專利名稱：修飾的環(huán)孢素的用途的制作方法
<務(wù)飾的環(huán)孢素的用途 本發(fā)明涉及非免疫抑制性環(huán)孢素的新用途。
環(huán)孢素包括一類結(jié)構(gòu)上獨特的環(huán)狀聚N-甲基化的十一肽，通常具有藥 理學(xué)活性特別是免疫抑制活性或抗炎活性。已經(jīng)鑒定到與親環(huán)蛋白強結(jié)合 但并非免疫抑制性的環(huán)孢素。WO2005021028A1公開了非免疫抑制性環(huán)孢 素對丙型肝炎病毒(HCV)具有抑制作用的用途。
若在混合淋巴細胞反應(yīng)(MLR)中某環(huán)孢素具有至多環(huán)孢素A活性的 5%、優(yōu)選至多2%的活性，則認為其是非免疫抑制性的?；旌狭馨图毎?應(yīng)由T. Meo描述于《免疫學(xué)方法》("Immunological Methods"), L. Lefkovits 和B. Peris編輯，Academic Press, N.Y.第227-239頁(1979)中。將來自 Balb/c小鼠(雌性，8 10周)的脾細胞(0.5x 106)與來自CBA小鼠(雌性，8 10 周)的0.5 x 106輻照(2000拉德)或絲裂霉素C處理的脾細胞共孵育5天。輻 照的同種異體細胞誘導(dǎo)Balb/c脾細胞的增殖反應(yīng)，這可以通過摻入到DNA 中的標記前體測量。刺激細胞由于經(jīng)過輻照(或絲裂霉素C處理)，它們對 Balb/c細胞不發(fā)生增殖反應(yīng)，但保留其抗原性。將測得的測試化合物的IC50 與平行實驗中環(huán)孢素A的ICso相比較。此外，非免疫抑制性環(huán)孢素缺乏抑 制CN及下游NF-AT途徑的能力。
纖維化是修復(fù)或反應(yīng)過程中器官或組織中過度的纖維結(jié)締組織的形成 或發(fā)展。纖維化的一種形式，硬化，是以肝組織被替換為纖維化疤痕組織 以及再生結(jié)節(jié)為特征的慢性肝病的后果，導(dǎo)致肝功能逐漸的喪失。肝星狀 細胞(HSC)是具有特征性的星狀形態(tài)并位于竇周間隙的肝非實質(zhì)細胞。肝 損傷后，HSC經(jīng)歷向激活的肌纖維母細胞表型的轉(zhuǎn)分化以及a-平滑肌肌 動蛋白的表達。激活的HSC然后增殖并生成細胞外基質(zhì)蛋白諸如膠原蛋 白。先前的免疫抑制藥物、諸如環(huán)孢素和他克莫司對HSC中細胞增殖作用 和膠原蛋白生成的作用的評價，已發(fā)現(xiàn)環(huán)孢素抑制細胞生長和膠原蛋白生
6成，但他克莫司不具有這樣的作用，表明環(huán)孢素潛在地具有抗纖維發(fā)生作 用。
目前已有的抗纖維化療法涉及抑制肝臟炎癥而不是控制纖維化。治療 干預(yù)的要點要求包括去除傷害性刺激，抑制肝臟炎癥，下調(diào)星狀細胞活化， 并促進基質(zhì)降解。
因此，本發(fā)明提供了非免疫抑制結(jié)合親環(huán)蛋白的環(huán)孢素在預(yù)防或治療 肝病諸如移植硬化、慢性肝炎、硬化、肝癌，例如肝細胞癌或其發(fā)展中的 用途。再者，非免疫抑制結(jié)合親環(huán)蛋白的環(huán)孢素亦可用作例如有先天性肝 纖維化的新生兒、或移植受者例如器官或組織移植例如肝移植受者的預(yù)防 性治療。
環(huán)孢素被認為與親環(huán)蛋白結(jié)合，如果其與人重組親環(huán)蛋白至少五分之
一結(jié)合且環(huán)孢素A在竟爭性ELISA試驗中如Quesniaux在Eur. J. Immunol. 1987 17 1359-1365中所描。在該試驗中，要試驗的環(huán)孢素在親環(huán) 蛋白與包被的BSA-環(huán)孢素A孵育期間加入，并計算給出無竟爭劑的對照 反應(yīng)50。/。抑制作用所需的濃度(ICs())。結(jié)果禍束示為結(jié)合比(BR)，其是試 驗化合物的ICso與同時試驗的環(huán)孢素A自身的ICso比值的以IO為底的對 數(shù)(log)。因此，BR1.0表明試驗化合物與人親環(huán)蛋白結(jié)合為環(huán)孢素A的十 分之一，且負值表明結(jié)合強于環(huán)孢素A。對HCV有活性的環(huán)孢素具有低 于0.7的BR，優(yōu)選等于或小于零。
非免疫抑制性結(jié)合親環(huán)蛋白的環(huán)孢素的實例包括例如式I的化合物
I——W——X——R——Y——Z-Q -Ala————T2——T3-MeVal ~|
123456 78910 11 I
其中
W為MeBmt、 二氬-MeBmt、 8，-羥基-MeBmt或0-乙?；?MeBmt、 X為ocAbu、 Val、 Thr、 Nva或O-曱基蘇氨酸(MeOThr); R為Pro、 Sar、 (D)-MeSer、 (D)-MeAla或(D)-MeSer(O乙?；?;
Y為MeLeu、MeLeu、 y-羥基-MeLeu、 Melle、 MeVal、 MeThr、
7MeAla、 Mealle或MeaThr; N-乙基Val、 N-乙基Ile、 N-乙基Thr、 N國乙 基Phe、 N-乙基Tyr或N-乙基Thr(O乙?；?；
Z為Val、 Leu、 MeVal或MeLeu;
Q為MeLeu、 y-羥基-MeLeu、 MeAla或Pro;
Ti為(D)Ala或Lys;
T2為MeLeu或y-羥基-MeLeu;且
13為MeLeu或MeAla 。 優(yōu)選的式I的化合物為例如式Ia的化合物
W'~X'————Y"~Z"——Q'-Ala-(D)Ala-MeLeu-MeLeu-WleVa卜
123456 789 10 11
其中
W，為MeBmt、 二氬-MeBmt或8，-羥基-MeBmt;
X為aAbu、 Val、 Thr、 Nva或O-甲基蘇氨酸(MeOthr);
R，為Sar、 (D)-MeSer、 (D)-MeAla或(D)-MeSer(O乙酰基)； Y，為MeLeu、"羥基畫MeLeu、 Melle、 MeVal、 MeThr、 MeAla， Mealle 或MeaThr; N-乙基Val、 N-乙基Ile、 N-乙基Thr、 N-乙基Phe、 N-乙基 Tyr或N-乙基Thr(()乙酰基)；
Z為Val、 Leu、 MeVal或MeLeu;且
Q，為MeLeu、 y-羥基-MeLeu或MeAla。 基團W，、 X、 Y，、 Z、 Q，及R，獨立地具有以下優(yōu)選意義
W，優(yōu)選W"其中W"為MeBmt或二氫-MeBmt;
X優(yōu)選X，其中X，為ocAbu或Nva,更優(yōu)選X"其中X"為aAbu;
R，優(yōu)選R，，其中R，，為Sar;
Y，優(yōu)選Y，，其中Y，，為Y幾基-MeLeu、 MeVal、 MeThr、 Melle、 N-乙基Ile或N-乙基Val;
Z優(yōu)選Z，其中Z，為Val或MeVal;且Q，優(yōu)選Q"其中Q"為MeLeu。 式Ia化合物的優(yōu)選基團為其中W，為W"、X為X，、Y，為Y"、Z為Z，、 Q，為Q，，且R，為R"的那些。
式Ia的優(yōu)選4匕合物的實例為例如
a)二氫-MeBmt、[Y-羥基-MeLeuj4-環(huán)孢素；BR* = 0.1; IR<1%
b)MeVal4-環(huán)孢素；BR = 0.1; IR<1%
c)Melle]4-環(huán)孢素;BR =0.2; IR<1%
d) [MeThrj4-環(huán)孢素；
e) hr-羥基-MeLeu"-環(huán)孢素；BR = 0.4; IR<1%
f) [乙基-Ilej4-環(huán)孢素；BR = 0.1; IR<2%
g) l乙基-Valj4-環(huán)孢素；BR = 0; IR<2%
h) [Nval2-lY-羥基-MeLeu4-環(huán)孢素；
i) [Y-幾基-MeLeuj4-"y-羥基-MeLeul6-環(huán)孢素； j)MeValj5-環(huán)孢素；BR = 0.4; IR = 5.3% k)MeOThr]2畫l(D)MeAla3-IMeValj5-環(huán)孢素；
j) 18，-羥基-MeBmtj'-環(huán)孢素；BR = 0.35; IR= 1.8% k) [MeAlaj6-環(huán)孢素；BR = -0.4; IR = 3.2 1) 1(Y-羥基-MeLeuj9-環(huán)孢素；BR = 0.15; IR = 2.9 IR=免疫抑制比率，以相對于環(huán)孢素A的活性百分數(shù)表示。 非免疫抑制性環(huán)孢素的其他實例為在WO 98/28330、 WO 98/28329及 WO 98/28328中公開的化合物，其內(nèi)容文中引用作為參考，例如式H的化
W^Xa——Ra——Ya~Za——Qa-Ala-(D)Ala-MeLeu-MeLeu-WleVal
123456 78910 11
其中Wa為
9R
HO",
CH-
CH3 0H2
其中Ra為式Ic或Id的殘基
—CH2—CH=CH——CH2 — R4 lc 或 一CH2——SH~R'4 Id 其中Rj為d—4烷石克基、氨基C,-4烷硫基、d-4烷基氨基烷硫基、二
Cm烷基氨基-d-4烷硫基、嘧咬硫基、噻唑硫基、N-d-4烷基咪唑硫基、
羥基C^烷基苯硫基、羥基CL4烷基苯氧基、硝基苯基氨基或2-氧代嘧啶
-l-基，且R，4為d—4烷基； Xa為Abu;
Ra為—NMe-CH(Rb)-CO-，其中Rb為H或—S-Alk-Ro，其中Alk-R。為曱基； 或Alk為直鏈或支鏈<:2-6亞烷基或C3-6環(huán)亞烷基且Ro為H; OH; COOH; C2—5烷氧基-羰基；NR,R2，其中每個R及R2獨立地選自H、 Cw烷基、
C2.4鏈烯基、C3—6環(huán)烷基及苯基，其每個任選被卣素、Cw烷氧基、C2.s烷 氧基羰基、氨基、C,-4烷基氨基和/或二Q-4烷基-M取代，及千基和雜環(huán)
基，所述千基及雜環(huán)基為飽和或不飽和的并且含有5個或6個環(huán)成員和1 至3個雜原子，或R,和R2—起與它們所連^l妻的氮原子形成4-6元雜環(huán)， 其可以含有選自氮、氧及硫的另一雜原子，且任選被Q—4烷基、苯基或節(jié) 基取代；或每個R,及R2獨立地為式Ib的基團
、—h、 . — n
;卜"
其中R,及R2如上所定義，&為H或d—4烷基且n為自2至4的整數(shù); Ya為MeLeu或y-幾基-MeLeu; Za為Val;且
Qa為MeLeu，條件是當Ya為MeLeu時，Rb不為H，或其可藥用鹽。
10在式II中，當R,和/或R2為雜環(huán)殘基時，它可為吡梵基、四氫吡1^、 哌淀基、咪唑基、，港唑基或漆唑基。例如，當R,及R2與它們連接的氮原 子形成雜環(huán)殘基時，雜環(huán)殘基可選自氮雜環(huán)丁烷基、哌咬基、哌溱基、N-甲基-哌嗪基、N-苯基哌嗪基、N-節(jié)基哌溱基、吡咬基、咪唑基、嗎啉代、 石克代嗎淋4戈、四氫吡梵基、曱基四氫吡!t&(例如4-甲基-四氫吡^&)或苯 基四氫吡突羞(例如，4-苯基四氫吡^!t^基)。式I、 Ia或n的化合物可以以多種方法獲得，所述方法可分為1) 發(fā)酵2) 生物轉(zhuǎn)化3) 衍生4) 部分合成5) 全合成例如在EP 0 484 281 Al、 WO 00/01715、 WO 98/28330、 WO 98/28329或W() 98/28328中所7>開的，其內(nèi)客此處引用作為參考。在一系列進一步特定或備選實施方案中，本發(fā)明還提供了l.l用于預(yù)防或治療需要其的個體中與肝病有關(guān)的病癥的方法，其包括給所 述個體施用治療有效量的非免疫抑制性結(jié)合親環(huán)蛋白的環(huán)孢素，例如式i、Ia或11的4匕合物。根據(jù)本發(fā)明，非免疫抑制性結(jié)合親環(huán)蛋白的環(huán)孢素可以以減輕或清除 與肝病有關(guān)的一種或多種病征、癥狀或病癥的有效量施用，例如有效抑制 個體活組織檢查樣本中測定的膠原的生成。1.2用于抑制培養(yǎng)基中HSC生長的方法，其包括向這種培養(yǎng)基使用有效量 非免疫抑制結(jié)合親環(huán)蛋白的環(huán)孢素，例如式I、 Ia或H的化合物。 1.3用于在需要其的患者中抑制與肝病有關(guān)的病癥的方法，其包括給該個體 施用治療有效量的非免疫抑制結(jié)合親環(huán)蛋白的環(huán)孢素，例如式I、 Ia或n 的化合物。1.4用于在需要其的移植受者中預(yù)防或治療與肝病有關(guān)的病癥復(fù)發(fā)的方法， 其包括給所述受者施用治療有效量的非免疫抑制結(jié)合親環(huán)蛋白的環(huán)孢素，ii例如式I、 Ia或H的4匕合物。2. 非免疫抑制結(jié)合親環(huán)蛋白的環(huán)孢素，例如式I、 Ia或II的化合物用于制 備用于如上所定義的任意方法中使用的藥物組合物的用途。3. 用于在如上所定義的任意方法中應(yīng)用的藥物組合物，其包含非免疫抑制 結(jié)合親環(huán)蛋白的環(huán)孢素，例如式I、 Ia或II的化合物，以及一種或多種可藥 用稀釋劑或載體。非免疫抑制結(jié)合親環(huán)蛋白的環(huán)孢素(下文稱"本發(fā)明的環(huán)孢素")在治療 如上文說明的疾病及病癥中的效用可在標準動物或臨床試驗，例如根據(jù)下 文描述的方法中得到證實。A.體夕卜細胞培養(yǎng)照Kato,等人，丄Hepatol (1999) 31 :91-99中所述， 通過用膠原酶順序原位灌流并用鏈霉蛋白酶消化，接著在雙層(17%/11.5%) 甲泛葡胺溶液中(Sigma Chemical, St. Louis， MO)離心，將HSC從雄性 Wistar大鼠的肝臟中分離出來。HSC培養(yǎng)在加10。/。胎牛血清(FCS)的 l)ulbecco's改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中。試驗在第三代和第四代之間連 續(xù)傳代的細胞上進行試驗。為了測定小鼠的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-1)和基 質(zhì)金屬蛋白酶的組織抑制劑(TIMP-1),按照Shibata,等人，Cell Transplant (2003) 12:499-507制備、從HSC分化的人細胞系的TWNT-4細胞，用于 評價Fasudil對MMP-1和TIMP-1的影響。如前面報道的(ld)， TWNT-4 細胞在加有10%FCS的DMEM中培養(yǎng)。NIM811(Novartis Pharma AG， 瑞士巴塞爾)溶解于DMEM中，并加至培養(yǎng)物中。細胞在2nMNIM811存 在下在無血清的條件下24小時，HSC的細胞存活率超過90%。1型膠原蛋白測定:培養(yǎng)的HSC在NIM811存在或缺失情況下在無血 清的培養(yǎng)基中酵育24h。l型膠原蛋白照lwamoto，等人，在丄Hepatol (2000) 32:762-770中所述，在培養(yǎng)基質(zhì)中通過ELISA進行測定?？勾笫?型膠原 蛋白抗體(LSL，日本東京)可用作第一抗體。結(jié)合過氧化物酶羊抗兔 IgG(Organon Teknika Corporation, Durham, NC)用作第二抗體。鼠尾股 原蛋白I型(Advance Biofactures Corporation, Lymbrook， 紐約)用作標準 對照。MMP-1 、TIMP-1和膠原蛋白酶測定:培養(yǎng)的TWNT-4細胞在NIM811 存在或缺失情況下在無血清的培養(yǎng)基中孵育24h。 MMP-1和TIMP-1的生 成在培養(yǎng)基質(zhì)中用帶Biotrak ELISA系統(tǒng)的ELISA進行測定，對人體 MMP畫l(Amersham Biosciences, Piscataway，美國新澤西)及hTIMP-l試劑 盒(Daiichi Fine Chemical Co. Ltd.,日本富山)，分另'J按照Fukushima，等 人，Liver lnt (2005) 25:829-838中所述的方法進行。在培養(yǎng)基質(zhì)中的活性 MMP-1和前-MMP-l用MMP曙l Biotrak Activity Assay System(Amersham) 測定。使用實時RT-PCR的基因表達分析:總RNA由TWNT-4細胞用Trizol 試劑(Invitrogen, Carlsbad,美國加州)制備，其保存在NIM811存在或缺 失的10%FCS中24h。 cDNA由l.Omg RNA用GeneAmpTM RNA PCR使 用隨才幾六聚體(Applied Biosystems， Branchburg，美國紐約)合成。實時PCR 按照Nakamuta，等人，In". Mol Med (2005) 16(4):631國635中的描述使用 LightCycler畫FastStart DNA Master SYBR Green 1 (Roche,日本東京)進 行。使用反應(yīng)混合物(20^1)，含LightCycler-FastStart DNA Master SYBR Green 1、 4 mM MgCl2、 0.5 的上游和下游PCR引物，和作為才莫才反的2 ml的第一鏈cDNA。為了控制反應(yīng)的變異，所有PCR對3-碌酸甘油醛脫 氬酶(CAPI)H)表達進行規(guī) 一 化?？墒褂玫囊锶缦?5，-AGGGTGAGACAGGCGAACAG-3'(正向引物)(SEQ ID NO.l)和 5-CTCTTGAGGTGGCTGGGGCA-3'(反向引物)(SEQ ID N0.2)用于人 體1型膠原蛋白al鏈(GenBankTM登錄號NM-000088)(21); 5'-AATGAGATGGCCACTGCCGC-3'(正向引物)(SEQ ID NO.3)和 5，-CAGAGTATTTGCGCTCCGGA-3，(反向引物)用于人體 a-SMA(GenBankTM 登錄號 NM-000088) ;5-GATCATCGGGACAACTCTCCT-3，( 正 向 引 物)和 5，TCCGGGTAGAAGGGATTTGTG-3，(反向引物)用于 MMP-1 (GenBank， 登 錄 號 NM002421) ;5-TTCTGCAATTCCGACCTCGT-3，( 正 向 引 物 ) 和5，-TCCGTCCACAAGCAATGAGT-3，(反向引物)(SEQ ID NO.4)用于 TIMP-l(GenBankTM 登錄號 NM003254) ;5，-GGATCTCAGGCATTCCTCGG-3，(正向引物)(SEQ ID NO.5)和 5-CAGTATGCCACCACGCACCA-3，(反向引物)(SEQ ID NO.6)用于 Smad7(Quan ， 等人，J Biol Chem (2005) 80:8079-8085); 5'-GGCCGTTTGTATGTGCACCCTC-3'(正向引物)(SEQ ID NO,7)和 5-GGGCGATCTAATGAAGGGTCC畫3，(反向引物)(SEQ ID NO,8)用于轉(zhuǎn) 化生長因子P受體1(TGF(3RI)(Woszcyk等人，Med Sci Monit (2004) 10:C33-C37))。BrdU加入的分析:BrdU的HSC加入按照Higachi，等人J. Lab Clin Med (2005) 145(6):316-322中的描述，4吏用細胞增殖ELISA(Roche Diagnostics GmbH,德國曼海姆)進行測定。簡言之，亞融合HSC血清饑 餓24h。然后將它們用DMEM洗滌并用加10%FCS的DMEM中的BrdU 在NIM811存在或缺失下孵育24h。在細胞用BrdU標記后，消化細胞DNA 并用與過氧化物酶結(jié)合的抗BrdU抗體醉育。BrdU的加入量通過在 45()nm(激發(fā))和690nm(發(fā)射)下測定上清液的熒光強度進行估算。細月包凋亡的分才斤:HSC在NIM811存在或缺失下、在無血清的條件中 保存24h。將細胞在室溫下在4%多聚甲醛/PBS中固定30min，并在4。C下 在含Triton X-100的PBS中透化處理5min。然后將細胞用Hoecnst 33342 染色，并使用原位細胞死亡檢測試劑盒(Roche)按照生產(chǎn)商說明書用 TUNEL法進行分析。樣本用LSM510激光共聚焦顯微鏡(Zeiss)檢視。對 每個條件來自三個獨立試驗和三次不同的細胞制備的至少100個細胞進行 計數(shù)。磷酸化和非磷酸化-MAPK的蛋白質(zhì)印跡分析:蛋白質(zhì)印跡分析如 Uchimur，等人，Hepatology (2001 ) 33:91099中所述的進行。將HSC饑 餓24h，然后在NIM811存在或不存在時處理2h。包含lx107 TWNT-4細 胞的全部細胞裂解液在100^1 SDS-PAGE樣本緩沖液中制備。蛋白裂解液 接受12% SDS-PAGE，轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(Millipore， Bedford, MA)，并用第 一 抗體對 ERK1/2 MAPK 、 鱗酸化-ERK1/2 MAPK (Thr202/Tyr204)、 JNK、磷酸化隱JNK(Thrl83/Tyr185)、 p38 MAPK或磷 酸化-p38 MAPK(Thrl80/Tyr182) (New England Biolabs， Beverly, MA)進 行探測?？贵w結(jié)合4吏用過氧化物酶連接的抗家兔IgG(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway,紐約)作為第二抗體進行檢測。使用 ECL-plus(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway，紐約)顯象印跡以檢 視所述的抗體。ERK1/2 MAPK、磷酸化-ERK1/2 MAPK、 JNK、磷酸化 -JNK、 p38 MAPK和磷酸化-p38 MAPK的水平是使用光學(xué)掃描系統(tǒng)用光 密度測量法進行定量的。為了對比，磷酸化ERK1/2、 JNK和p38MAPK 與未磷酸化的ERK1/2、 JNK和p38 MAPK的比值分別由光密度測定數(shù)據(jù) 進行計算。磷酸化和非磷酸化-Smad2和Smad3的蛋白質(zhì)印跡分析:如上文所述 的對MAPK的分析進行蛋白質(zhì)印跡分析，并用第一抗體對Smad2、磷酸 化-Smad2(Thr/Tyr)、 Smad3、或磷酸化-Smad3(Thr/Tyr)(Ce11 Signaling Technology, Danvers，MA)進行探測。為了對比，磷酸化Smad2和Smad3 與非磷酸化的Smad2和Smad3的比值分別由光密度數(shù)據(jù)計算。統(tǒng)計學(xué)分析:全部結(jié)果以均值土SEM顯示。使用單向ANOVA隨后進 行Scheffe，s檢驗和Mann-Whitney檢驗進行對比。實施例1: NIM811對l型膠原蛋白聚集、MMP-1和TIMP-1生成及膠原蛋 白酶活性的影響為了評價NIM811對HSC的ECM生成的影響，照上文所述調(diào)節(jié)大鼠 HSC數(shù)量后在培養(yǎng)基質(zhì)中測定I型膠原蛋白濃度。用升高濃度的NIM811 以及環(huán)孢素對細胞的處理導(dǎo)致膠原蛋白聚集的濃度依賴性抑制；0.5nM NIM811降低了膠原蛋白聚集約50%。這一抑制作用至少在轉(zhuǎn)錄水平上因 為用NIM811抑制膠原蛋白的表達被調(diào)控。如Nakamuta，等人，Transplant Proc (2005) 37:4598-4602中先前所報道的，環(huán)孢素以臨床相關(guān)濃度 (U25nM(150 ng/ml)降低了膠原蛋白濃度約50%，然而他克莫司以臨似目關(guān)濃度12.5nM(10ng/ml)未顯著降低膠原蛋白的生成。膠原蛋白的聚集， 除了以膠原蛋白生成的速率被測定外，用膠原蛋白酶活性加以調(diào)控，即通 過MMP-1和TMIP-1的平衡4皮調(diào)控。NIM811導(dǎo)致膠原蛋白酶活性(活性 的MMP-1)和前-MMP-1水平濃度依賴性升高；在0.5jtM NIM811存在下， 膠原蛋白酶活性升高了約2倍。但是，NIM811甚至在2.0nM濃度下未顯 著降^f氐TIMP-l的生成。實施例2: NIM811對I型膠原蛋白、MMP-1和TIMP-1基因表達的影響 如本文所述進行RT-PCR評價NIM811或環(huán)孢素對I型膠原蛋白、 MMP-1和TIMP-1的mRNA水平的影響。I型膠原蛋白的表達在0.5pM NIM811存在下被降低約30%。與此相比，0.5nMNIM811升高了 MMP-1 的表達近2倍，但未改變TIMP-1。這些結(jié)果表明NIM811對基因表達的 影響與其對蛋白生成的影響相似。實施例3:法舒地爾對細胞增殖與凋亡的影響前面的工作已證實，除了刺激膠原蛋白生成，活化的HSC通過間質(zhì)膠 原酶諸如MMP-1抑制間質(zhì)膠原蛋白的降解，表明基質(zhì)降解在纖維化* 期間被抑制(見Benyon等人，Gastroenterology (1996) 110:821-831， Iredale，等人，Hepatology (1996) 24:17-184， Iredale，等人，J. Clin Invest (1992) 90:282- 287)。已報道TIMP-1以獨立于基質(zhì)降解的抑制的方式調(diào)節(jié) 細胞生長和凋亡(參閱 Murphy 等人，丄Biol Chem (2002) 277:11069-11076)。 NIM811以濃度依賴方式無細胞凋亡地抑制HSC細胞 生長。BrdU的加入如本文所述地測定以研究NIM811對細胞增殖作用的影 響。定量分析顯示2.0nM NIM811處理降低了新的DNA的合成近30%， 盡管較低濃度的處理未降低。再者，在2nMNIM811存在下，未觀察到細 胞凋亡。我們的結(jié)果表明NIM通過膠原蛋白生成的抑制作用和膠原蛋白酶 活性的提高對肝纖維化具有治療潛力。細胞增殖作用及提高膠原蛋白 酶活性的機制，NIM811對細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)級聯(lián)的影響，諸如在HSC中膠 原蛋白生成和細胞增殖作用中起重要作用的包括ERK1/2、 JNK、和 p38(Marr，等人，Hepatology (2000) 1 :428-434)的MAPK如上文所述進行 了評價。NIM811在0.5nM的濃度下分別提高了 JNK和p38 MAPK的磷 酸化近3.6倍和2.3倍。用NIM811處理以濃度方式顯著提高了 JNK和p38 MAPK的磷酸化，但未抑制ERK1/2。前面已經(jīng)證實環(huán)孢素通過神經(jīng)4丐蛋 白依賴性NFAT途徑和JNK和p38的神經(jīng)4丐蛋白依賴性激活途徑 (Mastuda等人，EMPO Reports (2000) l:428-434)產(chǎn)生免疫抑制作用。作 為環(huán)孢素的類似物的N1M811未激活NFAT途徑，因為其未與親環(huán)蛋白A 結(jié)合(Waldmeier等人，Mol Pharmacol, (2002) 62(1 ):22-29)。 NIM811和 環(huán)孢素對JNK和p38的不同的影響可能來源于N1M811中缺乏NFAT途 徑。實施例5: NIM811對TGFP信號途徑的影響除了 MAPK， TGF-j3信號傳導(dǎo)級聯(lián)強烈刺激著膠原蛋白生成 HSC(Friedman等人，J Biol Chem (1994) 269:10551-10558)。 TGF-卩在細 胞膜上與TGFj3Rn結(jié)合，并且然后TGF(3RII在位于富含甘氨^/絲氨酸的 結(jié)構(gòu)域的絲氨酸和蘇氨酸殘基上磷酸化TGF(3RI(Wrana等人，Cytokine Growth- Factor Rev (2000) 11 :5-13)。磷酸化的TGFj5RI在C-末端SSXS 基序處磷酸化Smad2和Smad3，其形成復(fù)合或普通配偶體Smad4。這些 Smad蛋白移位至核并激活靶基因諸如膠原蛋白(ld)的轉(zhuǎn)錄。因為通過 Smad2和Smad3的信號級聯(lián)如Friedman,等人，J Biol Chem (1994) 269:10551-10558中所述強烈調(diào)控I型膠原蛋白基因的表達，所以評價了 NIM811對Smad2和Smad3磷酸化的影響。用NIM811處理以濃度方式 顯著抑制Smad2和Smad3的礴酸化；0.5, NIM811抑制Smad2和Smad3抑制TGFj5RI近50%。這些結(jié)果 提示NIM811可抑制激酶活性TGF(3RII和/或TGFPRI。 Smad7 (ld)、親免 素FKBP(FK506-結(jié)合蛋白)12 (40)和SARA(受體激活的Smad錨著蛋 白)(41)與TGFPR結(jié)合并調(diào)控TGFP信號傳導(dǎo)。NIM811提高了 Smad7的 表達并抑制TGF P RI，表明NIM811抑制TGF卩信號傳導(dǎo)途徑至少部分通 過受體水平的阻斷。環(huán)孢素對Smad2、 Smad3、 Smad7、和TGF卩RI亦具 有相似的作用(未公開的數(shù)據(jù))。如前所述，NIM811對JNK和p38具有與環(huán)孢素相反的作用，盡管二 者對膠原蛋白生成和細胞增殖顯示出相似的作用，提示NIM和環(huán)孢素主要 阻斷了 TGFp信號傳導(dǎo)途徑而呈現(xiàn)抗纖維形成作用。親環(huán)蛋白是PPI酶家族，其催化氨基末端與脯氨酸殘基結(jié)合的肽的順 -反式相互轉(zhuǎn)化，促進蛋白構(gòu)象的變化(Waldmeier,同上)。有多于十個亞 型的親環(huán)蛋白，它們涉及許多細胞過程，包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控、免疫響應(yīng)、蛋白 分泌和線粒體功能(Waldmeier同上，Duina等人，Science (1996) 274:1713-1715)。 Watashi等人，Hepatology (2003) 38:1282-1288，最近報 道MM811抑制HCV的體外復(fù)制的復(fù)制，然而他克莫司未顯示這種作用。 因為NIM811缺少與親環(huán)蛋白A結(jié)合的能力(14)， NIM811表現(xiàn)為通過與 其他親環(huán)蛋白、諸如親環(huán)蛋白B或D結(jié)合發(fā)揮其藥理作用。值得注意的是， NIM811借助結(jié)合HCVRNA聚合酶的功能調(diào)控物-親環(huán)蛋白B，顯示抗病 毒作用(Watashi等人，Mol Cell (2005) 19:11 1-122)。亦報道MM811具有 細胞保護性質(zhì)，細胞保護作用取決于調(diào)控線粒體通透性轉(zhuǎn)變的親環(huán)蛋白D 的相互作用的干擾(Waldmeier等人，Mol Pharmacol (2002) 62:22-29)。 Kon 等人，Hepatology (2004) 40:1170-1179報道N1M811預(yù)防對乙酰氨基IH秀 導(dǎo)的培養(yǎng)的小鼠肝細胞的壞死和凋亡。B.臨床試驗總共15位肝纖維化/肝硬化患者參加了為期2周的研究。每位患者以7 至15 mg/kg p.o劑量接受本發(fā)明的環(huán)孢素，例如[Melle"-環(huán)孢素。在第0 天及第14天測定每位患者中丙型肝炎抗原血清水平。遭受肝纖維化/肝硬化特別是肝損傷的人可表現(xiàn)以下一種或多種病征 或癥狀(a)ALT升高，(b)對抗HCV抗體檢測陽性，(c)通過對HCV-RNA 檢測陽性確定HCV的存在，(d)慢性肝病的臨床特征，(e)肝細胞損害。此 類標準可不僅用于診斷肝纖維化/肝硬化，也可用于評估患者對藥物治療的 反應(yīng)。已知在不受控制的丙型肝炎中發(fā)生血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)及天 冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)升高，且對治療的完全反應(yīng)一般定義為這些血清 酶，特別是ALT的正常化(Davis等人，1989， New Eng. J. Med. 321:1501-1506)。 ALT為肝細胞受到破壞時釋放的酶且可表明HCV感染。為了跟蹤受試者中HCV復(fù)制對藥物治療反應(yīng)的過程，可通過，例如 嵌套式聚合酶鏈反應(yīng)用來自HCV基因組N53及N54非結(jié)構(gòu)基因區(qū)的兩組 引物測定血清樣本中HCV RNA。 Farci等人，1991， New Eng.丄Med. 325: 98 104。 Ulrich等人，1990，丄Clin. Invest., 86:1609-1614。肝臟活組織檢查樣本的組織學(xué)檢查可使用第二種評估標準，參見，例 如，Knodell等人，1981， Hepatology 1: 431-435,它的組織學(xué)活性指數(shù)(肝 門發(fā)炎、碎片壞死或橋接壞死、小葉損傷及纖維樣變性)提供了疾病活性的 記分法。實施本發(fā)明的方法需要的日劑量將取決于例如，應(yīng)用的非免疫抑制結(jié) 合親環(huán)蛋白的環(huán)孢素、宿主、施用方式、待治療病癥的嚴重度而變化。優(yōu) 選的日劑量范圍為約每天自1至50mg/kg作為單次劑量或分份劑量。用于患者的合適日劑量為例如，1至20 mg/kg p.o或靜脈內(nèi)注射。用 于經(jīng)口施用的合適單位劑型包含大約0.25至10 mg/kg活性成分，例如， IMelle"-環(huán)孢素，以及一種多種可藥用稀釋劑或栽體。本發(fā)明的環(huán)孢素可通過任意常規(guī)途徑施用，特別是經(jīng)腸施用，例如以 用于飲用的溶液、片劑或膠嚢形式經(jīng)口或，例如以可注射溶液劑或混懸劑可為例如，如在UK 2，222，770A中描 述的基于微乳劑的藥物組合物。本發(fā)明的環(huán)孢素可作為唯一成分或與其他藥物一起施用，所述其他藥 物為例如具有抗HCV活性的藥物，例如干擾素，例如干擾素-a-2a或干擾 素普2b,例如IntronRA、 RoferonR、 AvonexR、 Rebi產(chǎn)或BetaferonR，與 水溶性聚合體或與人白蛋白結(jié)合的干擾素，例如albuferon，抗病毒劑，例 如利巴韋林、拉米夫定、NV08或NM283， HCV編碼的因子如NS3/4A蛋 白酶、解旋酶或RNA聚合酶的抑制劑或此種抑制劑的前體藥物，抗纖維 變性劑，例如N-苯基-2-嘧啶-胺衍生物，例如imatinib，免疫調(diào)節(jié)劑，例 如霉酚酸、其鹽或前體藥物，例如霉酚酸鈉或霉酚酸酯或S1P受體激動劑， 例如FTY720或任選磷酸化的其類似物，例如在EP627406A1 、 EP778263A1、 EP1002792A1、 WO02/18395、 WO02/76995、 WO 02/06268、 JP2002316985、 WO03/29184、 WO03/29205、 WO03/62252及WO03/62248 中/>開的那些。干擾素與水溶性聚合物的綴合物表示特別包括與聚環(huán)氧烷均聚物如聚 乙二醇(PEG)或聚丙二醇、聚氧乙烯化多元醇、其共聚物及其嵌段共聚物 的綴合物。作為基于聚環(huán)氧烷聚合物的備選方案，可應(yīng)用有效非抗原性物 質(zhì)如葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、基于碳水化合物 的聚合物等等。此類干擾素-聚合物綴合物在美國專利號4, 766， 106、 4， 917， 888，歐洲專利申請?zhí)? 236 987、歐洲專利申請?zhí)? 510 356及國際申請公 開號W() 95/13090中描述。由于聚合修飾足可降低抗原性反應(yīng)，所以外來 干擾素不必完全為自體的。用于制備聚合物綴合物的干擾素可自哺乳動物 提取物，如人、反芻動物或牛干擾素制備，或重組產(chǎn)生。優(yōu)選的為干擾素 與聚乙二醇的綴合物，也稱為聚乙二醇化干擾素。特別優(yōu)選的干擾素綴合物為聚乙二醇化a-干擾素，例如聚乙二醇化干 擾素-oi-2a、聚乙二醇化干擾素-a-2b;聚乙二醇化共有干擾素或經(jīng)聚乙二醇 化純化干擾素-a產(chǎn)物。聚乙二醇化干擾素-a-2a在歐洲專利593， 868中描 述且例如以商品名PEGASYS (Hoffmann-La Roche)可商業(yè)獲得。聚乙二醇化干擾素-a-2b例如在歐洲專利975,369中描述且例如以商品名 PEG-INTRON An(Schering Plough)可商業(yè)獲得。聚乙二醇化共有干擾素 在WO 96/11953中描述。優(yōu)選的聚乙二醇化a-干擾素為聚乙二醇化干擾素 -a-2a及聚乙二醇化干擾素-a-2b。聚乙二醇化共有干擾素也是優(yōu)選的。對于所用共同活性劑的日劑量取決于例如應(yīng)用的化合物、宿主、施用 方式及所治療的疾病的嚴重性而變化。例如拉米夫定可以日劑量100mg施 用。聚乙二醇化干擾素可每周一至三次腸胃外施用，優(yōu)選每周一次，周總 劑量為2百萬至1千萬國際單位(IU)，更優(yōu)選5百萬至1千萬國際單位， 最優(yōu)選8百萬至1千萬國際單位。根據(jù)上述內(nèi)容，本發(fā)明進一步提供了以下方面4. 藥物組合，其包含a)第一種活性劑，其為非免疫抑制結(jié)合親環(huán)蛋 白的環(huán)孢素，例如式I、 Ia或II的化合物，和b)共同活性劑，例如，用于 如上所定義的任意方法的如上定義的第二種藥物。5. 如上定義的方法，所述方法包含例如相伴或依序共同施用治療有效 量的非免疫抑制結(jié)合親環(huán)蛋白的環(huán)孢素，例如式I、 Ia或II的化合物和共 同活性劑，例如以上所定義的第二種藥物。如文中應(yīng)用的術(shù)語"共同施用，，或"組合施用"等等表示包含對一名 患者施用經(jīng)選擇的治療劑且意欲包括治療方案，其中活性劑不必通過相同 施用途徑或在相同時間施用。本發(fā)明的藥物組合的施用與僅僅應(yīng)用它的藥物活性成分中一種的單一 治療相比產(chǎn)生有益效果，例如協(xié)同治療效果。優(yōu)選的協(xié)同組合為非免疫抑 制結(jié)合親環(huán)蛋白的環(huán)孢素與任選綴合聚合物的干擾素的組合。進一步優(yōu)選的組合為非免疫抑制結(jié)合親環(huán)蛋白的環(huán)孢素與霉酚酸、其 鹽或前體藥物，或與S1P受體激動劑，例如FTY720的組合。IMellel、環(huán)孢素或[MeVal廣環(huán)孢素是根據(jù)本發(fā)明應(yīng)用的優(yōu)選的非免疫 抑制結(jié)合親環(huán)蛋白的環(huán)孢素。
權(quán)利要求
1.環(huán)孢素在制備用于預(yù)防或治療與肝病相關(guān)的病癥的藥物組合物中的用途，其中所述環(huán)孢素(i)以0.7以下的結(jié)合比率(BR)結(jié)合人重組親環(huán)蛋白，BR為在競爭ELISA試驗中測定的環(huán)孢素IC50與環(huán)孢素A在同時發(fā)生的試驗中IC50比率的以10為底數(shù)的對數(shù)；和(ii)在混合淋巴細胞反應(yīng)中活性不超過環(huán)孢素A的5％。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的環(huán)孢素用于制備抑制肝病的藥物組合物的用途。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1的環(huán)孢素用于制備在移植受者中預(yù)防肝病復(fù)發(fā)的藥 物組合物的用途。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1、 2或3的用途，其中所述環(huán)孢素為式I的化合物<image>image see original document page 2</image>其中W為MeBmt、 二氫-MeBmt、 8'-羥基-MeBmt或O-乙酰基-MeBmt1;X為aAbu、 Val、 Thr、 Nva或O-甲基蘇氨酸(MeOThr);R為Pro、 Sar、 (D)-MeSer、 (D)-MeAla或(D)-MeSer(O乙?；?；Y為MeLeu、碌^代MeLeu、 Y畫羥基MeLeu、 Melle、 MeVal、 MeThr、 MeAla、 Mealle或MeaThr; N-乙基Val、 N-乙基Ile、 N-乙基Thr、 N-乙 基Phe、 N-乙基Tyr或N-乙基Thr(O乙?；?；Z為Val、 Leu、 MeVal或MeLeu，Q為MeLeu、 y-幾基-MeLeu、 MeAla或Pro,T！為(D)Ala或Lys，丁2為MeLeu或Y-幾基-MeLeu，和T3為MeLeu或MeAla; 式Ia的化合物<formula>formula see original document page 3</formula>其中W，為MeBmt、 二氫-MeBmt或8'-羥基-MeBmt;X為aAbu、 Val、 Thr、 Nva或O-甲基蘇氨酸(MeOThr);R，為Sar、 (D)-MeSer、 (D)-MeAla或(D)-MeSer(O乙?；?；Y，為MeLeu、 y-羥基-MeLeu、 Melle、 MeVal、 MeThr、 MeAla Mealle或MeaThr; N-乙基Val、 N-乙基Ile、 N-乙基Thr、 N-乙基Phe， N-乙基Tyr或N-乙基Thr(O乙酰基)；Z為Val、 Leu、 MeVal或MeLeu;和Q，為MeLeu、，幾基-MeLeu或MeAla;或式n的化合物<formula>formula see original document page 3</formula>其中<formula>formula see original document page 3</formula>其中Ra為式Ic或Id的殘基<formula>formula see original document page 3</formula>其中R4為d-4烷石克基、氨基C，-4烷硫基、Q-4烷基氨基C,-4烷硫基、二 C,—4烷基氨基-Q-4烷硫基、嘧咬硫基、噻唑硫基、N-CM烷基咪唑硫基、 羥基Cw烷基苯硫基、羥基d—4烷基苯氧基、硝基苯基氨基或2-氧代嘧啶 -l-基，且R、為C,—4烷基，Xa為Abu;Ra為-NMe-CH(Rb)-CO-，其中Rb為H或—S-AIk-R0，其中Alk-Ro為甲基；或Alk為直鏈或支鏈C2-6亞烷基或C3-6環(huán)亞烷基且R()為H; OH; C()OH; (:2-5烷氧基-羰基；NR，R2，其中每個R,及R2獨立地選自H、 d—4 烷基、Cw鏈烯基、<:3.6環(huán)烷基及苯基，其每個任選被卣素、Cw烷氧基、C2-5烷氧基羰基、氨基、d-4烷基氨基和/或二d-4烷基-M取代，及千基和雜環(huán)基，所述節(jié)基及雜環(huán)基為飽和或不飽和的并且含有5個或6個環(huán)成 員和1至3個雜原子，或R，和R2—起與它們所連接的氮原子形成4 - 6元雜環(huán)，其可以含有選自氮、氧及硫的另一雜原子，且任選被C,-4烷基、苯基或芐基取代；或每個R，及R2獨立地為式Ib的基團——N — (CU化—N其中Ri及R2如上所定義，R3為H或d-4烷基，且n為2至4的整數(shù)； Ya為MeLeu或MeLeu; Za為Val;和 Qa為MeLeu ，條件是當Ya為MeLeu時，Rb不為H，或其可藥用鹽。
5. 用于預(yù)防或治療肝病的藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1的環(huán)孢 素與一種或多種可藥用稀釋劑或載體。
6. 藥物組合，其包含a)第一種活性劑，其為根據(jù)權(quán)利要求l的環(huán)孢素， 和b)具有抗纖維生成性質(zhì)的共同活性劑。
7. 用于預(yù)防或治療肝硬化的藥物組合，其包含a)第一種活性劑，其為 根據(jù)權(quán)利要求l的環(huán)孢素，和b)選自具有抗HCV性質(zhì)的活性劑、抗纖維 變性活性劑、免疫調(diào)節(jié)劑或S1P受體激動劑的共同活性劑。
8. 在需要其的個體中預(yù)防或治療肝病的方法，其包括給所述個體施用 治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求1的環(huán)孢素。
9. 抑制培養(yǎng)基中HSC生長的方法，其包括向該培養(yǎng)基使用有效量的根 據(jù)權(quán)利要求l的環(huán)孢素。
10. 在需要其的患者中抑制肝病的方法，其包括給該個體施用治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求1的環(huán)孢素。
11. 在需要其的移植受者中預(yù)防肝病復(fù)發(fā)的方法，其包括給所述受者 施用治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求1的環(huán)孢素。
12. 根據(jù)權(quán)利要求8至11任意一項的方法，其包括相伴或順序共同 施用治療有效量的如權(quán)利要求1所定義的環(huán)孢素和選自具有抗HCV性質(zhì) 的活性劑、抗纖維變性劑、免疫調(diào)節(jié)劑或S1P受體激動劑的共同活性劑。
全文摘要
公開了在預(yù)防或治療肝病中具有有用性質(zhì)的非免疫抑制性結(jié)合親環(huán)蛋白的環(huán)孢菌素。
文檔編號A61K38/13GK101557819SQ200780041044
公開日2009年10月14日 申請日期2007年10月10日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月12日
發(fā)明者中牟田誠, 國府島庸之 申請人:諾瓦提斯公司;九州大學(xué)