專利名稱：紅緣擬層孔菌發(fā)酵產(chǎn)物的抗腫瘤和增強(qiáng)免疫活性的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開了紅緣擬層孔菌發(fā)酵菌絲體的抗腫瘤和免疫增強(qiáng)活性，并提供其發(fā)酵制備方法及條件，研究表明紅緣擬層孔菌發(fā)酵菌絲體對肝癌H22荷瘤具有較好的抑制作用，且能明顯的增強(qiáng)小鼠的免疫活性。該研究屬于菌物生藥發(fā)酵產(chǎn)物的制備及其在醫(yī)藥與保健品領(lǐng)域的應(yīng)用方法，并為預(yù)防及治療腫瘤藥開發(fā)提供依據(jù)。
背景技術(shù)：
癌癥，醫(yī)學(xué)術(shù)語又稱惡性腫瘤，是控制細(xì)胞生長增殖機(jī)制的失常而引起的疾病，是目前危害人類健康和生命的重要疾病之一。近些年來腫瘤的發(fā)病率在不斷上升，已經(jīng)成為人類的頭號殺手。隨著天然產(chǎn)物化學(xué)的發(fā)展，真菌作為自然界中的一大生物類群，以其藥理活性好，副作用較小，并且并可通過發(fā)酵手段大量獲得，越來越被人們所重視。多孔菌科真菌是擔(dān)子菌中的一大類群，例如中藥靈芝、豬苓、茯苓等都屬于這一類群，多孔菌類的抗腫瘤活性也多有研究報(bào)道，被稱為桑黃的菌類以及靈芝和樺褐孔菌的抗腫瘤活性都很好，因此研究真菌中抗腫瘤成分并將其開發(fā)成藥品或保健品的需求是十分迫切的。紅緣擬層孔菌Fomitopsis pinicola (Sw. :Fr. )P. Karst ,又名“紅緣層孔菌”等。隸屬于擔(dān)子菌綱(Basidiomycetes)非裙菌目(Aphyllophorales)多孔菌科(Polyporaceae),擬層孔菌屬(Fomes)。紅緣擬層孔菌是世界性分布的木腐性真菌,它大多生長在闊葉樹活立木、針葉樹、腐朽木以及倒木上，對很多種類的闊葉樹木具有很強(qiáng)的危害性。紅緣擬層孔菌具祛風(fēng)除濕，強(qiáng)心，解熱，滋補(bǔ)強(qiáng)壯，扶正培本、補(bǔ)肺益腎，安神定志、和胃健脾等作用，對癌癥、心臟病、腦溢血、貧血、糖尿病、腎炎和支氣管炎等疾病有很好的治療效果。民間用其治療礦工的“寒腿”病。在中國東北長白山地區(qū)為常見種類，在春季、夏季和秋季均會(huì)出現(xiàn)。味微苦、性平。有研究表明，紅緣擬層孔菌提取物具有抗腫瘤、抑菌、抗炎、抗氧化、抑制肥胖、保護(hù)肝臟、抑制水腫并能清除游離基、調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、治療糖尿病、增強(qiáng)人體免疫力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開了紅緣擬層孔菌發(fā)酵菌絲體的制備方法，具體如下(I)最適基礎(chǔ)培養(yǎng)基為馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，磷酸二氫鉀lg/L，硫酸鎂I. 5g/L,維生素 BI 0. 4g/L。(2)各級種子的制備用接種環(huán)將紅緣擬層孔菌母種斜面培養(yǎng)基上的菌絲接在兩個(gè)500ml搖瓶內(nèi)，每個(gè)搖瓶裝有篩選出的最佳培養(yǎng)基IOOml,置于28°C的恒溫振蕩器中，轉(zhuǎn)速130r/min，PH自然，發(fā)酵周期為80小時(shí)，作為一級液種。將這200ml —級液種分成四等份后轉(zhuǎn)接入四瓶2000ml搖瓶中，每瓶裝有200ml培養(yǎng)液，同一級液種的培養(yǎng)條件培養(yǎng)64小 時(shí)作為二級液種。(3)升罐培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)將35L篩選出的最佳培養(yǎng)基裝入50L的發(fā)酵罐中，在121°C條件下對發(fā)酵罐內(nèi)的培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌25min后將培養(yǎng)好的紅緣擬層孔菌的二級液種在火焰下轉(zhuǎn)接入50L發(fā)酵罐中，在28°C的條件下培養(yǎng)96小時(shí)，初始攪拌數(shù)為150rpm，罐壓
0.05Mpa，起始溶氧為100%，通氣量I :0. 5，PH自然。最佳發(fā)酵周期為56 64h，在此條件下菌絲體濕重達(dá)到6. 8901g/L，胞外粗多糖含量達(dá)到0. 2965g/L。本發(fā)明公開了紅緣擬層孔菌發(fā)酵菌絲體的小鼠抗腫瘤活性的研究，方法與結(jié)果如下無菌條件下，取接種7d的種鼠腹水肝癌H22細(xì)胞，用生理鹽水制成細(xì)胞個(gè)數(shù)為lX 106-5X 106/mL的細(xì)胞懸液，以每鼠0. ImL接種于小鼠左后肢腋窩皮下，隨機(jī)分組，每組10只。次日開始給藥，陽性藥組隔天腹腔注射環(huán)磷酰胺(25mg/kg),體積為0. 2mL/10g,受試藥組(100mg/kg，200mg/kg)和對照組(生理鹽水)灌胃給藥，體積為0. 2mL/10g，連續(xù)10d，第11天處死小鼠，摘取瘤塊、胸腺和脾臟，分別稱重。腫瘤抑制率=(對照組平均瘤重一給藥組平均瘤重)/對照組平均瘤重X 100%。胸腺指數(shù)為每g體重中胸腺的mg數(shù)，脾指數(shù)為每g體重中脾臟的mg數(shù)，各數(shù)值均以平均值土標(biāo)準(zhǔn)差(1±、)來表示。通過軟件spss 18.0統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)的代表性，P〈0. 05說明在統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異顯著，p〈0. 01說明在統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異極顯著。發(fā)酵產(chǎn)物組的體內(nèi)抗腫瘤作用如表I所示。除了 CTX組對小鼠移植瘤的抑制率達(dá)到80. 59%之外，發(fā)酵產(chǎn)物組對小鼠的移植瘤具有極明顯的抑制作用，但不存在量效關(guān)系，在劑量為100mg/kg/d時(shí)的抑制率達(dá)到62. 54%，同對照組相比存在顯著性差異(P < 0. 01)。表I紅緣擬層孔菌的發(fā)酵產(chǎn)物對荷瘤小鼠腫瘤的影響
權(quán)利要求
1.紅緣擬層孔菌的發(fā)酵菌絲體在制備、抑制腫瘤和增強(qiáng)免疫力藥物中的用途及其相關(guān)應(yīng)用。所述的藥物劑型是指藥劑學(xué)上所說的任何劑型，如片劑、注射劑、膠囊劑、膠漿劑、涂膜劑、乳劑、混懸劑、合劑、散劑、顆粒劑等。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述，紅緣擬層孔菌的發(fā)酵菌絲體的制備方法，其特征包括如下步驟 (1)最適基礎(chǔ)培養(yǎng)基為馬鈴薯200g/L，葡萄糖20 g/L，磷酸ニ氫鉀I 8/し硫酸鎂1.5g/L,維生素 BI O. 4 g/L。
(2)各級種子的制備用接種環(huán)將紅緣擬層孔菌母種斜面培養(yǎng)基上的菌絲接在兩個(gè)500ml搖瓶內(nèi)，姆個(gè)搖瓶裝有篩選出的最佳培養(yǎng)基100ml,置于28°C的恒溫振蕩器中，轉(zhuǎn)速130r/min, PH自然，發(fā)酵周期為80小時(shí)，作為ー級液種。將這200ml —級液種分成四等份后轉(zhuǎn)接入四瓶2000ml搖瓶中，每瓶裝有200ml培養(yǎng)液，同一級液種的培養(yǎng)條件培養(yǎng)64小時(shí)作為ニ級液種。
(3)升罐培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)將35L篩選出的最佳培養(yǎng)基裝入50L的發(fā)酵罐中，在121°C條件下對發(fā)酵罐內(nèi)的培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌25min后將培養(yǎng)好的紅緣擬層孔菌的ニ級液種在火焰下轉(zhuǎn)接入50L發(fā)酵罐中，在28°C的條件下培養(yǎng)96小時(shí)，初始攪拌數(shù)為150rpm，罐壓O. 05Mpa，起始溶氧為100%，通氣量I :0. 5，PH自然。最佳發(fā)酵周期為56飛4h，在此條件下菌絲體濕重達(dá)到6. 8901g/L，胞外粗多糖含量達(dá)到O. 2965g/L。
3.由權(quán)利要求2的制備得到紅緣擬層孔菌的發(fā)酵菌絲體具有一定的抗腫瘤活性，對H22荷瘤小鼠的抑制率達(dá)到極顯著水平(P〈0. 01)。并具有明顯的增強(qiáng)小鼠免疫水平的作用。
全文摘要
本發(fā)明公開了紅緣擬層孔菌發(fā)酵菌絲體的抗腫瘤和免疫增強(qiáng)活性，并提供其發(fā)酵制備方法及條件，研究表明紅緣擬層孔菌發(fā)酵菌絲體對肝癌H22荷瘤具有較好的抑制作用，且能明顯的增強(qiáng)小鼠的免疫活性。該研究屬于菌物生藥發(fā)酵產(chǎn)物的制備及其在醫(yī)藥與保健品領(lǐng)域的應(yīng)用方法，并為預(yù)防及治療腫瘤藥開發(fā)提供依據(jù)。
文檔編號A61K36/07GK102648924SQ20121013706
公開日2012年8月29日 申請日期2012年5月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月4日
發(fā)明者包海鷹, 孫雪 申請人:包海鷹