量的試驗(yàn)證明miRNA-23a的反義核苷酸對(duì)心肌肥厚，心肌纖維化具有保護(hù)作用。具體的，本發(fā)明在細(xì)胞水平通過轉(zhuǎn)染miRNA-23a的反義核苷酸發(fā)現(xiàn)， 它能夠抑制肥大刺激因子所誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大，包括肥大指標(biāo)如細(xì)胞表面積，蛋白/DNA 的比值及肌小節(jié)的重組也與對(duì)刺激組相比都有了明顯的降低。在動(dòng)物水平通過注射外源 miRNA-23a的反義核苷酸也能夠抑制肥大模型的肥大效應(yīng)包括心臟表型，心臟體重比，邊緣區(qū)的心肌細(xì)胞橫截面積(WGA染色)及心肌纖維化(Masson染色)都有了明顯的降低，同時(shí)心功能也有了明顯的改善。以上實(shí)驗(yàn)說明miRNA-23a的反義核苷酸通過抑制心肌細(xì)胞肥大對(duì)心臟具有保護(hù)作用，它對(duì)許多心臟疾病具有潛在的預(yù)防和治療價(jià)值，可成為一種治療心肌肥大，預(yù)防心肌纖維化的藥物。具體的，可以合成反義miRNA-23a的反義核苷酸并與適當(dāng)載體如膽固醇，納米顆粒，脂質(zhì)體等連接形成藥物，通過口服，靜脈或肌肉注射的方式，心肌肥大和心肌纖維化等心臟疾病進(jìn)行治療。


以下，結(jié)合附圖來詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)施方案，其中圖1為miRNA-23a轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠的表型及心臟的比較試驗(yàn)結(jié)果示意圖，圖中A為miRNA-23a轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠的表型及心臟體重比的比較試驗(yàn)結(jié)果示意圖；B為miRNA-23a轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠的心臟功能的比較的試驗(yàn)結(jié)果示意圖；圖2為在苯腎上腺素(PE)刺激下，miRNA-23a轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠的表型及心臟比較試驗(yàn)結(jié)果示意圖，圖中A為在PE刺激下，miRNA-23a轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠的表型及心臟體重比的比較試驗(yàn)結(jié)果示意圖；B為在PE刺激下，miRNA-23a轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠的心臟功能的比較的試驗(yàn)結(jié)果示意圖；圖3為PE和內(nèi)皮素(ET-I)誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大過程中miRNA_23a表達(dá)水平的變化結(jié)果示意圖，圖中A為小鼠原代心肌細(xì)胞經(jīng)PE誘導(dǎo)處理后miRNA-23a的表達(dá)水平試驗(yàn)結(jié)果示意圖；B，小鼠原代心肌細(xì)胞經(jīng)ET-I誘導(dǎo)處理后miRNA-23a的表達(dá)水平試驗(yàn)結(jié)果示意圖；圖4為原代心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA-23a反義核苷酸后的試驗(yàn)結(jié)果示意圖，圖中A為原代心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA-23a反義核苷酸后心肌細(xì)胞的表面積被抑制的試驗(yàn)結(jié)果示意圖； B為原代心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA-23a反義核苷酸后心肌細(xì)胞的蛋白/DNA被抑制的試驗(yàn)結(jié)果示意圖；C為原代心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA-23a反義核苷酸后心肌細(xì)胞的肌小節(jié)重組的試驗(yàn)結(jié)果示意圖；圖5為小鼠靜脈注射miRNA-23a反義核苷酸(antagomir)能抑制PE所誘導(dǎo)的肥大模型的檢測(cè)結(jié)果示意圖，圖中A為心臟表型的檢測(cè)結(jié)果示意圖；B為心肌細(xì)胞橫截面積(WGA 染色)的檢測(cè)結(jié)果示意圖；C為心臟體重比的檢測(cè)結(jié)果示意圖；圖6為小鼠靜脈注射miRNA-23a反義核苷酸(antagomir)能抑制主動(dòng)脈縮窄 (TAC)所誘導(dǎo)的小鼠心臟肥大模型的檢測(cè)結(jié)果示意圖，圖中A為心臟表型的檢測(cè)結(jié)果示意圖；B為心臟體重比的檢測(cè)結(jié)果示意圖；C為心肌細(xì)胞橫截面積(WGA染色)的檢測(cè)結(jié)果示意圖。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)驗(yàn)小鼠除特殊說明外，均購自北京醫(yī)科大學(xué)，品系均為C57/BL6。實(shí)施例1 miRNA-23a轉(zhuǎn)基因小鼠的表型及心臟功能與野生型相比沒有明顯的改變miRNA-23a轉(zhuǎn)基因小鼠(購自沈陽醫(yī)學(xué)院)與野生型小鼠(購自北京醫(yī)科大學(xué)) 的品系都為C57/BL6小鼠。對(duì)這二種小鼠的心臟進(jìn)行表型分析，通過石蠟切片鑒定整體外形，通過HE及WGA染色確定細(xì)胞的橫截面積大小(圖1A)，同時(shí)檢測(cè)了心臟體重比(圖1B)， 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miRNA-23a轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠相比心臟表型沒有明顯的增大，心臟體重比也沒有顯著的提高，說明miRNA-23a轉(zhuǎn)基因小鼠本身并沒有明顯的肥大表型改變。同時(shí)檢測(cè)的心功能的指標(biāo)包括左心室后壁厚度(LVPWd)，短軸縮短率(F。(圖 1B)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miRNA-23a轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠的心臟功能沒有明顯的區(qū)別。實(shí)驗(yàn)例2 miRNA-23a轉(zhuǎn)基因小鼠在PE刺激下與野生型小鼠相比表型及心功能有了明顯的改變對(duì)miRNA-23a轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠的心臟用肥大刺激因子即苯腎上腺素 (PE)腹腔埋泵注射二周后進(jìn)行表型分析(按同樣的操作條件將miRNA-23a轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠的心臟加鹽處理，作為負(fù)對(duì)照)，通過石蠟切片鑒定整體外形，通過HE染色(圖 2A)，同時(shí)檢測(cè)了心臟體重比(圖2A)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miRNA-23a轉(zhuǎn)基因小鼠經(jīng)過PE處理后的表型與野生型小鼠相比心臟表型有了明顯的增大，心臟體重比也有了顯著的提高，說明經(jīng)過PE處理后的miRNA-23a轉(zhuǎn)基因小鼠有了明顯的肥大表型改變。如圖2B所示，心功能的檢測(cè)包括左心室后壁厚度(LVPWd)，短軸縮短率(FS)以及室間隔厚度(LVSd)與野生型小鼠相比有了明顯的肥大改變(按同樣的操作條件將 miRNA-23a轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠的心臟加鹽處理，作為負(fù)對(duì)照)。實(shí)驗(yàn)例3在PE和ET-I刺激下miRNA_23a表汰水平的變化對(duì)于心肌細(xì)胞肥大模型，采用本實(shí)驗(yàn)室已建立的方法培養(yǎng)大鼠乳鼠原代心肌細(xì)胞 (大鼠乳鼠購自北京醫(yī)科大學(xué)，大鼠品系為Wistar大鼠，大鼠乳鼠原代心肌細(xì)胞的制備可參見以下文獻(xiàn)W.-Q. Tan, etal, Foxo3a Inhibits Cardiomyocyte Hypertrophy through Transactivating Catalase J Biol Chem. 20080ctober 31 ；283 (44) :29730—29739)，)(寸心肌細(xì)胞用PE和ET-I進(jìn)行處理，在培養(yǎng)的不同時(shí)間，提取細(xì)胞的總RNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)miRNA-23a的表達(dá)水平。如圖3A、!3B所示，miRNA_23a表達(dá)水平在PE和ET-I處理6 小時(shí)之內(nèi)有了顯著的上升。實(shí)驗(yàn)例4 miRNA-23a反義核苷酸能夠在細(xì)胞水平上抑制PE所誘導(dǎo)的肥大對(duì)原代心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA-23a反義核苷酸(anta-23a)后，能有效的抑制了 miRNA-23a的表達(dá)，同時(shí)細(xì)胞用PE對(duì)心肌細(xì)胞進(jìn)行處理，及同時(shí)用miRNA-23a反義核苷酸的負(fù)對(duì)照(anta-NC)處理，經(jīng)過M小時(shí)之后，對(duì)心肌細(xì)胞進(jìn)行心肌肥大指標(biāo)的檢測(cè)，如細(xì)胞表面積(圖4A)、蛋白/DNA(圖4B)及肌小節(jié)的重組(圖4C)檢測(cè)(按同樣的操作條件將小鼠的心臟加鹽處理，作為負(fù)對(duì)照)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明miRNA-23a反義核苷酸能夠有效的抑制PE 所誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大。實(shí)驗(yàn)例5小鼠靜脈注射miRNA_23a反義核苷酸(antagomir)能抑制PE所誘導(dǎo)的 fl巴大樽型對(duì)小鼠用PE埋泵處理二周后，小鼠的心臟有明顯的肥大表型，而同時(shí)加入 miRNA-23a反義核苷酸(anta-23a)可以明顯減弱PE所誘導(dǎo)的肥大效應(yīng)(按同樣的操作條件將小鼠的心臟加鹽處理，作為負(fù)對(duì)照)。但是，同時(shí)向小鼠注射miRNA-23a反義核苷酸的負(fù)對(duì)照(anta-NC)和PE，如圖5A所示，并不能減弱PE的肥大表型，同時(shí)也檢測(cè)了細(xì)胞的橫截面積大小(WGA染色)及心臟體重比(圖5B、5C)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)miRNA-23a反義核苷酸能夠在整體水平抑制PE所誘導(dǎo)的心臟肥大的發(fā)生。實(shí)驗(yàn)例6小鼠靜脈注射miRNA_23a反義核苷酸(antagomir)能抑制主動(dòng)脈縮窄 (TAC)所誘導(dǎo)的小鼠心臟吧大樽型對(duì)小鼠用主動(dòng)脈縮窄(Thoracic aorta constriction, TAC)的方法處理三周后能夠誘導(dǎo)肥大表型的產(chǎn)生。而同時(shí)加入miRNA-23a反義核苷酸(anta-23a)可以明顯減弱 TAC所誘導(dǎo)的肥大效應(yīng)。但是，加入miRNA-23a反義核苷酸的負(fù)對(duì)照(anta-NC)的組別與 TAC組別比沒有明顯的改變即并不能減弱TAC所誘導(dǎo)的肥大表型(圖6A)，同時(shí)也檢測(cè)了心臟體重比(圖6B)及細(xì)胞的橫截面積大小(WGA(Wheat germ agglutinin)染色)(圖6C)。 以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)miRNA-23a反義核苷酸能夠在整體水平抑制TAC所誘導(dǎo)的心臟肥大的發(fā)生。
權(quán)利要求
1.miRNA-23a的反義核苷酸在制備用于診斷、預(yù)防或治療心臟疾病藥物中的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述miRNA-23a的核苷酸序列如下述SEQ ID NO 1的序列所示5 ‘ -GGAAAUCCCUGGCAA腳GAU-3‘。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述心臟疾病包括心肌肥厚、心肌纖維化、冠心病及心衰。
4.一種藥物組合物，該藥物由有效量的miRNA-23a反義核苷酸和藥學(xué)上可接受的載體、病毒或輔料組成。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的藥物組合物，其特征在于，所述載體為膽固醇、納米顆?；蛑|(zhì)體。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的藥物組合物在制備用于預(yù)防或治療心臟疾病藥物中的用途。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的藥物組合物的用途，其特征在于，所述心臟疾病包括心肌肥厚、心肌纖維化、冠心病及心衰。
全文摘要
本發(fā)明提供一種miRNA-23a反義核苷酸在用于制備治療心臟病藥物中的用途，所述miRNA-23a的核苷酸序列如下述SEQ ID NO1的序列所示5′-GGAAAUCCCUGGCAAUGUGAU-3′；miRNA-23a的反義核苷酸通過抑制心肌細(xì)胞肥大對(duì)心臟具有保護(hù)作用，它對(duì)許多心臟疾病具有潛在的預(yù)防和治療價(jià)值，可成為一種治療心肌肥大，預(yù)防心肌纖維化的藥物。
文檔編號(hào)A61P9/04GK102251037SQ20111019073
公開日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2011年7月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月8日
發(fā)明者李培峰, 王昆 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所