專利名稱：緩釋微球及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物緩釋微球領(lǐng)域，特別是涉及一種緩釋微球的制備方法，以及由該方法制備的促紅細(xì)胞生成素緩釋微球。
背景技術(shù)：
制藥行業(yè)從藥物發(fā)現(xiàn)，到臨床的應(yīng)用，最后一個環(huán)節(jié)是藥物制劑。其中有一部分藥物需要長期給藥才能治愈；還有一部分需要靶向等局部給藥。要達(dá)到這些目的，原料藥必須要制備成相應(yīng)的劑型。例如需要長期給藥但在體內(nèi)的半衰期短的藥物，宜制備成緩釋劑型； 對于一些腫瘤的治療，需要一些藥物靶向于病照，例如靶向于腫瘤血管的栓塞微球制劑等； 基因重組技術(shù)用于治療蛋白的表達(dá)和生產(chǎn)的20多年以來，到目前為止，已有30多個蛋白藥物產(chǎn)品投入臨床使用，近200個在審批和研發(fā)過程中，涌現(xiàn)出一批諸如安進(jìn)(Amgen)、基因技術(shù)(Genentech)等一批新的大型醫(yī)藥公司。相對于蛋白大分子藥物本身的快速發(fā)展，其劑型技術(shù)進(jìn)展緩慢。一方面，蛋白大分子藥物口服不吸收、體內(nèi)半衰期短，需要注射給藥；另一方面，許多何爾蒙、細(xì)胞因子類的蛋白藥物治療周期長，長期而頻繁地注射成為必須，也影響患者順應(yīng)性的主要原因。緩釋蛋白藥物的劑型的研發(fā)，由于在制備微粒過程導(dǎo)致活性的損失諸如W/0/W法、包封率不高的S/0/W法和S/0/0法制備的微球易突釋等缺點(diǎn)。發(fā)展制備具有活性保護(hù)的蛋白微球又可以提高包封率和減少突釋的方法勢在必行。到目前還未見利用水包親水油-親水油包油-油包固體(S/0/h0/W)方法制備微球的報道。經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)的檢索發(fā)現(xiàn)，[Lee E. S.，Kwon M. J.，Lee H.，and Kim J. J. , Stabilization of protein encapsulated in poly (lactide-co-glycolide) microspheres by novel viscous S/ff/0/ff method, International Journal of Pharmaceutics 331 (2007)27—37]， (Lee E. S.，Kwon Μ. J.，Lee H.，and Kim J. J.， 艮道了利用新粘度S/W/0/W方法把蛋白穩(wěn)定的包封在PLGA微球里，國際藥學(xué)雜志，2007，331 27-37)。Lee Ε. S.等人在該文獻(xiàn)報道了利用S/W/0/W方法制備了微球。該文獻(xiàn)利用蛋白環(huán)糊精凍干然后磨碎，把磨碎的蛋白環(huán)糊精加到高粘度的多糖溶液及PLGA的二氯甲烷溶液乳化，最后到水相中硬化微球且只是針對蛋白類藥物，沒有見報道其他藥物。但是蛋白質(zhì)環(huán)糊精的顆粒與多糖水溶液接觸難免蛋白質(zhì)不溶解，溶解后的蛋白水溶液很容易與PLGA 的二氯甲烷接觸，存在油水界面而導(dǎo)致聚集。同樣致使包封率也不高，存在不完全釋放。 [Morita Τ. ,Sakamura Y. ,Horikiri Y. , Suzuki Τ. ,Yoshino H. , Protein encapsulation into biodegradable microspheres by a novel S/0/ff emulsion method using poly(ethylene glycol)as a protein micronization adjuvant,Journal of Controlled Release 69(2000)435-444], Morita T.等人在該文獻(xiàn)報道了利用新S/0/W乳化法制備載蛋白微球。只是改變了表面活性劑以前報道較多的是用PVA，在這篇文獻(xiàn)改用PEG。但是仍然不能克服包封率低，存在突釋和不完全釋放的缺點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
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本發(fā)明的目的是提供一種水包親水油-親水油包油-油包固體的緩釋微球的制備方法。本發(fā)明的另一目的是提供一種由上述制備方法制備的促紅細(xì)胞生成素緩釋微球。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案本發(fā)明公開了一種緩釋微球的制備方法，所述制備方法采用水包親水油-親水油包油-油包固體的制備技術(shù)，具體包括如下步驟A.將被包埋的固體成分加入到緩釋或控釋材料的有機(jī)溶液中，即油相中，混勻形成混懸液；本發(fā)明中，進(jìn)一步的，還采用了攪拌、渦旋或超聲波等方式使被包埋的固體成分均勻分散到油相中；B.將步驟A的混懸液加入到不溶解步驟A的緩釋或控釋材料的親水有機(jī)溶液中， 即親水油相中，攪拌形成微球；本發(fā)明中，優(yōu)選的攪拌時間為0. 5-5min ；C.將步驟B形成的微球分散到水相中固化。需要說明的是，在本發(fā)明優(yōu)選的實施例中，所述方法還包括將步驟C的樣品凍干得干燥的緩釋微球；進(jìn)一步的，在凍干之前還包括對步驟C的樣品用水洗滌3-5次。所述步驟A中緩釋或控釋材料選自聚乳酸、聚羥基乙酸、聚乳酸-聚羥基乙酸、 聚己內(nèi)酯中的至少一種，且所述緩釋或控釋材料在有機(jī)溶液中的濃度為重量百分比為 1-50%，優(yōu)選的濃度為重量百分比2-30% ；所述有機(jī)溶液的溶劑為二氯甲烷、乙酸乙酯、乙腈、庚烷、三氯甲烷、丙酮中的至少一種，本發(fā)明中，優(yōu)選的溶劑為二氯甲烷、乙酸乙酯、乙腈中的至少一種。需要指出的是，通過上述步驟A形成油包固體結(jié)構(gòu)，在最終的微球成品中緩釋或控釋材料包裹于固體成分的外面，起到控制固體成分藥物釋放的作用。并且，在本發(fā)明中，所述緩釋或控釋材料在有機(jī)溶液中的濃度對微球成品的粒徑大小起調(diào)節(jié)作用，濃度越高，制備得到的微球成品粒徑越大，在本發(fā)明優(yōu)選的緩釋或控釋材料濃度下，優(yōu)選的微球成品粒徑為1-500 μ m,更優(yōu)選的粒徑為10-100 μ m。所述步驟B中的親水油相含有選自乙醇、丙二醇、乙二醇溶液、液體聚乙二醇中的至少一種有機(jī)溶液，所述有機(jī)溶液占親水油相重量百分比的50-100%，優(yōu)選為65-80% ； 進(jìn)一步的，所述親水油相還含有表面活性劑溶液，所述表面活性劑溶液中優(yōu)選的還含有鈉鹽，優(yōu)選的鈉鹽為氯化鈉，表面活性劑溶液占親水油相總重量百分比的0-40%，優(yōu)選為 5-15%，其中優(yōu)選的表面活性劑為聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、泊洛沙姆、聚三梨醇、乙基纖維素中的至少一種；在表面活性劑水溶液中，表面活性劑的重量百分比為1_10%，氯化鈉的重量百分比為0-10%;更進(jìn)一步的，所述步驟B的親水油相還含有甘油，甘油占親水油相的重量百分比為0-50%，優(yōu)選為15-30%。需要指出的是，親水油相附于步驟A中的油包固體結(jié)構(gòu)的外面，形成親水油包油-油包固體的結(jié)構(gòu)，在水相的固化過程中，外層的親水油包油層對油包固體起保護(hù)作用，使得制備的微球表面光滑圓整、顆粒規(guī)整、微球結(jié)構(gòu)均勻，改善了突釋以及由于突釋造成的環(huán)境污染等問題，保障了微球的包封率以及藥物釋放效果。所述步驟C的水相為重量百分比濃度為1-10%的氯化鈉水溶液，所述固化時間為 1-4小時。本發(fā)明中，優(yōu)選的采用重量百分比濃度為5%的氯化鈉水溶液。需要指出的是， 由于在步驟B中形成了親水油包油-油包固體的結(jié)構(gòu)，再采用水進(jìn)行固化時，有效的將微球分散開來，使得制備的微球具有表面光滑圓整、顆粒規(guī)整無粘連等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明中，所述緩釋微球中被包埋的固體成分包括促紅細(xì)胞生成素葡聚糖顆粒，所述促紅細(xì)胞生成素葡聚糖顆粒含有質(zhì)量百分比1-50%的促紅細(xì)胞生成素和49-50%的
葡聚糖。進(jìn)一步的，所述促紅細(xì)胞生成素葡聚糖顆粒的粒徑為0. 2-10 μ m，優(yōu)選為1_5 μ m。本發(fā)明還公開了一種由上述方法制備的緩釋微球。進(jìn)一步的，所述緩釋微球中促紅細(xì)胞生成素葡聚糖顆粒占緩釋微球總重量百分比 1-50%，用于包埋的緩釋或控釋材料占緩釋微球總重量百分比50-99%。本發(fā)明還公開了一種促紅細(xì)胞生成素緩釋微球，所述促紅細(xì)胞生成素緩釋微球包括被包埋的固體成分及緩釋或控釋材料，所述固體成分包括促紅細(xì)胞生成素葡聚糖顆粒， 所述緩釋或控釋材料包括聚乳酸、聚羥基乙酸、聚乳酸-聚羥基乙酸、聚己內(nèi)酯中的至少一種。所述促紅細(xì)胞生成素葡聚糖顆粒的粒徑為0. 2-10 μ m，優(yōu)選為1_5 μ m，所述促紅細(xì)胞生成素葡聚糖顆粒含有質(zhì)量百分比1-50%的促紅細(xì)胞生成素和49-50%的葡聚糖；所述緩釋微球中促紅細(xì)胞生成素葡聚糖顆粒占緩釋微球總重量百分比1_50%，用于包埋的緩釋或控釋材料占緩釋微球總重量百分比50-99%。由于采用以上技術(shù)方案，本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明使用合適的油相(0)、親水油相(h0)及合適控釋或緩釋的材料，并采用一種新的制備工藝，有效的克服了在常規(guī)的w/o、w/o/w、s/o/w等微球制備方法中存在的包封率不高、載藥量不高、突釋嚴(yán)重，以及由于突釋的造成環(huán)境污染等缺點(diǎn)。本發(fā)明的緩釋微球制備方法，可以根據(jù)不同需要對微球粒徑進(jìn)行控制；可以避免對藥物的治療的作用影響，尤其適用于包埋理化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定、對油水界面敏感的藥物。本發(fā)明提供的促紅細(xì)胞生成素緩釋微球，其表面光滑圓整、均勻度好、顆粒規(guī)整無粘連，包封率高、突釋小、載藥量高，其凍干粉劑為白色細(xì)膩、疏松，不會塌陷、不粘連，再分散性良好。并且，微球粒徑可以根據(jù)需要 Wlym到500 μ m進(jìn)行調(diào)控，可以運(yùn)用到各種需要促紅細(xì)胞生成素長期治療的相關(guān)疾病。


圖1是本發(fā)明實施例中制備的緩釋微球的掃描電鏡圖；圖2是本發(fā)明實施例中制備的緩釋微球的體外釋放曲線。
具體實施例方式本發(fā)明針對目前緩釋微球制備方法中存在的包封率低、釋放不完全、突釋嚴(yán)重，以及易造成環(huán)境污染等問題，提供了一種緩釋微球的制備方法，所述制備方法采用了一種新的制備工藝水包親水油-親水油包油-油包固體的制備技術(shù)(S/0/h0/W)，具體包括如下步驟A.將被包埋的固體成分加入到緩釋或控釋材料的有機(jī)溶液中，即油相中，混勻形成混懸液；B.將步驟A的混懸液加入到不溶解步驟A的緩釋或控釋材料的親水有機(jī)溶液中， 即親水油相中，攪拌形成微球；C.將步驟B形成的微球分散到水相中固化，即得所述緩釋微球。需要說明的是，在本發(fā)明優(yōu)選的實施例中，所述方法還包括將步驟C的樣品凍干得干燥的緩釋微球；進(jìn)一步的，在凍干之前還包括對步驟C的樣品用水洗滌3-5次。所述步驟A中緩釋或控釋材料選自聚乳酸、聚羥基乙酸、聚乳酸-聚羥基乙酸、聚己內(nèi)酯中的至少一種；所述有機(jī)溶液的溶劑為二氯甲烷、乙酸乙酯、乙腈、庚烷、三氯甲烷、 丙酮中的至少一種，優(yōu)選為二氯甲烷、乙酸乙酯、乙腈中的至少一種。所述步驟B中的親水油相為含有選自乙醇、丙二醇、乙二醇、聚乙二醇中的至少一種的水溶液；進(jìn)一步的，所述親水油相還含有表面活性劑，優(yōu)選的表面活性劑為聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、泊洛沙姆、聚三梨醇、乙基纖維素中的至少一種；更進(jìn)一步的，所述步驟B的親水油相還含有甘油。所述步驟C中優(yōu)選的固化時間為1-4小時。上述方法中油相(0)、親水油相(h0)、水相(W)的制備如下油相(0)把控釋或緩釋材料溶于有機(jī)溶劑制備成重量百分比濃度為1-50%的油相，優(yōu)選濃度為2-30%。親水油相(h0):首選，按照表面活性劑重量百分比1_10%，氯化鈉重量百分比 0-10%的量，配制表面活性劑溶液；然后，按如下配方制備親水油相(h0)，配方1 按重量百分比表面活性劑溶液0-40% 有機(jī)溶劑60-100%，將兩者混合即本發(fā)明的親水油相；配方 2:按重量百分比表面活性劑溶液0-30% 有機(jī)溶劑50-100% 甘油0-50%，將三者混合即本發(fā)明的親水油相，更優(yōu)選的混合比例為表面活性劑溶液5-15% 有機(jī)溶劑65-80% 甘油 15-30% ；其中上述重量百分比均為親水油相總重量的百分比。水相(W)配制IOO-IOOOmL的重量百分比的氯化鈉的水溶液，優(yōu)選為重量百分比為5%的氯化鈉水溶液。本發(fā)明在上述緩釋微球制備方法的基礎(chǔ)上還提供了一種促紅細(xì)胞生成素緩釋微球，所述促紅細(xì)胞生成素緩釋微球中被包埋的固體成分為促紅細(xì)胞生成素葡聚糖顆粒，采用授權(quán)號為ZL200610(^9127. 1的專利方法制備。所述促紅細(xì)胞生成素葡聚糖顆粒的粒徑為0. 2-10 μ m,優(yōu)選為1-5 μ m。制備成的促紅細(xì)胞生成素緩釋微球中，所述促紅細(xì)胞生成素葡聚糖顆粒占緩釋微球總重量百分比1_50%，用于包埋的緩釋或控釋材料占緩釋微球總重量百分比50-99%，制備的緩釋微球粒徑大小可以通過步驟A中緩釋或控釋材料的濃度進(jìn)行調(diào)節(jié)，優(yōu)選的微球粒徑范圍為1-500 μ m，更優(yōu)選的為10-100 μ m。本發(fā)明的微球制備方法克服了常規(guī)的微球制備方法中存在的包封率不高、突釋嚴(yán)重的缺點(diǎn)，克服了油水界面、高剪切力、界面、和交聯(lián)劑等問題的影響，在溫和的條件下把藥物載入微球中，微球載藥量高，且能夠長期保持活性，有效的解決了突釋和不完全釋放的問題，大大的減少保存的費(fèi)用和提高療效。同時本發(fā)明提供的促紅細(xì)胞生成素緩釋微球的粒徑小，活性高，其凍干粉劑為白色細(xì)膩、疏松，不會塌陷、不粘連，再分散性良好。可以運(yùn)用到各種需要促紅細(xì)胞生成素長期治療的相關(guān)疾病。下面通過具體實施例并結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。以下實施例僅僅對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的說明，不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。實施例1空白微球的制備(1)制備油相(0)和親水油相(h0)油相(0)把控釋或緩釋材料溶于有機(jī)溶劑制備成重量百分比濃度為1_50%，形成油相(0)。
親水油相(h0)配方1 用表面活性劑和氯化鈉等鹽混和水溶液，它們重量百分比濃度分別為1-10%和0-10%，占親水油相的重量百分比為0-40% ；乙醇、乙二醇、丙二醇或常溫液態(tài)的聚乙二醇為60-100% ；或配方2 用表面活性劑和氯化鈉等鹽混和水溶液，它們重量百分比濃度分別為1-10%和0-10%，占親水油相的重量百分比為0-40% ；用重量百分比為0-50%的甘油與50-100%的乙醇、乙二醇、丙二醇或常溫液態(tài)的聚乙二醇溶液占親水油相的百分比為60-100%。水相(W) :100-1000mL的5%的氯化鈉的水溶液。(2)空白微球制備油相(0)滴加入親水油相(h0)并攪拌、超聲或漩渦0. 5-5分鐘形成0/h0，然后轉(zhuǎn)入水相為IOO-IOOOmL并攪拌1_4小時，離心收集微球并凍干或揮發(fā)除去有機(jī)溶劑得到干燥的微球。通過上述制備的空白微球，其凍干粉劑白色細(xì)膩、疏松、無塌陷、不粘連、再分散性良好。進(jìn)一步的對制備的空白微球進(jìn)行電鏡掃描檢測，結(jié)果顯示制備的微球粒徑小、表面光滑圓整、均勻度好、顆粒規(guī)整無粘連。實施例2載有促紅細(xì)胞生成素葡聚糖顆粒聚乳酸-聚羥基乙酸(PLGA)微球的制備(1)把促紅細(xì)胞生成素葡聚糖顆粒(EPO) IOmg (其粒徑大小分別為1_5 μ m)和重量百分比濃度為20%的PLGA的二氯甲烷溶液IOOmg中攪拌、漩渦或超聲0. 5-5分鐘形成均勻得混懸液即油包固體(S/0)乳液；(2)把步驟⑴得到的乳液滴加到親水油相(h0)[親水油相(h0)的制備用聚乙烯醇(PVA)表面活性劑和氯化鈉鹽混和水溶液占10% (聚乙烯醇重量百分比濃度為5%， 氯化鈉鹽重量百分比為5% )；乙二醇重量百分比為90% ]并攪拌、漩渦或超聲0. 5-5分鐘形成復(fù)乳；(3)把步驟⑵的復(fù)乳滴加到水相(W)[水相(W)的制備5%的氯化鈉的水溶液]， 中并攪拌1-4小時；(4)把步驟(3)得到的離心收集微球，并用水洗滌3-5次，凍干后得干燥的微球。對照組采用傳統(tǒng)的W/0/W法，將等量的EPO的水溶液加到同樣濃度的PLGA有機(jī)溶液中，并攪拌，然后轉(zhuǎn)移到同樣的水相中固化，然后凍干的成品。把上述本發(fā)明方法制備的微球進(jìn)行電鏡掃描，顯微鏡圖(如圖1A)顯示粒徑約 40 μ m-80 μ m0本發(fā)明方法的包封率為90%，對照組僅為50%。將本發(fā)明方法制備的微球、對照組制備的微球以及未經(jīng)處理的EPO原料藥(用來制備微球的EPO原料)，分別添加到UT-7細(xì)胞中培養(yǎng)48小時，并用MTT法檢查。結(jié)果顯示， 添加本發(fā)明方法制備的微球的UT-7細(xì)胞活性比添加對照組微球的活性高49%，比添加EPO 原料藥的UT-7細(xì)胞活性僅低11% ；可見，本發(fā)明方法制備的微球相較于傳統(tǒng)方法制備的微球而言，具有較高的藥效活性。體外釋放曲線如圖2A所示，比對照組降低了突釋。實施例3載有促紅細(xì)胞生成素葡聚糖顆粒聚乳酸-聚羥基乙酸(PLGA)微球的制備(1)把促紅細(xì)胞生成素葡聚糖顆粒20mg (其粒徑大小分別為1_5 μ m)和重量百分比濃度為20 %的PLGA的二氯甲烷溶液IOOmg中攪拌、漩渦或超聲0. 5-5分鐘形成均勻得混懸液即油包固體(S/0)乳液；(2)把步驟(1)得乳液滴加到親水油相(h0)[親水油相(h0)的制備用聚乙烯醇(PVA)表面活性劑和氯化鈉鹽混和水溶液占10% (聚乙烯醇重量百分比濃度為5%，氯化鈉鹽重量百分比為5% )；乙二醇重量百分比為90% ]并攪拌、漩渦或超聲0. 5-5分鐘形成復(fù)乳；(3)把步驟O)的復(fù)乳滴加到水相(W)[水相(W)的制備5%的氯化鈉的水溶液]， 中并攪拌1-4小時；(4)把步驟C3)得到的離心收集微球，并用水洗滌3-5次，凍干后得干燥的微球。對照組采用傳統(tǒng)的W/0/W法，將等量的EPO的水溶液加到同樣濃度的PLGA有機(jī)溶液中，并攪拌，然后轉(zhuǎn)移到同樣的水相中固化，然后凍干的成品。把上述本發(fā)明方法制備的微球進(jìn)行電鏡掃描，顯微鏡圖(如圖1B)顯示粒徑約 40 μ m-80 μ m。本發(fā)明方法的包封率為90%，對照組僅為51 %。將本發(fā)明方法制備的微球、對照組制備的微球以及未經(jīng)處理的EPO原料藥(用來制備微球的EPO原料)，分別添加到UT-7細(xì)胞中培養(yǎng)48小時，并用MTT法檢查。結(jié)果顯示， 添加本發(fā)明方法制備的微球的UT-7細(xì)胞活性比添加對照組微球的活性高45%，比添加EPO 原料藥的UT-7細(xì)胞活性僅低10% ；可見，本發(fā)明方法制備的微球相較于傳統(tǒng)方法制備的微球而言，具有較高的藥效活性。體外釋放曲線如圖2B所示，比對照組降低了突釋。實施例4載有促紅細(xì)胞生成素葡聚糖顆粒聚乳酸-聚羥基乙酸(PLGA)微球的制備(1)把促紅細(xì)胞生成素葡聚糖顆粒5mg(其粒徑大小分別為1_5 μ m)和重量百分比濃度為20 %的PLGA的二氯甲烷溶液IOOmg中攪拌、漩渦或超聲0. 5-5分鐘形成均勻得混懸液即油包固體(S/0)乳液；(2)把步驟(1)得乳液滴加到親水油相(h0)[親水油相(h0)的制備用聚乙烯醇(PVA)表面活性劑和氯化鈉鹽混和水溶液占10% (聚乙烯醇重量百分比濃度為5%，氯化鈉鹽重量百分比為5% )；乙二醇重量百分比為90% ]并攪拌、漩渦或超聲0. 5-5分鐘形成復(fù)乳；(3)把步驟O)的復(fù)乳滴加到水相(W)[水相(W)的制備5%的氯化鈉的水溶液]， 中并攪拌1-4小時；(4)把步驟(3)得到的離心收集微球，并用水洗滌3-5次，凍干后得干燥的微球。
對照組采用傳統(tǒng)的W/0/W法，將等量的EPO的水溶液加到同樣濃度的PLGA有機(jī)溶液中，并攪拌，然后轉(zhuǎn)移到同樣的水相中固化，然后凍干的成品。把上述本發(fā)明方法制備的微球進(jìn)行電鏡掃描，顯微鏡圖(如圖1C)顯示粒徑約 40 μ m-80 μ m0本發(fā)明方法的包封率為90%，對照組僅為50%。將本發(fā)明方法制備的微球、對照組制備的微球以及未經(jīng)處理的EPO原料藥(用來制備微球的EPO原料)，分別添加到UT-7細(xì)胞中培養(yǎng)48小時，并用MTT法檢查。結(jié)果顯示， 添加本發(fā)明方法制備的微球的UT-7細(xì)胞活性比添加對照組微球的活性高50%，比添加EPO 原料藥的UT-7細(xì)胞活性僅低8% ；可見，本發(fā)明方法制備的微球相較于傳統(tǒng)方法制備的微球而言，具有較高的藥效活性。體外釋放曲線如圖2C所示，比對照組降低了突釋。實施例5
載有促紅細(xì)胞生成素葡聚糖顆粒聚乳酸-聚羥基乙酸(PLGA)和聚乳酸(PLA)微球的制備(1)把促紅細(xì)胞生成素葡聚糖顆粒5mg(其粒徑大小分別為1_5 μ m)和重量百分比濃度為20%的PLGA和PLA(重量比為2 3)的二氯甲烷溶液IOOmg中攪拌、漩渦或超聲 0. 5-5分鐘形成均勻得混懸液即油包固體(S/0)乳液；(2)把步驟(1)得乳液滴加到親水油相(h0)[親水油相(h0)的制備用聚乙烯醇(PVA)表面活性劑和氯化鈉鹽混和水溶液占10% (聚乙烯醇重量百分比濃度為5%，氯化鈉鹽重量百分比為5% )；乙二醇重量百分比為90% ]并攪拌、漩渦或超聲0. 5-5分鐘形成復(fù)乳；(3)把步驟(2)的復(fù)乳滴加到水相(W)[水相(W)的制備5%的氯化鈉的水溶液]， 中并攪拌1-4小時；(4)把步驟(3)得到的離心收集微球，并用水洗滌3-5次，凍干后得干燥的微球。對照組采用傳統(tǒng)的W/0/W法，將等量的EPO的水溶液加到同樣濃度的PLA和PLGA 有機(jī)溶液中，并攪拌，然后轉(zhuǎn)移到同樣的水相中固化，然后凍干的成品。把上述本發(fā)明方法制備的微球進(jìn)行電鏡掃描，顯微鏡圖(如圖1D)顯示粒徑約 40 μ m-80 μ m0本發(fā)明方法的包封率為90%，對照組僅為50%。將本發(fā)明方法制備的微球、對照組制備的微球以及未經(jīng)處理的EPO原料藥(用來制備微球的EPO原料)，分別添加到UT-7細(xì)胞中培養(yǎng)48小時，并用MTT法檢查。結(jié)果顯示， 添加本發(fā)明方法制備的微球的UT-7細(xì)胞活性比添加對照組微球的活性高50%，比添加EPO 原料藥的UT-7細(xì)胞活性僅低8% ；可見，本發(fā)明方法制備的微球相較于傳統(tǒng)方法制備的微球而言，具有較高的藥效活性。體外釋放曲線如圖2D所示，比對照組降低了突釋。實施例6載有促紅細(xì)胞生成素葡聚糖顆粒聚乳酸(PLA)微球的制備(1)把促紅細(xì)胞生成素葡聚糖顆粒20mg (其粒徑大小分別為1_5 μ m)和重量百分比濃度為20%的PLA的二氯甲烷溶液IOOmg中攪拌、漩渦或超聲0. 5-5分鐘形成均勻得混懸液即油包固體(S/0)乳液；(2)把步驟(1)得乳液滴加到親水油相(h0)[親水油相(h0)的制備用聚乙烯醇(PVA)表面活性劑和氯化鈉鹽混和水溶液占20% (聚乙烯醇重量百分比濃度為5%，氯化鈉鹽重量百分比為5% )；乙二醇重量百分比為80% ]并攪拌、漩渦或超聲0. 5-5分鐘形成復(fù)乳；(3)把步驟⑵的復(fù)乳滴加到水相(W)[水相(W)的制備5%的氯化鈉的水溶液]， 中并攪拌1-4小時；(4)把步驟(3)得到的離心收集微球，并用水洗滌3-5次，凍干后得干燥的微球。對照組采用傳統(tǒng)的W/0/W法，將等量的EPO的水溶液加到同樣濃度的PLA有機(jī)溶液中，并攪拌，然后轉(zhuǎn)移到同樣的水相中固化，然后凍干的成品。把上述本發(fā)明方法制備的微球進(jìn)行電鏡掃描，顯微鏡圖(如圖1E)顯示粒徑約 50ym-120ymo本發(fā)明方法的包封率為90%，對照組僅為50%。將本發(fā)明方法制備的微球、對照組制備的微球以及未經(jīng)處理的EPO原料藥(用來制備微球的EPO原料)，分別添加到UT-7細(xì)胞中培養(yǎng)48小時，并用MTT法檢查。結(jié)果顯示，
9添加本發(fā)明方法制備的微球的UT-7細(xì)胞活性比添加對照組微球的活性高50%，比添加EPO 原料藥的UT-7細(xì)胞活性僅低8. 2% ；可見，本發(fā)明方法制備的微球相較于傳統(tǒng)方法制備的微球而言，具有較高的藥效活性。體外釋放曲線如圖2E所示，比對照組降低了突釋。實施例7載有促紅細(xì)胞生成素葡聚糖顆粒聚己內(nèi)酯(PCL)微球的制備(1)把促紅細(xì)胞生成素葡聚糖顆粒5mg(其粒徑大小分別為1_5 μ m)和重量百分比濃度為20%的PCL的二氯甲烷溶液IOOmg中攪拌、漩渦或超聲0. 5-5分鐘形成均勻得混懸液即油包固體(S/0)乳液；(2)把步驟(1)得乳液滴加到親水油相(h0)[親水油相(h0)的制備用聚乙烯醇(PVA)表面活性劑和氯化鈉鹽混和水溶液占10% (聚乙烯醇重量百分比濃度為5%，氯化鈉鹽重量百分比為5% )；乙二醇重量百分比為90% ]并攪拌、漩渦或超聲0. 5-5分鐘形成復(fù)乳；(3)把步驟O)的復(fù)乳滴加到水相(W)[水相(W)的制備5%的氯化鈉的水溶液]， 中并攪拌1-4小時；(4)把步驟(3)得到的離心收集微球，并用水洗滌3-5次，凍干后得干燥的微球。對照組采用傳統(tǒng)的W/0/W法，將等量的EPO的水溶液加到同樣濃度的PCL有機(jī)溶液中，并攪拌，然后轉(zhuǎn)移到同樣的水相中固化，然后凍干的成品。把上述本發(fā)明方法制備的微球進(jìn)行電鏡掃描，顯微鏡圖(如圖1F)顯示粒徑約 50 μ Iii-IlOym0本發(fā)明方法的包封率為90%，對照組僅為50%。將本發(fā)明方法制備的微球、對照組制備的微球以及未經(jīng)處理的EPO原料藥(用來制備微球的EPO原料)，分別添加到UT-7細(xì)胞中培養(yǎng)48小時，并用MTT法檢查。結(jié)果顯示， 添加本發(fā)明方法制備的微球的UT-7細(xì)胞活性比添加對照組微球的活性高50%，比添加EPO 原料藥的UT-7細(xì)胞活性僅低8% ；可見，本發(fā)明方法制備的微球相較于傳統(tǒng)方法制備的微球而言，具有較高的藥效活性。體外釋放曲線如圖2F所示，比對照組降低了突釋。以上內(nèi)容是結(jié)合具體的實施方式對本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說明，不能認(rèn)定本發(fā)明的具體實施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種緩釋微球的制備方法，其特征在于所述制備方法采用水包親水油-親水油包油-油包固體的制備技術(shù)，具體包括如下步驟A.將被包埋的固體成分加入到緩釋或控釋材料的有機(jī)溶液中，即油相中，混勻形成混懸液；B.將步驟A的混懸液加入到不溶解步驟A的緩釋或控釋材料的親水有機(jī)溶液中，即親水油相中，攪拌形成微球；C.將步驟B形成的微球分散到水相中固化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述步驟A中緩釋或控釋材料選自聚乳酸、聚羥基乙酸、聚乳酸-聚羥基乙酸、聚己內(nèi)酯中的至少一種，且所述緩釋或控釋材料在有機(jī)溶液中的重量百分比為1_50%，優(yōu)選為2-30%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述步驟B中的親水油相含有選自乙醇、丙二醇、乙二醇溶液、液體聚乙二醇中的至少一種有機(jī)溶液，所述親水油相中還含有表面活性劑溶液和/或甘油。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述步驟C的水相為重量百分比濃度為1-10%的氯化鈉水溶液，所述固化時間為1-4小時。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項所述的制備方法，其特征在于所述緩釋微球中被包埋的固體成分包括促紅細(xì)胞生成素葡聚糖顆粒，所述促紅細(xì)胞生成素葡聚糖顆粒含有質(zhì)量百分比1-50%的促紅細(xì)胞生成素和49-50%的葡聚糖。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于所述促紅細(xì)胞生成素葡聚糖顆粒的粒徑為0. 2-10 μ m,優(yōu)選為1-5 μ m。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項所述的制備方法制備得到的緩釋微球。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的緩釋微球，其特征在于所述緩釋微球中被包埋的固體成分占緩釋微球總重量百分比1_50%，用于包埋的緩釋或控釋材料占緩釋微球總重量百分比 50-99%。
9.一種促紅細(xì)胞生成素緩釋微球，所述促紅細(xì)胞生成素緩釋微球包括被包埋的固體成分及緩釋或控釋材料，其特征在于所述固體成分包括促紅細(xì)胞生成素葡聚糖顆粒，所述緩釋或控釋材料包括聚乳酸、聚羥基乙酸、聚乳酸-聚羥基乙酸、聚己內(nèi)酯中的至少一種。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的促紅細(xì)胞生成素緩釋微球，其特征在于所述促紅細(xì)胞生成素葡聚糖顆粒的粒徑為0. 2-10 μ m,優(yōu)選為1-5 μ m,所述促紅細(xì)胞生成素葡聚糖顆粒含有質(zhì)量百分比1-50%的促紅細(xì)胞生成素和49-50%的葡聚糖；所述緩釋微球中促紅細(xì)胞生成素葡聚糖顆粒占緩釋微球總重量百分比1_50%，用于包埋的緩釋或控釋材料占緩釋微球總重量百分比50-99%。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種緩釋微球的制備方法以及由該方法制備的促紅細(xì)胞生成素緩釋微球。所述制備方法采用水包親水油-親水油包油-油包固體技術(shù)，包括步驟A.將被包埋的固體顆粒加入到緩釋或控釋材料的有機(jī)溶液中，混勻形成混懸液；B.將步驟A的混懸液加入到不溶解步驟A的緩釋或控釋材料的親水有機(jī)溶液中，攪拌形成微球；C.將步驟B形成的微球分散到水相中固化。所述制備方法有效的克服了常規(guī)制備方法中包封率不高、突釋嚴(yán)重、釋放不完全等缺點(diǎn)。本發(fā)明的促紅細(xì)胞生成素緩釋微球表面光滑圓整，顆粒規(guī)整無粘連，其凍干粉劑為白色細(xì)膩、疏松、不塌陷、不粘連、再分散性良好?？梢赃\(yùn)用到各種需要促紅細(xì)胞生成素長期治療的相關(guān)疾病。
文檔編號A61K47/34GK102178654SQ20111011430
公開日2011年9月14日 申請日期2011年5月4日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月4日
發(fā)明者吳飛, 張向榮, 張滌平, 盛光陽, 胡振華, 袁偉恩, 金拓 申請人:深圳賽保爾生物藥業(yè)有限公司, 袁偉恩, 金拓