專(zhuān)利名稱(chēng)：分離自至少部分通過(guò)其皮膚進(jìn)行呼吸的生物體的細(xì)菌分離物和衍生自其中的生物活性提取物的制作方法
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大多數(shù)生態(tài)系中多數(shù)微生物附著于表面(Wimpeny，J.W.T.，S.L.Kinniment和M.A.Scourfield，1993，生物膜的生理和生物化學(xué)，pp274-318，S.Denyer，P.Goman和M.Sussman編輯，生物膜形成和控制，Blackwell科學(xué)出版社，英國(guó)倫敦)，動(dòng)物的被覆結(jié)構(gòu)通常是微生物群落發(fā)育的適當(dāng)部位(Alexander，M.1971，微生物生態(tài)學(xué)，JohnWiley and Sons，美國(guó)紐約)。這些微生物群落通常呈現(xiàn)與較大的生物體群落(大群落)相同類(lèi)型的群落水平相互作用。小群落的成員競(jìng)爭(zhēng)有限的原料并形成密切關(guān)系，有時(shí)形成偏害共生關(guān)系(Atlas，R.M.和R.Bartha，1993，微生物生態(tài)學(xué)基礎(chǔ)與應(yīng)用，第3版，BenjaminCumming，美國(guó)紐約；Bull，A.T.和J.H.Slater，1982，微生物相互作用和群落，第1卷，學(xué)術(shù)出版社，美國(guó)紐約；Frederickson，A.G.和G.Stephanopoulos，1981，微生物競(jìng)爭(zhēng)，科學(xué)213972-979)。這種偏害共生策略包括但非限于產(chǎn)生抗生素。
抗生素是由微生物產(chǎn)生的物質(zhì)，其能殺死或抑制其他微生物的生長(zhǎng)(Williams，S.T，1982，抗生素是在土壤中產(chǎn)生的嗎？土壤生物學(xué)2385-87，Williams，S.T.和J.C.Vickers，1986，抗生素產(chǎn)生的生態(tài)學(xué)，微生物生態(tài)學(xué)1243-52；Brock，T.D.，1994，微生物生物學(xué)，第7版，Prentice Hall，Englewood Cliffs，新澤西)。已經(jīng)觀察到這種物質(zhì)的產(chǎn)生是適應(yīng)降低或抑制天然環(huán)境中的競(jìng)爭(zhēng)的結(jié)果(Weiner1996)。在固體和液體培養(yǎng)基中進(jìn)行的產(chǎn)生抗生素的細(xì)菌和抗生素敏感菌之間的競(jìng)爭(zhēng)研究，提供了支持這種理論的論據(jù)(例如Rasool，K.和J.W.T.Wimpenny，1983，用產(chǎn)生抗生素的鏈霉菌和大腸桿菌進(jìn)行混合持續(xù)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，微生物生態(tài)學(xué)8267-277；Turpin，P.E.，V.K.Dihr，K.A.Maycroft，C.Rowlands，和E.M.H.Wellington，1992，鏈霉菌屬對(duì)土壤中沙門(mén)氏菌存活力的作用，F(xiàn)EMS微生物生態(tài)學(xué)101271-280)。在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)表明抗生素的產(chǎn)生阻止競(jìng)爭(zhēng)劑的侵入，但不增進(jìn)侵入或與抗生素敏感微生物建立的群落競(jìng)爭(zhēng)的能力(Wiener，P.1996，關(guān)于細(xì)菌中產(chǎn)生抗生素的生態(tài)學(xué)作用的實(shí)驗(yàn)研究，進(jìn)化生態(tài)學(xué)10405-421)。盡管有在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行抗生素產(chǎn)生的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，但是抗生素的自然作用和產(chǎn)生它們的條件還不清楚(Wiener1996)。
無(wú)肺螈科(Plethodontidae)的蠑螈是現(xiàn)存蠑螈的最大科。其成員大多數(shù)是許多森林和激流群落生態(tài)系中的各種脊椎動(dòng)物。它們的特征是沒(méi)有肺。該科的生活史多種多樣(例如Tilley，S.G.和J.Bemardo，1993，無(wú)肺螈科蠑螈的生活史進(jìn)化，兩棲爬行類(lèi)學(xué)49154-163；Wake，D.B.和S.M.Marks，1993，無(wú)肺螈科蠑螈的發(fā)育和進(jìn)化先前研究回顧和進(jìn)一步研究簡(jiǎn)介，兩棲爬行類(lèi)學(xué)49194-203)。盡管有這些變化，但是它們的生殖生物學(xué)中的保守性，尤其以卵守護(hù)形式進(jìn)行的親代撫育的普遍性(Salthe，S.N.，和J.S.Mecham，1974，生殖和求偶方式，B.Lofts編輯，兩棲動(dòng)物生理學(xué)，第2卷，學(xué)術(shù)出版社，美國(guó)紐約)已充分論證(例如Forester，D.C.1978，守護(hù)雌性Desmognathus ochrophaeus(兩棲綱，有尾類(lèi)，無(wú)肺螈科)和潛在捕食者之間的實(shí)驗(yàn)相遇，兩棲爬行類(lèi)學(xué)雜志12537-541，1979；Highton，R.和T.Savage，1961，雌性紅背蠑螈Plethodon cinereus孵化行為的功能，佛羅里達(dá)州博物館公報(bào)6235-237；Piersol，W.H.1909，Plethodonerythronotus的習(xí)性和幼體狀況，Transactions of the CanadianInstitute8649-493；Ritter，W.E.1903，Autodax lugubris的習(xí)性的進(jìn)一步報(bào)告，美國(guó)博物學(xué)家37883-886；Tilley，S.G.1972。西北卡羅來(lái)納州中Desmognathus ochrophaeus(兩棲類(lèi)，無(wú)肺螈科)的親代撫育和胚發(fā)育的概況，美國(guó)中部博物學(xué)家89394-407)。
親代撫育可以解釋為在合子后親代對(duì)子代進(jìn)行照顧(Trivers，R.L.1985，社會(huì)進(jìn)化，本杰明學(xué)會(huì)，美國(guó)紐約)。在無(wú)肺螈科中，這種照顧是卵守護(hù)形式，最通常是由雌性照顧(Crump，M.I.1995，親代撫育pp518-567，H.Heatwole，B.K.Sullivan編輯，兩棲動(dòng)物生物學(xué)，第2卷社會(huì)行為，Surrey Beatty and Sons，Chipping Norton，澳大利亞新南威爾士)。在大多數(shù)情況下，雌性保持孵育直至發(fā)生孵化。無(wú)肺螈科中這種行為的適應(yīng)性益處清晰可見(jiàn)，包括對(duì)抗捕食者，抗非病原性普通土壤真菌所致的真菌感染的保護(hù)作用，脫水，和預(yù)防畸形發(fā)生(見(jiàn)Crump，1995，綜述)。親代孵育由所有行為組分組成(例如與窩進(jìn)行身體接觸，移動(dòng)卵，喉動(dòng))，這明顯在子代發(fā)育的同時(shí)授予這些多重益處。
盡管親代撫育在無(wú)肺螈科中的益處已經(jīng)清晰論證，但是其中一些方面是怎樣達(dá)到的的機(jī)制目前還不清楚(例如Austin 2000)。在上個(gè)世紀(jì)進(jìn)行的關(guān)于當(dāng)存在雌性親代時(shí)，在孵化中降低真菌感染的許多觀察研究，已經(jīng)部分清楚這種情況。這種觀察產(chǎn)生這樣的設(shè)想雌性動(dòng)物(例如Noble，G.K.1931，兩棲動(dòng)物生物學(xué)，MoGrow Hill，美國(guó)紐約；Piersol，1909)或其產(chǎn)生的胚(Highton和Savage，1961)，產(chǎn)生一種抗真菌代謝物，能降低或抑制在孵化卵上生長(zhǎng)的真菌。隨后的研究表明在蠑螈中沒(méi)有抗微生物分泌物存在的跡象(Daniel，J.C.，Jr.和R.W.Simpson，1954，關(guān)于抗生素的陰性記錄，兩棲爬行類(lèi)學(xué)1016；Forester，D.C.1979，親代撫育在Desmognathus ochrophaeus(兩棲類(lèi)，無(wú)肺螈科)中的適應(yīng)性，Copeia 1979332-341；Tilley，1972；Vial，J.L.，和F.B.Prieb，1966，蠑螈Plethodon cinereus(綠色)的皮膚分泌物的抗生素分析，兩棲爬行類(lèi)學(xué)22284-287；Vial，J.L.和F.B.Prieb，1967，在蠑螈Plethodon cinereus中具有孵育行為功能的抗生素的研究，Missouris科學(xué)學(xué)會(huì)學(xué)報(bào)137-40)。未見(jiàn)公開(kāi)報(bào)道利用兩棲動(dòng)物的皮膚環(huán)境作為具有醫(yī)用價(jià)值細(xì)菌的潛在原料。許多關(guān)于兩棲動(dòng)物或其他生物體的具有醫(yī)用價(jià)值化合物的研究均針對(duì)于在兩棲動(dòng)物或其它大生物體的皮膚分泌物中產(chǎn)生這種化合物，而不是棲居于這種生物體皮膚的細(xì)菌菌群(例如Glausiusz，J.1998，蛙溶液，發(fā)現(xiàn)19(11)88-92；Carte，B.K.1996，海洋天然產(chǎn)物的生物醫(yī)學(xué)潛力，生物科學(xué)46(4)271-287；Port，O.2001，從蛙中研制藥物的飛躍，Business Week375299；Tyler，M.J.1995，蛙與藥物，澳大利亞自然史24(12)46-52；Coghlan，A.2000，Bug busters，新科學(xué)家166(2233)15；Stienborner，S.T.，G.J.Currie，J.H.Bowie，J.C.Wallace，和M.J.Tyler，1998，來(lái)自澳大利亞樹(shù)蛙Litoria chloris皮膚的新抗生素caerin肽1。來(lái)自Litoria屬的caerinl肽的活性對(duì)比，肽研究雜志51(2)，121-127；Rennie，J.1993，這里無(wú)蛇油，科學(xué)美國(guó)人266(3)136-137；McNamee，D.1994，蠑螈的眼睛，蛙的趾，Lancet.344(8938)1696-1698；Erspamer 1994).
由于產(chǎn)生的營(yíng)養(yǎng)豐富的粘液促進(jìn)皮膚呼吸的性質(zhì)，關(guān)于無(wú)肺螈科蠑螈成就的其它方面可歸因于其棲居的微生物群落。由于無(wú)肺螈科蠑螈必須唯一依賴(lài)于其皮膚進(jìn)行氣體交換，在皮膚表面棲居過(guò)量需氧土壤細(xì)菌會(huì)對(duì)呼吸氣體產(chǎn)生不通透的屏障，最后導(dǎo)致蠑螈死亡。
兩棲動(dòng)物的富集營(yíng)養(yǎng)的皮膚環(huán)境已經(jīng)示出支持與周?chē)h(huán)境中的那些微生物截然不同的微生物群落(Austin，Jr.，R.M.1997，東方鋸齒蠑螈Plethodon dorsalis Cope(兩棲類(lèi)，無(wú)肺螈科)的皮膚細(xì)菌菌群，博士論文，Mississippi大學(xué)，MS)。微生物已經(jīng)示出在富集營(yíng)養(yǎng)的環(huán)境中利用偏害共生策略，包括產(chǎn)生抗生素(Frederickson和Stephanopoulos，1981)，所以可以推定兩棲動(dòng)物的皮膚環(huán)境支持能產(chǎn)生降低或抑制微生物生長(zhǎng)的化合物的微生物，因此對(duì)兩棲動(dòng)物的生態(tài)學(xué)和生活史具有競(jìng)爭(zhēng)性益處。令人驚奇地，近來(lái)確定了由分離自生物體皮膚環(huán)境的一些微生物產(chǎn)生的代謝物具有抗人類(lèi)重要致病菌和真菌的抗微生物活性，以及具有抗病毒和抗腫瘤活性，所述生物體是至少部分通過(guò)其皮膚進(jìn)行呼吸。
本發(fā)明的一方面是從細(xì)菌中提取一種化合物或化合物組合，所述細(xì)菌分離自至少部分通過(guò)其皮膚進(jìn)行呼吸的生物體的皮膚，所述化合物具有抗菌，抗真菌，抗病毒或抗腫瘤作用。
本發(fā)明的另一方面是鑒別分離自至少部分通過(guò)其皮膚進(jìn)行呼吸的生物體皮膚的細(xì)菌分離物，從該分離物中提取產(chǎn)生的化合物具有抗菌，抗真菌，抗病毒或抗腫瘤作用。
圖2是參考

圖1所述用作抑制試驗(yàn)對(duì)照的培養(yǎng)皿的照片，其中垂直劃線(xiàn)(EC024)包括分離自Eurycea cirrigera的皮膚的細(xì)菌。
圖3是參考圖1所述用作抑制試驗(yàn)對(duì)照的培養(yǎng)皿的照片，其中垂直劃線(xiàn)(RC003)包括分離自Rana clamitans的皮膚的細(xì)菌。
優(yōu)選實(shí)施方案詳述本發(fā)明包括鑒別取自至少部分通過(guò)其皮膚進(jìn)行呼吸的動(dòng)物皮膚微生物菌群的細(xì)菌分離物，及從分離物中提取化合物或化合物組合(提取物)，所述化合物具有抗菌，抗真菌，抗病毒或抗腫瘤作用。本發(fā)明闡述了鑒別分離物的方法和產(chǎn)生提取物的方法。所述提取物可以包含一個(gè)單一的化合物，化合物組合，或一或多種化合物，當(dāng)其與提取物中的其它化合物組合時(shí)發(fā)現(xiàn)具有協(xié)同作用。
在其天然環(huán)境中收集源生物體，并進(jìn)行分離。在分離后，基于形態(tài)特點(diǎn)生長(zhǎng)并分離生物體皮膚微生物菌群樣品。測(cè)試細(xì)菌分離物和來(lái)自分離物的提取物對(duì)抗在培養(yǎng)基上的擇定細(xì)菌的抗菌作用。使用液體提取技術(shù)從細(xì)菌分離物中制備提取物，然后使用光度測(cè)定法，測(cè)試其抑制選定細(xì)菌和真菌菌株生長(zhǎng)的能力。對(duì)提取物的成分測(cè)試其抑制癌細(xì)胞增殖的能力。實(shí)施例1Desmognathus guadramaculatus中皮膚微生物菌群和對(duì)致病菌的抗菌作用在Piedmont天然公園中收集物種Desmognathus quadramaculatus的雌性孵育者，并置于一個(gè)3.79升的塑料袋中，塑料袋中充填了取自收集地的枯枝落葉和土壤，其置于旅行冷卻器中，并運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。在襯有濕潤(rùn)濾紙的玻璃培養(yǎng)皿中隔離蠑螈，并在6-7℃保持1周。
在分離階段之后，從蠑螈取細(xì)菌樣品，其通過(guò)用細(xì)菌學(xué)接種環(huán)在胸帶和腰帶之間的背部劃線(xiàn)進(jìn)行。將細(xì)菌樣品在胰胨豆胨酵母膏(TSYE)瓊脂(2g Difco Bacto胰胨豆胨培養(yǎng)液，1g Difco Bacto酵母膏，12g Difco Bacto純化的瓊脂，1升水)上培養(yǎng)，并使其在室溫生長(zhǎng)72小時(shí)。將形態(tài)學(xué)獨(dú)立的細(xì)菌菌落再在TSYE瓊脂上分離，并使其生長(zhǎng)72小時(shí)以獲得純化的培養(yǎng)物。一旦獲得純化的培養(yǎng)物，將分離物在TSYE瓊脂上斜面培養(yǎng)，使其在室溫生長(zhǎng)2周，并在5℃貯存直至需要。
將培養(yǎng)平板在黑暗中在環(huán)境溫度下溫育。第二天，在平板上觀測(cè)到不多的生長(zhǎng)。制備每套20個(gè)TSYE平板，共三套。第二天，對(duì)來(lái)自D.quadramaculatus雌性孵育者的4個(gè)平板進(jìn)行觀測(cè)，其令人驚奇地很少生長(zhǎng)，在這4個(gè)平板僅觀測(cè)到7個(gè)菌落。將分離物在新的TSYE平板上劃線(xiàn)以進(jìn)行分離，并在環(huán)境溫度在黑暗中溫育。
在第2天進(jìn)行觀測(cè)，見(jiàn)到6個(gè)菌落并鑒別為DQ001A，DQ001B，DQ001C，DQ001D，DQ001E，和DQ001F。令人注目地，DQ001D是不透明邊緣白色中心的菌落。
制備具有5個(gè)已知人類(lèi)機(jī)會(huì)病原體Staphylococcus epidermidis，Enterobacter aerogenes，Enterococcus faecalis，Corynebacterium xerosis和Serratia marcesens的平行條紋的6個(gè)平板。將平板在37℃溫育72小時(shí)。然后將這6個(gè)平板的每一個(gè)均用6種分離物DQ001A-F的每一種劃線(xiàn)。然后將這6個(gè)平板在37℃溫育72小時(shí)。
對(duì)這6個(gè)平板進(jìn)行觀測(cè)，以確定這6種分離物是否呈現(xiàn)對(duì)5種人類(lèi)機(jī)會(huì)病原體的任意一種具有抑制作用。觀測(cè)到分離物DQ001D表現(xiàn)為抑制Staphylococcus epidermidis(抑制帶＝37mm)，Enterococcus faecalis(抑制帶＝32mm)和Corynebacterium xerosis(抑制帶＝60mm)，但是對(duì)其它兩種病原體無(wú)抑制作用。其它分離物無(wú)一表現(xiàn)為任何抑制作用。實(shí)施例2蠑螈中的皮膚微生物菌群和對(duì)致病細(xì)菌和真菌的抗菌作用材料和方法收集源生物體從其天然的特有的棲居地中收集16種兩棲動(dòng)物物種，每個(gè)物種由至少5個(gè)個(gè)體組成(n＝5)。物種和收集地概括于表1。
收集后，將兩棲動(dòng)物置于3.79升的塑料袋中，塑料袋中充填了取自收集地的枯枝落葉和土壤，置于旅行冷卻器中，并運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。將兩棲動(dòng)物分別在0.0946L的襯有濕潤(rùn)濾紙的塑料容器中隔離，置于Coron6010型環(huán)境艙中，并在16℃保持一周。
在分離后，從每個(gè)兩棲動(dòng)物中取樣細(xì)菌，分離自?xún)蓷珓?dòng)物的表型獨(dú)特的細(xì)菌指定為相當(dāng)于從中獲得分離物的個(gè)體的代碼。對(duì)每個(gè)細(xì)菌分離物均通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)菌落形態(tài)學(xué)方法進(jìn)行表型定性(Salle和Meachem，1974)。這種定性是通過(guò)注意每個(gè)不同的細(xì)菌菌落的整個(gè)菌落形式，邊緣形式，隆起，顏色和表面情況而達(dá)到的。通過(guò)革蘭氏染色方法確定細(xì)菌分離物的革蘭氏染色情況，以有助于鑒別和對(duì)細(xì)菌分離物分類(lèi)，革蘭氏染色方法見(jiàn)于Salle，A.J.1973，細(xì)菌學(xué)基本原理實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，McGraw Hill，美國(guó)紐約。也要注意細(xì)菌分離物的細(xì)胞形態(tài)。在進(jìn)行菌落和細(xì)胞定性之后，將分離自源生物體的形態(tài)獨(dú)特的細(xì)菌在TSYE瓊脂上斜面培養(yǎng)，使其在室溫生長(zhǎng)2周，并在5℃貯存直至需要。瓊脂平板抑制實(shí)驗(yàn)方法學(xué)對(duì)分離自源生物體的形態(tài)獨(dú)特的細(xì)菌分離物，測(cè)試其產(chǎn)生抗微生物化合物的能力，所述化合物有效對(duì)抗革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性人類(lèi)致病菌。用于抑制實(shí)驗(yàn)的人類(lèi)致病菌是Enterococcus faecalis(ATCC#29212)，大腸桿菌(ATCC#25922)，Pseudomonas aeruginosa(ATCC#27853)，和Staphylococcus aureus(ATCC#29213)。
瓊脂平板抑制實(shí)驗(yàn)包括測(cè)試分離自源生物體的每個(gè)形態(tài)獨(dú)特的細(xì)菌抑制人類(lèi)致病菌生長(zhǎng)的能力，根據(jù)Alcamo，I.E.1994，微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)原理，Benjiamin Cumming，美國(guó)紐約，所述方法和方案進(jìn)行。將分離自源生物體的各個(gè)細(xì)菌分離物用細(xì)菌學(xué)接種環(huán)獨(dú)立在TSYE平板上劃一中線(xiàn)。然后將此平板在室溫溫育最少72小時(shí)，以使細(xì)菌生長(zhǎng)。然后將人類(lèi)致病菌菌種以直角單個(gè)劃線(xiàn)至最初存在的細(xì)菌培養(yǎng)物。注意要保證病原性分離物不接觸到最初的細(xì)菌劃線(xiàn)。然后將此平板再溫育48小時(shí)以使人類(lèi)致病菌生長(zhǎng)。在溫育后，檢測(cè)此平板中與源生物體細(xì)菌鄰近的人類(lèi)致病菌分離物的生長(zhǎng)。
在原始存在的細(xì)菌劃線(xiàn)鄰近有一條未觀測(cè)到生長(zhǎng)的條帶，其被認(rèn)為是具有抑制作用。當(dāng)觀測(cè)到這種情況時(shí)，通過(guò)測(cè)定從最初存在的細(xì)菌至最近0.5mm的零生長(zhǎng)帶的距離，對(duì)抑制作用加以定量?？辜?xì)菌/抗真菌代謝物抑制實(shí)驗(yàn)方法將在瓊脂平板抑制實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)為抑制人類(lèi)致病菌生長(zhǎng)的分離自源生物體的細(xì)菌，在環(huán)境溫度下在0.5L液體TSYE培養(yǎng)基中生長(zhǎng)7天。每種分離物均以雙份在培養(yǎng)瓶中生長(zhǎng)，以進(jìn)行兩個(gè)不同的提取步驟。在生長(zhǎng)階段后，將由分離自源生物體的細(xì)菌分離物產(chǎn)生的復(fù)雜分子(代謝物)，利用標(biāo)準(zhǔn)液體提取方法從液體培養(yǎng)基中提取出。
提取方法包括兩個(gè)獨(dú)立的提取步驟，設(shè)計(jì)為定向提取水溶性和非水溶性化合物，以進(jìn)行進(jìn)一步測(cè)試。
水溶性提取步驟包括將含有細(xì)菌分離物細(xì)胞培養(yǎng)物的液體培養(yǎng)基樣品在-80℃速凍。在速凍后，將冷凍的樣品凍干。在凍干后，將樣品加入0.5L的100％甲醇中并機(jī)械性攪拌1小時(shí)。將樣品過(guò)濾滅菌以保證除去所有細(xì)菌細(xì)胞/細(xì)胞片段。然后利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將甲醇從所得甲醇/化合物混合物中蒸發(fā)，只剩下含有一或多種具有潛在生物學(xué)活性的化合物的多重化合物粗提物。
非水溶性提取步驟包括在含有細(xì)菌分離物細(xì)胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)基樣品中加入150ml乙酸乙酯。然后將此所得混合物機(jī)械性攪拌15分鐘。通過(guò)分離漏斗將乙酸乙酯從混合物中分離并除去。將整個(gè)步驟重復(fù)3次，產(chǎn)生450ml的乙酸乙酯/化合物混合物。然后將乙酸乙酯使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器從所得混合物中蒸發(fā)，只剩下含有一或多種具有潛在生物學(xué)活性的化合物的多重化合物粗提物。
對(duì)通過(guò)水溶性或非水溶性提取步驟得自每個(gè)抑制性細(xì)菌分離物的每種所得代謝物提取物，測(cè)試其抑制一或多種人類(lèi)致病菌，抗生素抗性人類(lèi)致病菌，人類(lèi)真菌病原體，和人類(lèi)致病病毒的能力。所用的人類(lèi)致病菌是Enterococcus faecalis ATCC29212，萬(wàn)古霉素抗性Enterococcus faecalis(VRE)ATCC700221，Staphylococcus aureusATCC29213，二甲氧基苯青霉素抗性Staphylococcus aureus(MRSA)ATCC33591，Streptococcus pyogenes ATCC12358，青霉素抗性Streptococcus pneumonia ATCC700674，Pseudomonas aeruginosaATCC27853，和Salmonella typhimurium ATCC700408。所用的人類(lèi)致病真菌是Candida albicans ATCC24433，Microsporum gypseumATCC14683，Trichophyton mentagrophytes ATCC9533，和Aspergillusfumigatus IHEM2895。
在Mueller-Hinton培養(yǎng)液中進(jìn)行抗細(xì)菌測(cè)試。通過(guò)產(chǎn)生選自18-24小時(shí)瓊脂平板中分離菌落的直接鹽水懸浮液，制備接種物。之后將接種物標(biāo)準(zhǔn)化為500000CFU/ml。溫育溫度為35℃，溫育時(shí)間為16小時(shí)。酵母篩選在補(bǔ)加0.3g/l谷氨酰胺和3.46g/l嗎啉代丙烷磺酸(MOPS-緩沖液)的PRMI1640培養(yǎng)液中進(jìn)行。溫育溫度為35℃，溫育時(shí)間為24小時(shí)。
接種物是通過(guò)產(chǎn)生選擇自18-24小時(shí)Sabouraud瓊脂平板的分離的菌落的直接鹽水懸浮液而制備的。之后將接種物標(biāo)準(zhǔn)化(1000-5000CFU/ml)。作為測(cè)定工具，生長(zhǎng)曲線(xiàn)下的面積通過(guò)Biolink軟件自動(dòng)測(cè)定。將只含有培養(yǎng)液和測(cè)試化合物(如25ppm提取物)的樣品面積從也含有接種物的樣品面積中減去。對(duì)每個(gè)樣品重復(fù)5次實(shí)驗(yàn)，獲得可以與參考抗生素例如兩性霉素B，青霉素和萬(wàn)古霉素相對(duì)比的一個(gè)數(shù)值。結(jié)果以與無(wú)測(cè)試化合物的樣品相對(duì)的生長(zhǎng)百分率表示。
抗霉菌篩選是在補(bǔ)加0.3g/l谷氨酰胺和3.46g/l嗎啉代丙烷磺酸(MOPS-緩沖液)的PRMI1640培養(yǎng)液中進(jìn)行。對(duì)Aspergillus sp.而言，溫育溫度/時(shí)間為35℃/48小時(shí)。對(duì)皮膚真菌而言，溫育溫度為25℃，溫育時(shí)間為5天。
接種物是通過(guò)用大約1ml無(wú)菌鹽水覆蓋培養(yǎng)7天的培養(yǎng)物而制備的。懸浮液通過(guò)用Pasteur移液管尖輕輕探查菌落而產(chǎn)生。之后，將接種物標(biāo)準(zhǔn)化(4000-50000CFU/ml)。針對(duì)霉菌，不用動(dòng)力學(xué)測(cè)定，只進(jìn)行開(kāi)始和結(jié)束點(diǎn)測(cè)定。作為測(cè)定工具，我們使用通過(guò)Biolink軟件自動(dòng)測(cè)定的OD(開(kāi)始和結(jié)束)。將開(kāi)始OD從結(jié)束OD中減去。對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行5次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。這些數(shù)據(jù)獲得一個(gè)數(shù)值，其可以與參考抗生素例如兩性霉素B相對(duì)比。結(jié)果也以相對(duì)于無(wú)測(cè)試化合物的樣品的生長(zhǎng)百分率表示。
將人類(lèi)致病細(xì)菌和真菌暴露于100和25ug/ml(ppm)標(biāo)準(zhǔn)化濃度的代謝物，所述代謝物是從分離自源生物體的每種細(xì)菌中提取的。利用Bioscreen C分析儀進(jìn)行代謝物抑制實(shí)驗(yàn)，這種分析儀是一種能通過(guò)垂直光度測(cè)定(光密度)監(jiān)測(cè)細(xì)菌和真菌濁度發(fā)育(及生長(zhǎng))的自動(dòng)讀數(shù)溫育器。將結(jié)果用于產(chǎn)生與得自細(xì)菌分離物的代謝物提取物相關(guān)的生長(zhǎng)曲線(xiàn)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)均包括一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照或具有已知抗測(cè)試生物體的MIC的參考抗生素?？共《疽种茖?shí)驗(yàn)方法從粗提物中提取各種代謝物，所述粗提物是通過(guò)前述的兩個(gè)提取步驟，使用HPLC層析柱，尤其Beckman Ultrasphere(4.6mm×150mm)，PartNo.235330，RP-18，5m粒徑，從源生物體的皮膚環(huán)境中分離的細(xì)菌中獲得的。洗脫劑是75∶25的乙腈和水的混合物，流速1ml/分鐘。UV檢測(cè)儀設(shè)定為210nm。對(duì)從源生物體的皮膚環(huán)境中分離的細(xì)菌中提取的代謝物，測(cè)試其在人類(lèi)淋巴細(xì)胞CEM和MT-4細(xì)胞培養(yǎng)物中抑制HIV誘導(dǎo)的細(xì)胞病變的能力。將CEM細(xì)胞懸浮在大約250000個(gè)細(xì)胞/ml的培養(yǎng)基中，并用野生型HIV-1(IIIB)感染，以100倍的50％細(xì)胞培養(yǎng)感染劑量(CCID50)/ml感染。然后，將100微升感染細(xì)胞懸浮液加入200微升微滴定平板孔中，所述孔中含有100微升適當(dāng)稀釋的測(cè)試混合物。在37℃溫育4天后，將細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)顯微鏡檢測(cè)合胞體形成情況。EC50(半數(shù)有效濃度)定義為半數(shù)抑制合胞體形成所需的化合物濃度。抗腫瘤實(shí)驗(yàn)方法對(duì)從源生物體的皮膚環(huán)境中分離的細(xì)菌中提取的代謝物，測(cè)試其抑制f-鼠白血病細(xì)胞(L1210/0)，小鼠乳腺癌細(xì)胞(FM3A)和人類(lèi)T淋巴細(xì)胞(Molt4/C8和CEM/0細(xì)胞)增殖的能力。所有分析均在96孔微滴定平板中進(jìn)行。在每個(gè)孔中加入5-7.5×104個(gè)細(xì)胞和給定數(shù)量的測(cè)試化合物。使細(xì)胞在37℃，在控制CO2的濕潤(rùn)環(huán)境中增殖48小時(shí)(小鼠白血病L1210，小鼠乳腺癌FM3A)或72小時(shí)(人類(lèi)淋巴細(xì)胞CEM和Molt)。在溫育結(jié)束時(shí)，在Coulter計(jì)數(shù)儀中計(jì)數(shù)。IC50(半數(shù)有效抑制濃度)定義為半數(shù)降低存活細(xì)胞數(shù)的化合物濃度。結(jié)果從16種兩棲動(dòng)物(源生物體)中取樣皮膚微生物菌群，所述動(dòng)物包括13種蠑螈和3種蛙(表1)。從這些樣品中，共分離417種形態(tài)學(xué)獨(dú)特的細(xì)菌分離物。這些包括來(lái)自蠑螈的356種獨(dú)特分離物，包含306種革蘭氏陰性桿菌，20種革蘭氏陽(yáng)性桿菌，25種革蘭氏陰性球菌和5種革蘭氏陽(yáng)性球菌，及來(lái)自蛙的61種獨(dú)特分離物，包含37種革蘭氏陰性桿菌，10種革蘭氏陽(yáng)性桿菌，7種革蘭氏陰性球菌和7種革蘭氏陽(yáng)性球菌(表2)。
表2分離自?xún)蓷珓?dòng)物皮膚環(huán)境的細(xì)菌分離物概括
瓊脂平板抑制實(shí)驗(yàn)對(duì)417種獨(dú)特的細(xì)菌分離物的每一種對(duì)抗4種人類(lèi)細(xì)菌病原體Enterococcus faecalis(ATCC29212)，大腸桿菌(ATCC25922)，Pseudomonas aeruginosa(ATCC27853)，和Staphylococcus aureus(ATCC29213)進(jìn)行的瓊脂平板抑制實(shí)驗(yàn)，表明有13種獨(dú)特的細(xì)菌分離物能抑制一或多種所述人類(lèi)病原體生長(zhǎng)。這13種分離物中，9種分離自無(wú)肺螈科蠑螈，4種分離自Hylidae和Ranidae科的蛙。Desmognathus quadramaculatus的分離物，與實(shí)驗(yàn)1的妊娠雌性孵育者不同，基本未呈現(xiàn)抑制。已知蠑螈的皮膚微生物菌群受激素，環(huán)境變化和其它因素影響，因此在實(shí)驗(yàn)1和實(shí)驗(yàn)2的個(gè)體之間觀測(cè)到微生物菌群不同是不吃驚的。因此，實(shí)驗(yàn)1的細(xì)菌分離物DQ001D包括在實(shí)驗(yàn)2進(jìn)行的測(cè)試中。能抑制致病菌生長(zhǎng)的這13種獨(dú)特的細(xì)菌分離物概括于表3。表3分離自?xún)蓷珓?dòng)物的呈現(xiàn)抑制活性的細(xì)菌的菌落和細(xì)胞形態(tài)特征概括
在分離自源生物體的13種獨(dú)特的細(xì)菌分離物中，有8種表現(xiàn)為能抑制一種以上測(cè)試的人類(lèi)致病菌。5種分離自源生物體的獨(dú)特細(xì)菌分離物只有效抑制一種測(cè)試的人類(lèi)病原體。從表4的數(shù)據(jù)中可以看出，細(xì)菌分離物DQ001D，AC021，EG006，EC009，PO026，PO027，和RC003表現(xiàn)為能產(chǎn)生抑制Enterococcus faecalis(ATCC29219)的生長(zhǎng)的化合物。細(xì)菌分離物EG006，EC009，PO014，EC024，和AC024表現(xiàn)為能產(chǎn)生抑制大腸桿菌(ATCC25922)生長(zhǎng)的化合物。細(xì)菌分離物AC021，PO019，PO014，PO027，RC003，PD026和PC017表現(xiàn)為能產(chǎn)生抑制Staphylococcus aureus(ATCC29213)生長(zhǎng)的化合物。細(xì)菌分離物EC024和AC024表現(xiàn)為能產(chǎn)生抑制Pseudomonasaeruginosa(ATCC27853)生長(zhǎng)的化合物。
表4細(xì)菌分離物對(duì)人類(lèi)致病菌的抑制帶
抗細(xì)菌/抗真菌代謝物抑制實(shí)驗(yàn)對(duì)從所述13種細(xì)菌分離物中提取的代謝物，進(jìn)行測(cè)試其抑制致病細(xì)菌或真菌生長(zhǎng)的效力，所述細(xì)菌分離物是從源生物體中分離的，其在瓊脂平板抑制實(shí)驗(yàn)中抑制致病細(xì)菌生長(zhǎng)。在這些代謝物中，來(lái)自細(xì)菌分離物DQ001D，PO026，PO027，和PC017的提取物在抑制致病細(xì)菌，致病真菌或這二者中，表現(xiàn)為強(qiáng)生物活性。
來(lái)自分離物DQ001D的代謝物，在100ppm(ug/ml)和25ppm有效抑制多重革蘭氏陽(yáng)性致病菌。特別地，來(lái)自DQ001D的代謝物提取物完全抑制致病性Enterococcus faecalis，萬(wàn)古霉素抗性Enterococcus faecium，Staphylococcus aureus，二甲氧基青霉素抗性Staphylococcus aureus，Streptococcus pyogenes，和青霉素抗性Streptococcus pneumonia的生長(zhǎng)。另外，來(lái)自DQ001D的代謝物提取物在100ppm還有效地完全抑制人類(lèi)致病真菌Candida albicans的生長(zhǎng)，并示出在100ppm部分抑制人類(lèi)致病真菌Microsporum gypseum的生長(zhǎng)。
來(lái)自分離物PO026的代謝物提取物示出在100ppm完全抑制致病真菌Candida albicans的生長(zhǎng)。
來(lái)自分離物PO027的代謝物提取物在25ppm有效地完全抑制人類(lèi)致病菌Staphylococcus aureus生長(zhǎng)。另外，來(lái)自分離物PO027的代謝物提取物在250ppm也抑制致病真菌Candida albicans的生長(zhǎng)。
來(lái)自分離物PO017的代謝物提取物示出在100ppm抑制人類(lèi)致病真菌Candida albicans的生長(zhǎng)。最近從兩棲動(dòng)物中分離的其它細(xì)菌的提取物的抗菌和抗真菌活性獲得相似結(jié)果，進(jìn)一步表明應(yīng)用本發(fā)明可以在將來(lái)發(fā)現(xiàn)其它這種活性。抗病毒抑制實(shí)驗(yàn)對(duì)從所述13種細(xì)菌分離物中提取的代謝物，進(jìn)行測(cè)試其抑制人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV)的多個(gè)毒株生長(zhǎng)的效力，所述細(xì)菌分離物是從源生物體的皮膚環(huán)境中分離的，其在瓊脂平板抑制實(shí)驗(yàn)中抑制致病細(xì)菌生長(zhǎng)。在這些代謝物中，來(lái)自DQ001D的代謝物提取物(存留時(shí)間7.27分鐘)表現(xiàn)為明顯的抑制HIV在人類(lèi)淋巴細(xì)胞CEM和MT-4細(xì)胞培養(yǎng)物中的致細(xì)胞病變性。特別地，抑制HIV-1和HIV-2在CEM細(xì)胞中的HIV致細(xì)胞病變作業(yè)所需要的DQ001D的有效代謝物濃度，分別是7ppm和17ppm。抑制HIV-1在MT-4細(xì)胞中的HIV誘導(dǎo)的致細(xì)胞病變作用所需要的DQ001D的有效代謝物濃度為9ppm。從DQ001D提取的代謝物對(duì)MT-4細(xì)胞的毒性經(jīng)測(cè)定為40ppm?；跍y(cè)試所述分離物的數(shù)據(jù)，預(yù)期可以提示其它分離物的抗病毒活性?？鼓[瘤實(shí)驗(yàn)從細(xì)菌分離物DQ001D中提取的代謝物，示出分別在17ppm，16ppm，17ppm，和17ppm抑制f-小鼠白血病細(xì)胞(L1210/0)，小鼠乳腺癌細(xì)胞(FM3A)和人類(lèi)T淋巴細(xì)胞(Molt4/C8，CEM/0)的增殖。基于測(cè)試的所述分離物，預(yù)期可以提示其它分離物的抗腫瘤活性。
細(xì)菌和真菌對(duì)已知抗生素和抗真菌藥物的抗性，導(dǎo)致世界范圍內(nèi)對(duì)能對(duì)抗這種疾病的新藥源的研究。由于先前發(fā)現(xiàn)這種具有醫(yī)用價(jià)值的化合物的新細(xì)菌原料的成功率非常低，研究人員將注意力集中于將大的生物體作為具有新醫(yī)用價(jià)值的藥物的潛在新原料(例如Beattie1992)。本發(fā)明數(shù)據(jù)提供了清晰的和重要的跡象，即兩棲動(dòng)物是能產(chǎn)生抗菌，抗真菌，抗病毒和抗腫瘤代謝物的具有醫(yī)用價(jià)值的細(xì)菌的原料。
另外，細(xì)菌對(duì)已知藥物的抗生素抗性代表嚴(yán)重的世界范圍的健康問(wèn)題。這個(gè)研究提供了清晰的指示，即兩棲動(dòng)物的皮膚環(huán)境含有能抑制多重人類(lèi)致病細(xì)菌和真菌生長(zhǎng)的細(xì)菌菌群，所述致病細(xì)菌和真菌包括那些高抗生素抗性菌，如萬(wàn)古霉素抗性Enterococcus faecalis和二甲氧基苯青霉素抗性Staphylococcus aureus。另外，從細(xì)菌分離物DQ001D中提取的代謝物的抗病毒和抗腫瘤活性，提供了分離自?xún)蓷珓?dòng)物皮膚環(huán)境的具有醫(yī)用價(jià)值的化合物的應(yīng)用指征。根據(jù)提供的這種及其它分離物的生物活性，可以認(rèn)為并期望其它分離物也具有相似的抗病毒活性。
上述內(nèi)容包含了本發(fā)明例證的實(shí)施方案。上述實(shí)施方案和方法可以基于本領(lǐng)域技術(shù)人員能力，經(jīng)驗(yàn)，和選擇而變化。方法中以一定順序列舉的步驟，只是舉例說(shuō)明而無(wú)限制所述方法的步驟之意。上述內(nèi)容和圖表只是舉例說(shuō)明了本發(fā)明，而無(wú)限制之意，除了權(quán)利要求限制范圍內(nèi)本領(lǐng)域技術(shù)人員在不偏離本發(fā)明范圍內(nèi)，可以對(duì)本發(fā)明加以修改和變化。
權(quán)利要求
1.一種分離自至少部分通過(guò)其皮膚進(jìn)行呼吸的生物體皮膚的細(xì)菌的提取物，所述提取物抑制細(xì)菌，真菌，病毒或腫瘤的生長(zhǎng)。
2.權(quán)利要求1的提取物，其中生物體是兩棲動(dòng)物。
3.權(quán)利要求1的提取物，其中生物體選自蠑螈組成的組。
4.權(quán)利要求1的提取物，其中生物體選自蛙組成的組。
5.權(quán)利要求1的提取物，其中提取物抑制人類(lèi)致病細(xì)菌或人類(lèi)致病真菌的生長(zhǎng)。
6.權(quán)利要求1的提取物，其中提取物抑制人HIV的生長(zhǎng)。
7.權(quán)利要求6的提取物，其中人類(lèi)致病細(xì)菌選自由Enterococcus sp.，Staphylococcus sp.，Esherichia sp.和Pseudomonas sp.組成的組。
8.權(quán)利要求1的提取物，其中提取物在大約5ppm至大約250ppm之間是有效的。
9.為人類(lèi)施用治療量的權(quán)利要求1所述的提取物的方法。
10.一種選自DQ001D，PO014，PO019，PO026，PO027，AC021，AC024，PC017，PD026，EG006，EC009，EC024，和RC003的一種細(xì)菌分離物。
11.一種鑒別生物活性細(xì)菌代謝物的方法，包括在一種包含一或多種致病生物體的分析系統(tǒng)中，培養(yǎng)權(quán)利要求10所述的一種細(xì)菌分離物，并確定由該細(xì)菌分離物產(chǎn)生的代謝物對(duì)致病生物體相對(duì)于對(duì)照物生長(zhǎng)的作用。
12.一種鑒別生物活性提取物，組分或化合物的方法，包括(a)培養(yǎng)權(quán)利要求10的細(xì)菌分離物；(b)從培養(yǎng)物中提取代謝物；(c)任意地分級(jí)分離提取的代謝物；并(d)確定提取的或分級(jí)分離的代謝物在適當(dāng)?shù)姆治鱿到y(tǒng)中抑制致病生物體，腫瘤細(xì)胞，或病毒生長(zhǎng)的能力。
13.一種根據(jù)權(quán)利要求12的方法鑒別的生物活性提取物，級(jí)分或化合物。
14.一種藥物組合物，其包含一或多種權(quán)利要求13的生物活性提取物，級(jí)分或化合物，和一種適當(dāng)?shù)乃幬镙d體。
15.權(quán)利要求14的藥物組合物，其中組合物適于局部，腸道，非腸道，或靜脈內(nèi)施用給對(duì)象。
16.一種抑制個(gè)體中致病生物體生長(zhǎng)的方法，包括為該個(gè)體施用有效量的權(quán)利要求14的藥物組合物。
17.一種抑制個(gè)體中腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，包括為該個(gè)體施用有效量的權(quán)利要求14的藥物組合物。
18.一種抑制個(gè)體中病毒生長(zhǎng)的方法，包括為個(gè)體施用有效量的權(quán)利要求14的藥物組合物。
19.權(quán)利要求18的方法，其中病毒是人類(lèi)免疫缺陷病毒。
全文摘要
來(lái)自微生物的包含生物活性化合物或化合物組合的提取物，所述微生物分離自至少部分通過(guò)皮膚呼吸的產(chǎn)生粘液的生物體。發(fā)現(xiàn)分離自蠑螈和蛙皮膚的桿狀細(xì)菌產(chǎn)生具有抗病毒，抗腫瘤，抗菌或抗真菌性質(zhì)的一或多種化合物。這些化合物具有抑制人類(lèi)機(jī)會(huì)病原體以及HIV毒株和腫瘤細(xì)胞系的作用，所述機(jī)會(huì)病原體包括Candida sp.，Microsporum sp.，Staphylococcus sp.，Pseudomonas sp.，Escherichia sp.和Enterococcus sp.。
文檔編號(hào)A61P31/12GK1455673SQ02800047
公開(kāi)日2003年11月12日 申請(qǐng)日期2002年1月4日 優(yōu)先權(quán)日2001年1月5日
發(fā)明者小理查德·M·奧斯汀, 約翰·范赫梅爾, 貝內(nèi)迪克特·薩斯, 簡(jiǎn)·范德克霍夫 申請(qǐng)人:凱敏工業(yè)公司, 普萊托頓研究公司