專利名稱：一種抗活化巨噬細(xì)胞多克隆抗體的制備及對(duì)敗血癥的作用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，涉及一種抑制活化巨噬細(xì)胞活性的兔抗活化巨噬細(xì)胞抗體，本發(fā)明還涉及該抗體在治療敗血癥中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
敗血癥，是由微生物感染造成的一類系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)，是目前造成加護(hù)病房?jī)?nèi)死亡的最主要原因。1991年，美國(guó)大學(xué)危重病學(xué)胸科醫(yī)師/社會(huì)人員會(huì)議(conference of the Americancollege of Chest Physicians/Society of Critical Care Medicine) ^J^ifil 癥定義為“感染造成的系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)”，Bone et al.，Chest, 101 (6) : 1644-1655 (1992)。 此類炎癥反應(yīng)具有多種表現(xiàn)(1)體溫超過38°C或者低于心跳每分鐘超過90次；呼吸急促，每分鐘超過20次，或者過度換氣，表現(xiàn)為CO2分壓低于32mmHg ； (4)白細(xì)胞數(shù)超過12000/mm3，或者少于4000/mm3，或者未成熟嗜中性粒細(xì)胞超過10% 5等，同時(shí)具備兩種以上癥狀者即可確診為敗血癥。敗血癥的發(fā)展涉及到免疫系統(tǒng)、凝血系統(tǒng)、補(bǔ)體系統(tǒng)及ANS等多個(gè)系統(tǒng)的交互作用 Rittirsch et al.，Nat Rev Immunol.，8 (10) :776-787 Q008)。敗血癥經(jīng)常由于感染剛發(fā)生時(shí)，機(jī)體無法有效清除感染源而造成Russell，N Engl J Med. ,355(16) 1699-1713(2006)。先天性免疫作為機(jī)體的第一道防線，通過吞噬細(xì)胞表面表達(dá)的PRRs (如 SRs、TLRs)，能快速識(shí)別病原體表面表達(dá)或者分泌的高度保守的PAMPs Modlin et al. , N Engl J Med. ,340(23) 18；34_1835 (1999)。PAMPs與TLRs結(jié)合后激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑， 活化轉(zhuǎn)錄因子NF-κ B，促進(jìn)與敗血癥相關(guān)的多種促炎癥因子及趨化因子的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)和分泌 Medzhitov et al. , Nature, 388 (6640) :394-397 (1997)。實(shí)驗(yàn)表明，促炎癥因子的活化能在共刺激分子的幫助下激活獲得性免疫系統(tǒng)，并通過促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分泌TF來活化凝血系統(tǒng)Medzhitov，Nature，449 (7164) =819-826(2007)。另一方面，獲得性免疫系統(tǒng)和凝血系統(tǒng)又可分別通過釋放Thl細(xì)胞、分泌IFN- γ、表達(dá)⑶40或者活化凝血酶進(jìn)一步激活先天性免疫系統(tǒng)。多個(gè)系統(tǒng)的正反饋使得炎癥反應(yīng)迅速放大，使得機(jī)體能快速有效地清除感染源。 在正常生理?xiàng)l件下，炎癥反應(yīng)可以通過分泌抗炎癥因子，表達(dá)相應(yīng)受體等機(jī)制進(jìn)行有效地調(diào)控。然而，敗血癥患者體內(nèi)由于過量的微生物感染或者嚴(yán)重的組織損傷(例如由燒傷或多器官損傷引起)使得先天性免疫系統(tǒng)以及它所激活的獲得性免疫系統(tǒng)、凝血系統(tǒng)及交感神經(jīng)等其他系統(tǒng)過度激活，最后造成多器官功能衰竭甚至死亡Hotchkiss et al. , N Engl J Med. ,348(2) :138-150(2003) 巨噬細(xì)胞在敗血癥的免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。首先，它是先天性免疫反應(yīng)中最主要的吞噬細(xì)胞之一 Medzhitov，Nature ;449 (7164) :819_擬6 Q007)。巨噬細(xì)胞表面表達(dá)多種PRRs，如TLRs、SRs等，能快速識(shí)別并清除感染源Medzhitov et al. , N Engl J Med. ,343(5) :338-344QOOO)。其次，在受到病原菌激活后，巨噬細(xì)胞是多種促炎癥因子的主要分泌細(xì)胞，對(duì)炎癥反應(yīng)起著至關(guān)重要的作用Ulloa，Nat Rev Drug Discov. ,4(8) 673-684(2005)。往內(nèi)毒素拮抗的C3H/HeJ小鼠體內(nèi)注射由LPS激活的巨噬細(xì)胞，能顯著增加該小鼠對(duì)LPS的敏感性并能導(dǎo)致該小鼠死亡Freudenberg et al. , Infect Immun., 51(3) :891-895(1986)。若提前將巨噬細(xì)胞的活性抑制，理論上應(yīng)能顯著降低敗血癥的死亡率，達(dá)到預(yù)防的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明正是根據(jù)這一思路，制備了兔抗活化巨噬細(xì)胞多克隆抗體Ab-mph，并在敗血癥小鼠模型中證明了該抗體的預(yù)防作用，為敗血癥的臨床治療奠定了基礎(chǔ)本發(fā)明的目的是提供一種通過抑制巨噬細(xì)胞活性而發(fā)揮預(yù)防敗血癥的抗體。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供該抗體在敗血癥預(yù)防的應(yīng)用。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，采用免疫方法制備的Ab-mph，能通過抑制巨噬細(xì)胞的活性顯著降低敗血癥小鼠的死亡率。該抗體與巨噬細(xì)胞的結(jié)合，能夠通過減少巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子、抑制炎癥細(xì)胞往炎癥部位的遷移以及阻止敗血癥小鼠血液中菌落的生長(zhǎng)，多方面抑制炎癥反應(yīng)，從而預(yù)防敗血癥的發(fā)生。本發(fā)明的技術(shù)解決方案a.活化巨噬細(xì)胞的獲得從多只BALB/c小鼠體內(nèi)提取盲腸內(nèi)容物后，注射入另外的BALB/c小鼠，并正常飼養(yǎng)12hrs。隨后處死小鼠，提取腹腔細(xì)胞，通過粘附法純化得活化巨噬細(xì)胞。b. Ab-mph的制備與檢測(cè)將提取的活化巨噬細(xì)胞由新西蘭大白兔耳緣靜脈注入， 同時(shí)在兔背部多點(diǎn)注射完全福氏佐劑。兩周后重復(fù)進(jìn)行注射，共重復(fù)4次。提取抗血清，分別稀釋不同的倍數(shù)，用流式檢測(cè)抗體滴度。c. Ab-mph的純化及鑒定將免疫過后的兔子放血處死，制備血清后，根據(jù)蛋白A柱子(Pierce公司)說明書從血清中純化兔抗活化巨噬細(xì)胞抗體。將提取的抗體透析、凍干， 重新溶解后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，利用銀染檢測(cè)提出的抗體純度。d. Ab-mph對(duì)各種模型敗血癥的預(yù)防在BALB/c小鼠腹腔或靜脈注射該抗體， 24hrs后，建立各種敗血癥模型，觀察敗血癥小鼠的死亡率。e. Ab-mph對(duì)活化巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響在BALB/c小鼠腹腔或靜脈注射該抗體，24hrs后，建立敗血癥模型，分別于不同的時(shí)間點(diǎn)取小鼠的血清和腹腔液，用夾心酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞因子(TNF-α，IL-6)的分泌水平。f. Ab-mph對(duì)炎癥細(xì)胞遷移的影響在BALB/c小鼠腹腔或靜脈注射該抗體，24hrs 后，在小鼠背部注射形成空氣氣室，并注入盲腸內(nèi)容物。后，提取氣室內(nèi)細(xì)胞并計(jì)數(shù)， 檢測(cè)遷移細(xì)胞的數(shù)量。g. Ab-mph對(duì)血液中菌落生長(zhǎng)的影響在BALB/c小鼠腹腔或靜脈注射該抗體， 24hrs后，取小鼠的血液，稀釋后進(jìn)行涂板培養(yǎng)計(jì)數(shù)。f. Ab-mph對(duì)LPS刺激7細(xì)胞后7分泌細(xì)胞因子的影響在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入Ab-mph，24hrs后，加入LPS，分別在不同的時(shí)間點(diǎn)取上清，測(cè)細(xì)胞因子的分泌水平。


圖1是巨噬細(xì)胞純度的鑒定。A是利用F4/80在流式細(xì)胞儀上鑒定細(xì)胞純度的結(jié)果；B是在顯微鏡下觀察的巨噬細(xì)胞形態(tài)的結(jié)果。圖2是抗體滴度檢測(cè)以及Ab-mph純度鑒定的結(jié)果。A是利用流式檢測(cè)抗體滴度。 C，對(duì)照血清；V，免疫血清。B是銀染鑒定抗體純度的結(jié)果，泳道1，中分子量標(biāo)準(zhǔn)品；泳道2， Ab—mphο圖3是敗血癥小鼠的癥狀——瞇眼。圖4是腹腔注射Ab-mph對(duì)腹腔注射盲腸內(nèi)容物敗血癥小鼠模型的作用，說明腹腔注射Ab-mph對(duì)該模型代表的敗血癥有預(yù)防效果。A是Ab-mph/mlgG 10mg/mL ；B是Ab-mph/ mlgGlmg/mL ；C 是 Ab-mph/mlgG 100 μ g/mL。用 Log-rank 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，#，與 PBS 組相比口 < 0.01 ；##，與 mlgG 組相比，ρ <0.01。圖5是靜脈注射Ab-mph對(duì)腹腔注射盲腸內(nèi)容物敗血癥小鼠模型的作用，說明靜脈注射Ab-mph對(duì)該模型代表的敗血癥有預(yù)防效果。用Log-rank進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，*，與PBS 組相比P <0.05。圖6是靜脈注射Ab-mph對(duì)靜脈注射盲腸內(nèi)容物敗血癥小鼠模型的作用，說明靜脈注射Ab-mph對(duì)該模型代表的敗血癥有少許預(yù)防效果。用Log-rank進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。圖7是預(yù)防性注射對(duì)血清及腹腔液中細(xì)胞因子水平的作用，說明預(yù)防性注射 Ab-mph能降低血清及腹腔液中的細(xì)胞因子水平。A是TNF- α在血清中的含量；B是TNF- α 在腹腔液中的含量；C是IL-6在血清中的含量；D是IL-6在腹腔液中的含量。** :ρ < 0. Olv PBS 組；* :ρ < 0. 05v PBS 組;## :ρ < 0. Olv mlgG 組;# :p < 0. 05v mlgG 組。圖8是預(yù)防性注射Ab-mph對(duì)炎癥細(xì)胞遷移的作用，說明預(yù)防性注射Ab_mph能抑制炎癥細(xì)胞往炎癥部位的遷移。A是檢測(cè)炎癥產(chǎn)生后細(xì)胞遷移與時(shí)間之間的關(guān)系。B是檢測(cè)預(yù)防性注射Ab-mph對(duì)炎癥細(xì)胞遷移的作用。圖9是預(yù)防性注射Ab-mph對(duì)敗血癥小鼠血液中菌落生長(zhǎng)的作用，說明預(yù)防性注射 Ab-mph能減少敗血癥小鼠血液中菌落的生長(zhǎng)。A是各組涂板后拍的照片。B是統(tǒng)計(jì)的各組菌落數(shù)，以PBS組的菌落數(shù)為100%。圖10是Ab-mph在LPS刺激RAW^64. 7細(xì)胞分泌細(xì)胞因子水平的作用，說明Ab_mph 能抑制7細(xì)胞在受到LPS刺激后細(xì)胞因子的分泌。A是檢測(cè)LPS刺激后細(xì)胞因子表達(dá)與時(shí)間之間的關(guān)系。B是檢測(cè)Ab-mph對(duì)7在受到LPS刺激后分泌細(xì)胞因子的作用。
具體實(shí)施方案1、巨噬細(xì)胞的活化、分離與鑒定本實(shí)驗(yàn)中所使用的BALB/c小鼠由本實(shí)驗(yàn)室提供，所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)步驟均經(jīng)過南京大學(xué)分子醫(yī)學(xué)研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)委員會(huì)批準(zhǔn)。取100只BALB/c小鼠，斷頸處死后，打開腹腔，在腹腔右側(cè)靠近背部的位置找到盲腸，在盲端剪開小口后將盲腸內(nèi)容物取出，轉(zhuǎn)移至50mL離心管內(nèi)。每只小鼠的盲腸內(nèi)容物用ImLPBS稀釋，約35只小鼠的盲腸內(nèi)容物放入一個(gè)離心管。將所有懸濁液混勻，500rpm離心5min，收集上清后以1. ImL/管保存于-80°C，避免反復(fù)凍融。每只小鼠腹腔注射100 μ L盲腸內(nèi)容物活化腹腔巨噬細(xì)胞，24hrs后利用貼壁法分
5離腹腔巨噬細(xì)胞。具體操作步驟如下斷頸法處死小鼠(注意防止腹腔出血)，撕開腹腔外膜后，用5mL注射器往腹腔內(nèi)注入4mL0°C PBS (將PBS放在冰上預(yù)冷)，止血鉗封閉針孔，用手敲打腹腔壁anin。收集腹腔液并用ImL (TCPBS沖洗3次。離心去上清，RPMI 1640洗 2次后加入細(xì)胞培養(yǎng)基(10% FBS RPMI 1640)懸浮細(xì)胞，將細(xì)胞稀釋至5 X 106/mL，在每個(gè)培養(yǎng)皿中加入IOmL細(xì)胞懸浮液，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱，37°C，5% CO2孵育^irs。隨后，用去除上清，小心沿壁加入常溫PBS，潤(rùn)洗后除去上清。重復(fù)3次，用以洗去未貼壁細(xì)胞。貼壁的細(xì)胞中大多數(shù)為巨噬細(xì)胞。加入8mL細(xì)胞培養(yǎng)基后，在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，貼壁細(xì)胞較為均一，但其中還是混有體積較小的一些雜細(xì)胞(圖1B)。接下來，用槍吹起貼壁細(xì)胞，計(jì)數(shù)，離心去上清，并用PBS將細(xì)胞稀釋至106/mL，加入BD管(ImL/管)。用3%BSAPBS溶液洗2次后，分別加入IOOyLPE偶聯(lián)的小鼠特異性巨噬細(xì)胞抗體F4/80(l 100)，或者PE偶聯(lián)的驢抗兔二抗(對(duì)照組)，常溫避光孵育lhr。隨后，3% BSAPBS溶液洗2次，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)分離的巨噬細(xì)胞的純度。定義對(duì)照組3% 左右的陽性為可接受的陽性區(qū)域，巨噬細(xì)胞的純度用相同的標(biāo)尺進(jìn)行測(cè)定。流式分析結(jié)果表明，我們提取的巨噬細(xì)胞純度約為77% (圖1A)。2、兔抗活化巨噬細(xì)胞多克隆抗體Ab-mph的制備與純化分離出的活化的巨噬細(xì)胞，以5X106/兔進(jìn)行靜脈注射，并用完全福氏佐劑按照 100 μ L/點(diǎn)，共5點(diǎn)，進(jìn)行皮下輔助注射免疫。兩周后，靜脈注射5Χ106/兔活化的巨噬細(xì)胞，并輔以相同劑量的非完全福氏佐劑進(jìn)行皮下免疫。按第二次的方法，重復(fù)免疫4次，每 2周免疫一次。最后一次免疫過后第七天，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)抗體與活化的巨噬細(xì)胞之間的結(jié)合能力。具體方法為耳緣靜脈取血，37°C孵育airs后，4°C過夜，3000rpm，5min， 提取對(duì)照組和免疫組血清。提取由盲腸內(nèi)容物提前激活的腹腔巨噬細(xì)胞，分別加入不同稀釋比的對(duì)照血清和免疫血清(1 200、1 400、1 800、1 1600、1 3200、1 6400、 1 12800,1 25600)，常溫孵育airs。3% BSAPBS溶液洗去未結(jié)合蛋白后，加入FITC偶聯(lián)的驢抗兔二抗(1 1000)，常溫避光反應(yīng)lhr。3% BSAPBS溶液洗2次，加入300 μ L 3% BSAPBS，利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，觀察免疫血清峰相對(duì)于對(duì)照組峰的偏移，定義兩峰有明顯偏移的最高稀釋倍數(shù)為抗體滴度。分析流式結(jié)果表明，在1 400時(shí)，與對(duì)照血清相比，免疫血清峰有明顯的偏移 (圖2Α)，至1 25600時(shí)，主峰仍有明顯的偏移，但偏移不如1 400明顯(結(jié)果未示)。 因此，巨噬細(xì)胞免疫6次后，兔血清內(nèi)的抗體滴度到達(dá)25600，而且這樣制備的抗體能用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。用3%戊巴比妥鈉徹底麻醉兔子后，頸動(dòng)脈插管放血至50mL離心管內(nèi)，37°C保溫 airs后，4°C過夜，離心提取抗血清。將抗血清利用ftOtein A柱子純化抗活化的巨噬細(xì)胞抗體(Ab-mph)，具體方法為JroteinA裝柱后，用5_10倍柱床體積的緩沖液V平衡，隨后， 將血清用緩沖液V稀釋5倍，進(jìn)行上樣，流速控制在2-3s/滴。最大上樣量為ImLProteinA 上樣ImL血清原液。待液面與柱子表面相切，加入30倍柱床體積的緩沖液V洗去非特異性吸附蛋白。隨后，用0. Imol/LpH 2. 75的甘氨酸洗脫，ImL/管進(jìn)行收集，收集管內(nèi)預(yù)先加入 100L lmol/L pH8. 0的Tris-HCl中和液。收集30管后，OD28tl讀數(shù)。將OD28tl值大于0. 3的蛋白溶液集中在50mL離心管內(nèi)，混勻后轉(zhuǎn)入透析袋，用50mmol/L醋酸銨透析，大于4hrs/ 次，共3次。最后，將透析好的蛋白凍干。
隨后，取少量蛋白用蒸餾水溶解后，進(jìn)行膠濃度為12%的SDS-PAGE。之后用銀染鑒定，具體方法如下以IOyg/孔蛋白上樣，進(jìn)行12% SDS-PAGE。隨后，PAGE膠用銀染固定液常溫固定airs。隨后，將膠置于5%戊二醛中增敏lhr。MilliQ水將戊二醛徹底洗凈 振搖3次，每次0.證！·。隨后將膠放入銀氨反應(yīng)溶液孵育30min。MilliQ水洗3次，5min/ 次。加入銀染顯色液進(jìn)行顯色，待條帶顯示至合適深度，用5%醋酸終止反應(yīng)。結(jié)果表明，純化的抗體很純度很高，因?yàn)樵诳贵w的加樣泳道，除了 IgG的重鏈和輕鏈條帶外，基本上觀察不到任何雜帶(圖2B)。3、Ab-mph對(duì)敗血癥的預(yù)防分別通過腹腔注射和靜脈注射不同體積的盲腸內(nèi)容物進(jìn)行敗血癥造模，選擇 BALB/c小鼠7天死亡率為10 30%的相應(yīng)的注射體積，作為敗血癥模型的制備條件。(1)腹腔注射Ab-mph在敗血癥模型中的預(yù)防作用將71只年齡為6-8周的雌性BALB/c鼠分成7組，分別往各組小鼠腹腔注射100 μ L 的不同濃度的 Ab-mph (10mg/mL, η = 10 ；lmg/mL, η = 10 ；0. lmg/mL, η = 10)、mIgG(10mg/ mL，η = 6 ； lmg/mL, η = 7 ;0· lmg/mL，η = 8)或者 PBS (η = 20)。24hrs 后腹腔注射盲腸內(nèi)容物330 μ L，觀察各組在開始Mhrs內(nèi)的敗血癥癥狀的變化，用Cannon A710進(jìn)行拍照記錄，并統(tǒng)計(jì)各組小鼠7天內(nèi)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的死亡率。小鼠在腹腔注射盲腸內(nèi)容物后半小時(shí)，立即出現(xiàn)鼠毛豎起、不愿活動(dòng)等敗血癥癥狀。iairs后觀察發(fā)現(xiàn)，小鼠出現(xiàn)體溫下降、糞便結(jié)痂粘于肛門處、瞇眼等癥狀，而且所有小鼠窩在一起，基本沒有其他活動(dòng)。在敗血癥造模前24hrs注射mlgG與Ab-mph均能對(duì)敗血癥癥狀有所改善，其中Ab-mph的效果更好，特別表現(xiàn)在敗血癥小鼠瞇眼這個(gè)癥狀。由圖3 看出，對(duì)照組小鼠眼睛基本上完全閉合，精神很差；mlgG組小鼠眼鏡半睜，有些許活動(dòng)的意愿；而Ab-mph組小鼠瞇眼并不明顯，而且活動(dòng)意向較為明顯。提前Mhrs注射Ab-mph還能顯著降低敗血癥小鼠的死亡率，并呈現(xiàn)出劑量依賴性(圖4)。預(yù)防性注射Img或lOOygAb-mph能將小鼠死亡率由75% (n = 20)降低至 0% (n = 10，ρ < 0. 0001)；而預(yù)防性注射10 μ gAb-mph能將死亡率降低至10% (n = 10， P = O. 0009)。提前24hrs腹腔注射mlgG，對(duì)敗血癥小鼠也有一定的保護(hù)作用，但效果不如 Ab-mph。預(yù)防性腹腔注射lmg、100 μ g以及10 μ gmlgG分別能將死亡率降低至16. 7% (n = 6,ρ = 0. 01),42. 9% (η = 7，p = 0. 21),37. 5% (η = 8，ρ = 0. 11)。在劑量為 100 μ g/ 小鼠時(shí)，與mlgG組相比，Ab-mph能顯著降低敗血癥小鼠死亡率(ρ < 0. 0001)。(2)靜脈注射Ab-mph在敗血癥模型中的預(yù)防作用I將19只年齡為6-8周的雌性BALB/c鼠分成2組，分別往各組小鼠腹腔注射100 μ L 的Ab-mph (10mg/mL，η = 10)或PBS (η = 9)。24hrs后腹腔注射盲腸內(nèi)容物330 μ L，觀察各組7天內(nèi)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的死亡率。結(jié)果表明，在敗血癥造模前24hrs尾靜脈注射Ab-mph能顯著降低敗血癥小鼠的死亡率(圖幻。預(yù)防性注射lmgAb-mph能將敗血癥死亡率由原來的 89% (n = 9)降低到 40% (n = 10，ρ = 0. 011)。(3)靜脈注射Ab-mph在敗血癥模型中的預(yù)防作用II將21只年齡為6-8周的雌性BALB/c鼠分成2組，分別往各組小鼠尾靜脈注射 100μ L 不同濃度的 Ab-mph(10mg/mL，n = 11 ；lmg/mL，n = 9 ；0. lmg/mL，n = 5)或 PBS (η = 10)。24hrs后腹腔注射盲腸內(nèi)容物330yL，觀察各組7天內(nèi)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的死亡率。結(jié)果表明，在敗血癥造模前24hrs靜脈注射Ab-mph能在一定程度上降低敗血癥小鼠的死亡率，并呈現(xiàn)出劑量依賴性(圖6)。預(yù)防性注射Img Ab-mph能將小鼠死亡率由60% (n = 10)降低至37% (n = 11)，但沒有顯著性差異(ρ = 0. 14)。小鼠死亡率在其他劑量組沒有改變 (100 μ g Ab-mph, P = O. 65 ； IOyg Ab-mph, ρ = 0. 96)，甚至有上升的趨勢(shì)(10 μ g Ab-mph) 4、血清及腹腔液細(xì)胞因子的檢測(cè)之前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果告訴我們，預(yù)防性注射Ab-mph對(duì)敗血癥有顯著的保護(hù)作用(圖 4，5)，因此，我們希望能找到Ab-mph的作用機(jī)理。臨床數(shù)據(jù)表明，血液中的細(xì)胞因子(比如TNF-a、IL_6)的表達(dá)水平與敗血癥病人的預(yù)后密切相關(guān)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也表明，若能降低 TNF-α和IL-6的水平，能極其顯著地降低敗血癥動(dòng)物的死亡率。所以我們檢測(cè)了小鼠體內(nèi)TNF-α和IL-6的水平。由于我們?cè)谠炷５臅r(shí)候是進(jìn)行腹腔注射盲腸內(nèi)容物，理論上來說，炎癥反應(yīng)發(fā)生時(shí)間最早也最厲害的位置在腹腔中，因此，我們除了檢測(cè)血清中TNF-a 和IL-6表達(dá)水平，還檢測(cè)了這兩種細(xì)胞因子在腹腔液中的表達(dá)水平。 將53只BALB/c鼠分成11組，分別往各組小鼠腹腔注射100 μ L的Ab-mph (IOmg/ mL)、mIgG (lOmg/mL)或PBS，24hrs后腹腔注射300 μ L盲腸內(nèi)容物，分別于3hrs (PBS組，η = 8 ；mlgG 組，η = 2 ；Ab-mph 組，η = 8)、6hrs (PBS 組，η = 5 ；mlgG 組，η = 2 ；Ab-mph 組，η = 5)、12hrs (PBS 組，η = 6 ;mIgG 組，η = 2 ；Ab-mph 組，η = 6)、24hrs (PBS 組，η = 4 ；Ab-mph 組，η = 5)。處死小鼠，提取血液及腹腔液，檢測(cè)TNF-α和IL-6的含量。具體方法如下 將鋪板抗體(coating antibody)用鋪板緩沖液稀釋800倍后，以100 μ L/孔加入酶標(biāo)板內(nèi) 4°C保溫過夜。PBST洗5次，2min/次。分別加入100 μ L按梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品以及以一定比例稀釋的各組血清或腹腔液，隨即加入50 μ L檢測(cè)抗體(detection antibody, TNF- α， 1 1000 ；IL-6,1 4000)，常溫孵育 2. 5hrs。PBST 洗 5 次，2min/次。加入 IOOyLHRP 偶聯(lián)的抗親和素二抗(TNF-α，1 1000 ；IL-6,1 4000)，常溫孵育Ihr后，PBS洗5次， 2min/次，以洗去非特異性吸附。隨后TMB底物顯色5min，加入2mol/L磷酸終止反應(yīng)。最后，0D450讀數(shù)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)得TNF-α和IL_6的含量。檢測(cè)結(jié)果表明，TNF-a和IL_6都是在盲腸內(nèi)容物刺激后6小時(shí)表達(dá)水平最高(圖 7)。與PBS組相比，提前注射Ab-mph能基本上在所有時(shí)間點(diǎn)(除!Bhrs外)顯著抑制TNF-a 在血清與腹腔液的分泌(至少P < 0. 05)，能分別在6hrs、12hrs以及6hrs、12hrs、24hrs顯著抑制IL-6在血清和腹腔液中的分泌(至少ρ < 0. 05)。與mlgG組相比，Ab-mph能顯著抑制TNF- a 12hrs后在血清與腹腔液中的分泌(ρ < 0. 05)，顯著地抑制IL_6^rs時(shí)在腹腔液中的分泌(P < 0. 05)以及I^irs時(shí)在血清中的分泌(ρ < 0. 01)。本次監(jiān)測(cè)mlgG組只含有2只小鼠，組內(nèi)數(shù)量的不足很可能是從圖中直接觀察兩組有顯著差異(比如血清IL-6在 6hrs的表達(dá)水平)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析卻未能發(fā)現(xiàn)有差異的最主要原因。5、預(yù)防性腹腔注射Ab-mph對(duì)細(xì)胞遷移的影響將15只年齡為6-8周的雌性BALB/c小鼠分成6組。將小鼠背部的毛剪干凈后， 由靠近尾巴的背部皮膚注射4mL空氣形成氣囊，并注入50 μ L盲腸內(nèi)容物。分別于!Bhrs (η =3)、6hrs(n = 3)、12hrs(n = 2)、24hrs(n = 2)、36hrs(n = 2)、48hrs(n = 3)斷頸處死小鼠。在氣囊處剪開一個(gè)小口，用ImL PBS潤(rùn)洗。為保證將氣囊中細(xì)胞全部洗出，該步驟重復(fù)5次后。隨后，收集5次的細(xì)胞懸液至IOmL離心管內(nèi)，1000rpm，5min，去上清。根據(jù)離心管底部肉眼觀察的細(xì)胞多少，分別加入適量PBS進(jìn)行計(jì)數(shù)。最后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并作出時(shí)間曲線。結(jié)果表明，細(xì)胞的遷移在36hrs時(shí)最多，因此我們正式實(shí)驗(yàn)便采用該時(shí)間點(diǎn)(圖SA)。將20只年齡為6-8周的雌性BALB/c小鼠分成3組，分別往小鼠腹腔注射100 μ L 的 Ab-mph(lmg/mL，η = 10)、mIgG(lmg/mL，η = 4)或 PBS (η = 6), 24hrs 后，在各組小鼠背部注射4mL空氣形成氣囊，并注入50 μ L盲腸內(nèi)容物。36hrs后按照上述方法收集細(xì)胞并進(jìn)行計(jì)數(shù)(圖8B)。結(jié)果表明，與PBS組和mlgG組相比，Ab-mph都能極其顯著降低炎癥細(xì)胞的遷移(P < 0. OOOlv PBS組；ρ = 0. 0057v mlgG組)。mlgG注射并不能減少細(xì)胞的遷移 (p = 0. 33)。6、預(yù)防性腹腔注射Ab-mph對(duì)敗血癥小鼠血液菌落生長(zhǎng)的影響將12只年齡為6-8周的雌性BALB/c小鼠分成3組，4只/組。分別往小鼠腹腔注入 100 μ L 的 Ab-mph (lmg/mL)、mIgG (lmg/mL)或 PBSJ4hrs 后腹腔注射 300 μ L 盲腸內(nèi)容物 (適當(dāng)減少了注射量，以防止小鼠在12hrs內(nèi)死亡)。iairs后，CO2處死小鼠，在超凈工作臺(tái)內(nèi)，先用70%酒精進(jìn)行表面消毒。接著，在用滅菌的手術(shù)器械打開胸腔后，用由滅菌的抗凝劑(3. 8%檸檬酸三納)潤(rùn)濕過的一次性注射器心臟取血(盡可能多，但少于500 μ L)，力口入含有50 μ L抗凝劑的1.5mL離心管內(nèi)。用槍測(cè)量樣本體積，并算出實(shí)際取血在整個(gè)樣本中所占的體積比。新鮮制備的抗凝血用無菌PBS分別稀釋5倍(PBS組、mlgG組)或3倍 (Ab-mph組)后，吸取5 μ L，均勻涂板于LB培養(yǎng)基上。37°C孵育24hrs后，拍照并計(jì)數(shù)。結(jié)果表明，與PBS組和mlgG組相比，Ab-mph能顯著抑制血液中菌落的生長(zhǎng)(圖9，p = 0. 045v PBS組；ρ = 0. 028v mlgG組)。與對(duì)照組相比，mlgG注射并不能改變血液中菌落的生長(zhǎng)情況(P = 0. 15)。7、預(yù)防性腹腔注射Ab-mph對(duì)敗血癥小鼠血液學(xué)常數(shù)的影響將18只年齡為6-8周的雌性BALB/c小鼠分成3組，6只/組。分別往小鼠腹腔注射 100 μ L 的 Ab-mph (lmg/mL)、mIgG (lmg/mL)或 PBS，24hrs 后腹腔注射 300 μ L 盲腸內(nèi)容物。并于:3hrs、6hrs、12hrs、Mhrs、36hrs、48hrs，分別從尾靜脈取20 μ L血加入抗凝稀釋液中，進(jìn)行血常規(guī)分析。8、Ab-mph預(yù)處理對(duì)7細(xì)胞激活的影響培養(yǎng)7細(xì)胞，待其狀態(tài)較好時(shí)，將細(xì)胞以1 X 105/mL鋪至M孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)。10% FBS RPMI1640培養(yǎng)24hrs后，將培養(yǎng)基換成FBS RPMI1640。18hrs后加入 20ng/mLLPS,分別在 lhr、2hrs、4hrs、6hrs、12hrs、24hrs 取上清檢測(cè) TNF- α 和 IL-6 含量。 去除培養(yǎng)基，并將剩余的細(xì)胞用ImLPBS洗一次之后，加入300 μ L含1 % SDS的PBS裂解細(xì)胞。收集細(xì)胞裂解液，用IOOyL 1% SDS PBS洗一遍后，100°C煮20min。隨后，用BCA試劑盒按照第三章2. 2. 6方法檢測(cè)每孔蛋白含量。分別測(cè)得單位蛋白量TNF-α和IL_6分泌量最高的時(shí)間后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞因子檢測(cè)方法如前。檢測(cè)結(jié)果表明，RAW^H. 7細(xì)胞分別在2hrs、6hrs分泌TNF- α和IL-6能力最強(qiáng)(圖10)。7細(xì)胞以1 X 105/mL鋪至M孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)，24hrs后，分別加入 1% FBSRPMI1640, mlgG (100 μ g/mL)或者 Ab-mph (100 μ g/mL)并培養(yǎng) 18hrs。加入用 FBSRPMI1640稀釋的200ng/mL LPS,分別在airs、6hrs取上清及細(xì)胞裂解液，并進(jìn)行細(xì)胞因子水平的檢測(cè)和蛋白定量。結(jié)果表明，與PBS組及mlgG組相比，Ab-mph都能及其顯著地抑制 RAW264. 7 細(xì)胞分泌 IL-6 的能力(p = 0. 0044v PBS 組；ρ = 0. 0009v mlgG 組，η = 4)， 但并不能改變TNF- α的分泌水平(ρ > 0. 4，n = 4)(見下表)。mlgG處理對(duì)兩個(gè)細(xì)胞因子的分泌都沒有效果(TNF- α，ρ = 0. 44 ； IL-6，ρ = 0. 77)。Ab-mph預(yù)處理對(duì)7細(xì)胞受到LPS刺激后分泌細(xì)胞因子能力的影響
權(quán)利要求
1.一種兔抗鼠活化巨噬細(xì)胞多克隆抗體，其特征在于采用活化的BALB/c小鼠腹腔巨噬細(xì)胞作為免疫原，兔為免疫動(dòng)物，進(jìn)行免疫制備多克隆抗體。
2.一種針對(duì)權(quán)利要求1所述的BALB/c小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的制備及純化，其特征在于a.活化巨噬細(xì)胞的制備利用提取的小鼠盲腸內(nèi)容物注射至BALB/c小鼠腹腔，正常飼養(yǎng)12小時(shí)。b.活化巨噬細(xì)胞的純化斷頸處死BALB/c小鼠，開腹腔，提取腹腔細(xì)胞后，利用貼壁法純化巨噬細(xì)胞。
3.一種針對(duì)權(quán)利要求1所述的多克隆抗體的制備方法，其特征在于免疫程序?yàn)?，基礎(chǔ)免疫采取耳緣靜脈注射活化小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，輔以皮內(nèi)多點(diǎn)注射完全福氏佐劑，免疫劑量為5X106細(xì)胞。加強(qiáng)免疫采取耳緣靜脈注射活化小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，輔以皮內(nèi)多點(diǎn)注射非完全福氏佐劑，免疫劑量為5 X IO6細(xì)胞。
4.一種針對(duì)權(quán)利要求1所述的多克隆抗體在敗血癥中的作用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，具體涉及一種抑制活化巨噬細(xì)胞活性的兔抗活化巨噬細(xì)胞多克隆抗體，以及該抗體在治療敗血癥中的應(yīng)用。本發(fā)明通過盲腸內(nèi)容物刺激制備小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，通過粘附法純化得到活化的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，以此為抗原免疫新西蘭大白兔，獲得了多克隆抗體。經(jīng)多種小鼠敗血癥模型炎癥，該抗體能有效的預(yù)防敗血癥，減少敗血癥死亡率。
文檔編號(hào)A61P7/00GK102477095SQ20101055253
公開日2012年5月30日 申請(qǐng)日期2010年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月22日
發(fā)明者劉建寧, 裘旭華, 譚向陽 申請(qǐng)人:南京大學(xué)