專利名稱：：具有抗腫瘤活性的香菇發(fā)酵口服液及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于抗腫瘤藥物領(lǐng)域，涉及來源于高級真菌經(jīng)發(fā)酵后產(chǎn)物的制劑。
背景技術(shù)：
：真菌作為藥物來源已有多年歷史，以真菌為材料所生產(chǎn)的藥劑在我國很早就應(yīng)用于臨床。香菇是世界名貴的食用兼藥用真菌之一，具有很高的營養(yǎng)及藥用價值。香菇化學(xué)成分復(fù)雜、藥理活性強(qiáng)、臨床應(yīng)用范圍廣，其抗病毒、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫功能和刺激干擾素形成等功能引起國內(nèi)外學(xué)者廣泛關(guān)注(景軍，等.中國食品衛(wèi)生雜志.2001:13(2):46-47;ChiharaG，etal.CancerRes.1970:30:2776)?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為，多糖類作為生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑(BRM)在香菇的抗腫瘤活性中起主要作用，香菇多糖的分離純化，結(jié)構(gòu)及藥理作用都得到了深入的研究，并用于臨床腫瘤的治療，其療效得到廣泛的肯定。香菇多糖是通過剌激免疫細(xì)胞成熟、分化和增殖，改善宿主機(jī)體平衡從而使免疫狀態(tài)由低下恢復(fù)到接近于正常能力，使腫瘤受抑制來實現(xiàn)其抗腫瘤的功能，但其無直接的抗腫瘤作用[RuanZheng,etaLInternationalImmunopharmacology5(2005)811-820]。除多糖外，香菇中含有大量蛋白質(zhì)、氨基酸和多種微量元素。對香菇中其他生物學(xué)活性物質(zhì)的研究水平去發(fā)掘其抗腫瘤活性的本質(zhì)卻鮮有報道。黃敏等在研究香菇C91一3菌株發(fā)酵液的抗腫瘤活性中，首次發(fā)現(xiàn)并證實了香菇的菌絲體發(fā)酵液具有體內(nèi)抑制腫瘤生長作用，同時還具有顯著的體外直接殺傷腫瘤細(xì)胞的作用，提示除了香菇多糖外還有其他重要的直接抗腫瘤活性物質(zhì)，國內(nèi)外還未見報道(黃敏，等.中國微生態(tài)學(xué)雜志.1996年8(3):38-40)。香菇菌株發(fā)酵液的抗腫瘤的制劑亦未見報道。
發(fā)明內(nèi)容發(fā)明的目的是提供一種新的具抗腫瘤活性的香菇發(fā)酵口服液及制備方法。本發(fā)明公開的具抗腫瘤活性的香菇發(fā)酵口服液是以香菇C91-3菌株為發(fā)酵原料，采用深層發(fā)酵的技術(shù)，過濾后提取加工而成。本發(fā)明的香菇發(fā)酵口服液的制備方法包括以下述步驟l.香菇發(fā)酵液的制備(1)香菇發(fā)酵液培養(yǎng)基的制備由如下重量份原料構(gòu)成的培養(yǎng)基<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>將上述物品加到1000重量份蒸餾水中，混合后放入206(TC水浴中，使其完全溶解，調(diào)節(jié)PH5.08.0，分裝至300ml三角燒瓶中，每瓶250ml，用4層紗布外蓋一層牛皮紙封口，消毒滅菌1520分鐘，冷卻后備用。(2)取710天生長良好的香菇C91-3的菌絲體，接種到上述的培養(yǎng)基中，每瓶接種菌絲體0.515g。(3)置室溫?fù)u床上培養(yǎng)，前兩天50100轉(zhuǎn)/分，第三天開始逐漸加轉(zhuǎn)速至100150轉(zhuǎn)/分。每天觀察生長情況，無菌取少量培養(yǎng)物觀察孢子數(shù)，如果孢子數(shù)達(dá)到10Sl(T/ml時停止培養(yǎng)，即可收集發(fā)酵液備用。(4)將發(fā)酵液在08'C、3，000g/min離心10min，收集上清液，然后以單層濾紙過濾上清液(08°C)除去其中懸浮的雜質(zhì)，即得到香菇發(fā)酵母液，在08'C的環(huán)境中保存。香菇發(fā)酵母液為不透明的淡褐色或土黃色的液體，pH5.08.0，其中主要含有18種氨基酸和人體所必需的8種氨基酸，其中天門冬氨酸ASP>40mg/ml，蘇氨酸THR>20mg/ml，絲氨酸SER>20mg/ml，谷氨酸GLU>100mg/ml，甘氨酸GLY>50mg/ml，丙氨酸ALA>30mg/ml，胱氨酸CYS>lmg/ml，纈氨酸VAL>30mg/ml，蛋氨酸MET>5mg/ml,異亮氨酸ILE>20mg/ml，亮氨酸LEU>40mg/ml，酪氨酸TYR>40mg/ml，苯丙氨酸PHE>20mg/ml，賴氨酸LYS>30mg/ml，氨NH3〉3mg/ml，組氨酸HIS>9mg/ml，精氨酸ARG>20mg/ml，脯氨酸PRO>40mg/ml，色氨酸TRP>lmg/ml;多糖>50mg/ml。2.香菇發(fā)酵口服液的制備將上述香菇發(fā)酵母液與蒸餾水按照1:38的比例混合，同時加入310%的白糖或木糖醇即制成口服液，利用現(xiàn)有的技術(shù)分裝入瓶，消毒滅菌后于一208'C冰箱保存。該口服液為土黃色或淡褐色的不透明液體，有特定的香味，口味甜，其中主要含有18種氨基酸和人體所必需的8種氨基酸及多糖。本發(fā)明的實驗證明在體外抗腫瘤試驗中，香菇C91-3發(fā)酵制劑對H22(小鼠腹水型肝癌細(xì)胞株)、U14(小鼠腹水型宮頸癌細(xì)胞株)及S180(小鼠腹水型肉瘤細(xì)胞株)的72小時后的抑瘤率分別為71.11%、72.85%、76.81%，表明該菌株發(fā)酵液具有有較強(qiáng)的直接殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。在體內(nèi)抗腫瘤試驗中，香菇C91-3發(fā)酵制劑具有治療腫瘤作用。對H22荷瘤鼠治愈率35%，對S180荷瘤鼠治愈率為40%。實驗組即使死亡鼠的存活期也比對照組延長，具有明顯抑制腫瘤的作用。另外發(fā)現(xiàn)該發(fā)酵液對革蘭氏陰性菌有明顯抑制作用，但對革蘭氏陽性菌無效。動物毒性實驗急性毒性實驗和長期毒性實驗證明無毒副作用，安全可靠。具體實施例方式下面結(jié)合實施例來對本發(fā)明進(jìn)一步說明。實施例l:香菇發(fā)酵液的制備(1)香菇發(fā)酵液培養(yǎng)基的制備<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>將上述物品加到1000ml蒸餾水中，混合后放入5(TC水中水浴，使其完全溶解，調(diào)節(jié)PH7.5，分裝至300ml三角燒瓶中，每瓶250ml，用4層紗布外蓋一層牛皮紙封口，消毒滅菌15分鐘，冷卻后備用。(2)取第7天生長良好的香菇C91-3的菌絲體，接種到上述的培養(yǎng)基中，每瓶接種菌絲體lg。(3)置室溫?fù)u床上培養(yǎng)，前兩天75轉(zhuǎn)/分，第三天開始逐漸加轉(zhuǎn)速至100轉(zhuǎn)/分。每天觀察生長情況，無菌取少量培養(yǎng)物觀察孢子數(shù)，如果孢子數(shù)達(dá)到10Vml時停止培養(yǎng)，收集發(fā)酵液備用。(4)將發(fā)酵液在4。C、3，000g/min離心10min，收集上清液，然后以單層濾紙過濾上清液(4'C)除去其中懸浮的雜質(zhì)，并將所得的上清液放入4。C的環(huán)境中保存。實施例2:香菇發(fā)酵口服液的制備(1)將上述香菇發(fā)酵母液與蒸餾水按照1:5的比例混合，同時加入4%的木糖醇即制成口服液，利用現(xiàn)有的技術(shù)分裝入瓶，消毒滅菌后并于4'C冰箱保存。(2)將上述香菇發(fā)酵母液與蒸餾水按照1:6的比例混合，同時加入6%的木糖醇即制成口服液，利用現(xiàn)有的技術(shù)分裝入瓶，消毒滅菌后并于4'C冰箱保存。(3)將上述香菇發(fā)酵母液與蒸餾水按照1:7的比例混合，同時加入8%的木糖醇即制成口服液，利用現(xiàn)有的技術(shù)分裝入瓶，消毒滅菌后并于4"C冰箱保存。實施例3:香菇發(fā)酵制劑體外抗腫瘤活性試驗(1)細(xì)胞株的選用H22(小鼠腹水型肝癌細(xì)胞株)、U14(小鼠腹水型宮頸癌細(xì)胞株)、S180(小鼠腹水型肉瘤細(xì)胞株)。(2)MTT法測定香燕發(fā)酵制劑體外抗腫瘤的抑瘤率選各種瘤細(xì)胞對數(shù)生長期的細(xì)胞調(diào)整濃度至lxl()S個/ml，并接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔100W。對照組沒孔加入IOOW無菌生理鹽水，實驗組加入香菇發(fā)酵口服液100W。每組設(shè)3個復(fù)孔，置于37°C，5XC02孵箱中培養(yǎng)24、48和72小時后，加入MTT(1Mg/ml)IOOW，再繼續(xù)培養(yǎng)4小時，離心棄上清，然后每孔加100ulDMSO，震蕩混勻，使結(jié)晶充分溶解，用酶標(biāo)儀測定各孔吸光度值，(測定波長595nm，參考波長655nm)，并按下面公式計算抑瘤率。抑瘤率=1-實驗組OD值、xl00%.對照組OD值^香菇發(fā)酵液體外抗腫瘤活性試驗數(shù)據(jù)如表-1所示。實施例4:香菇發(fā)酵口服液體內(nèi)抗腫瘤活性試驗(1)細(xì)胞株的選用本試驗H22(小鼠腹水型肝癌細(xì)胞株)、U14(小鼠腹水型宮頸癌細(xì)胞株)、S180(小鼠腹水型肉瘤細(xì)胞株)。(2)模型動物的選用t純系615小鼠、Balb/c小鼠、昆明系小鼠若干只，體重2022g，由本校實驗動物中心提供。(3)細(xì)胞系的動物模型的制備將瘤細(xì)胞配制成1乂106細(xì)胞懸液，取該細(xì)胞懸液以0.5ml/只注入小鼠腹腔。次日隨機(jī)分成對照組、試驗組。對照組每只小鼠灌胃lml生理鹽水，試驗組每只小鼠灌胃上述發(fā)酵制劑lml。連續(xù)灌胃5天，觀察小鼠存活期，計算存活率和生命延長率。香菇發(fā)酵液體外抗腫瘤活性試驗數(shù)據(jù)如表-2所示。實施例5:動物毒性實驗(1)急性毒性實驗取昆明小鼠40只(雌雄各半)，體重2022g，于24小時內(nèi)灌胃3次，使累計的服用量為上述用藥的225倍，連續(xù)觀察小鼠14天，無死亡現(xiàn)象及不良反應(yīng)，說明此劑無毒副作用。(2)長期毒性實驗取體重適宜的大鼠40只(雌雄各半)，隨機(jī)分為兩組，一組為香菇發(fā)酵口服液實驗組，以上述實驗劑量的100倍連續(xù)灌胃60天；另一組為加等量蒸餾水對照組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在此期間兩組動物均無死亡及不良反應(yīng)，兩組動物食欲、大小便及體重在統(tǒng)計學(xué)上均無顯著性差異(p>0.05);血液白細(xì)胞、紅細(xì)胞及血小板等血常規(guī)指標(biāo)兩組間無顯著性差異(p>0.05);兩組動物臟器解剖病理觀察均無異常病理現(xiàn)象，說明此劑長期服用安全可靠。整個實驗結(jié)果表明，香菇發(fā)酵口服液對腫瘤有直接的殺傷作用(也是國內(nèi)外首次發(fā)現(xiàn))，并具有明顯的治療腫瘤作用；并且無毒副作用，安全可靠。表1香菇發(fā)酵制劑體外抗各種瘤細(xì)胞結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>存活率觀察60天以上未長腫瘤。權(quán)利要求1.一種具有抗腫瘤活性的香菇發(fā)酵口服液，是以香菇C91-3菌株為發(fā)酵原料，經(jīng)深層發(fā)酵、過濾后提取加工而成，為淡褐色或土黃色的透明液體，水溶液的pH5.0～8.0；該口服液為土黃色或淡褐色的不透明液體，有特定的香味，口味甜，其中主要含有18種氨基酸和人體所必需的8種氨基酸及多糖，含有發(fā)酵母液15～30％、甜味劑5～10％。2.如權(quán)利要求1所述具有抗腫瘤活性的香菇發(fā)酵口服液的制備方法，其特征在于工藝步驟為(1)香菇發(fā)酵液培養(yǎng)基的制備由如下重量份原料構(gòu)成的培養(yǎng)基新鮮啤酒酵母8庶糖6全脂奶粉1蛋白胨1磷酸二氫鉀0.3維生素B10.01維生素B20.01將上述物品加到1000重量份蒸餾水中，混合后放入5(TC水中水浴，使其完全溶解，調(diào)節(jié)PH7.5，分裝至300ml三角燒瓶中，每瓶250ml，用4層紗布外蓋一層牛皮紙封口，消毒滅菌15分鐘，冷卻后備用；(2)取第7天生長良好的香菇C91-3的菌絲體，接種到上述的培養(yǎng)基中，每瓶接種菌絲體lg;(3)置室溫?fù)u床上培養(yǎng)，前兩天75轉(zhuǎn)/分，第三天開始逐漸加轉(zhuǎn)速至100轉(zhuǎn)/分。每天觀察生長情況，無菌取少量培養(yǎng)物觀察孢子數(shù)，如果孢子數(shù)達(dá)到10々ml時停止培養(yǎng)，收集發(fā)酵液備用；(4)將發(fā)酵液在4。C、3,000g/min離心10min，收集上清液，然后以單層濾紙4'C下過濾上清液除去其中懸浮的雜質(zhì)，即得香恭發(fā)酵母液，放入4t:的環(huán)境中保存；(5)按發(fā)酵母液1530%、甜味劑510%、水為余量的比例，在配料容器中混合均勻而成?！∪恼哂锌鼓[瘤活性的香菇發(fā)酵口服液，是以葡萄糖、新鮮啤酒酵母、蔗糖、全脂奶粉、蛋白胨、磷酸二氫鉀、維生素B1和B2加到蒸餾水中制成培養(yǎng)基，以香菇C91-3的菌絲體接種，經(jīng)深層發(fā)酵、4℃離心、再過濾，即得香菇發(fā)酵母液，加入甜味劑而成。實驗證明體外抗腫瘤試驗中對H22(小鼠腹水型肝癌細(xì)胞株)、U14(小鼠腹水型宮頸癌細(xì)胞株)及S180(小鼠腹水型肉瘤細(xì)胞株)的72h后的抑瘤率分別為71.11％、72.85％、76.81％，表明具有有較強(qiáng)的直接殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。在體內(nèi)抗腫瘤試驗中，對H22荷瘤鼠治愈率35％，對S180荷瘤鼠治愈率為40％。即使死亡鼠的存活期也比對照組延長，具有明顯抑制腫瘤的作用。文檔編號A61K36/06GK101167760SQ20071015791公開日2008年4月30日申請日期2007年11月5日優(yōu)先權(quán)日2007年11月5日發(fā)明者寧安紅,婧曹,鐘民濤,敏黃申請人:大連醫(yī)科大學(xué)