專利名稱：包含一種多糖抗原－載體蛋白共軛物和游離載體蛋白的疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種復(fù)合疫苗，該疫苗包括一種與載體蛋白相連接的共軛多糖抗原，其中載體蛋白在該疫苗組分中也可作為一種游離抗原。特別指出的是，本發(fā)明的疫苗指的是一種多價(jià)疫苗，即一種緩解或治療多種疾病的疫苗。本發(fā)明也涉及到這種疫苗的生產(chǎn)及其在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用。
現(xiàn)有技術(shù)中已有一些使用多糖的疫苗，例如一種預(yù)防流感嗜血桿菌b(Hib)感染的疫苗，其基本組成是與載體蛋白共軛連結(jié)的莢膜多糖。載體蛋白主要為白喉或破傷風(fēng)類毒素。人們已經(jīng)提出一種抗肺炎雙球菌的疫苗其基本組成是與載體蛋白(如破傷風(fēng)或白喉類毒素)共軛的莢膜多糖。這種共軛疫苗抗原的實(shí)例已在US 4 365 170、US4 673 574、EP 208 375、EP 477508和EP 161 188中公開。
這種共軛疫苗和其它抗原或疫苗需要同時(shí)給藥，這就是多重注射。多重注射帶來(lái)的問(wèn)題包括給藥程序比較復(fù)雜和注射總劑量大。當(dāng)為嬰兒注射疫苗的時(shí)候，這尤其是一個(gè)嚴(yán)重的問(wèn)題。
因此有人提出合成一種復(fù)合疫苗。眾所周知的一種復(fù)合疫苗便是預(yù)防白喉、破傷風(fēng)和B.百日咳菌感染的復(fù)合疫苗。這種疫苗包括一種百日咳組分(或者是已經(jīng)殺死的全細(xì)胞B.百日咳或者是無(wú)細(xì)胞百日咳，其典型的組成是至少3種抗原-PT、FHA和69kDa)和白喉類毒素以及破傷風(fēng)毒素。這種疫苗一般稱作DTPw(全細(xì)胞)或DTPa(無(wú)細(xì)胞)。
在這種復(fù)合疫苗中需要再加入多糖共軛疫苗。然而我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)如將各組分進(jìn)行簡(jiǎn)單混合會(huì)降低多糖組分的抗體效價(jià)，也會(huì)降低對(duì)這種抗體效價(jià)的保持能力。因此，用TT-PRP共軛物與DTPa復(fù)合的復(fù)合疫苗進(jìn)行免疫注射的嬰兒與用TT-PRP共軛物和DTPa于不同部位發(fā)生伴隨免疫的嬰兒相比較，前者共軛PRP Hib多糖對(duì)去毒破傷風(fēng)類毒素(TT)的致免疫性要降低。
在單價(jià)疫苗的情況下，也就是說(shuō)，當(dāng)疫苗只包括一種單一的與載體蛋白共軛的多糖時(shí)，共軛物中蛋白含量愈高，抗體對(duì)多糖的反應(yīng)就愈強(qiáng)。一般認(rèn)為這是因?yàn)門細(xì)胞依賴性多糖的特異性抗體反應(yīng)的產(chǎn)生需要多糖與載體蛋白共價(jià)偶聯(lián)。該載體蛋白需要一定的濃度(即PS相對(duì)于蛋白的比例)以便使TH細(xì)胞對(duì)載體容易產(chǎn)生反應(yīng)，并且使得這種TH反應(yīng)可以識(shí)別PS特異性B細(xì)胞克隆表達(dá)的肽鏈，它是由共價(jià)偶聯(lián)的載體蛋白衍生而來(lái)的。
現(xiàn)有技術(shù)中的單價(jià)疫苗，其多糖與載體蛋白的比例一般為1∶3(重量∶重量)。
令人驚奇的是，與單價(jià)疫苗的情況完全不同，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)當(dāng)多糖共軛物組分是多價(jià)疫苗(含游離形式的載體蛋白)的一部分時(shí)，該多糖組分的致免疫性可通過(guò)降低共軛抗原中的蛋白含量來(lái)提高。
因此，本發(fā)明提供了一種復(fù)合疫苗，包括一種與載體蛋白共軛的多糖抗原，并且其中載體蛋白也可作為游離抗原存在。其特征是多糖與載體蛋白的比例大約1∶0.3到1∶2，優(yōu)選1∶0.5到1∶1.5，更具代表性的是1∶1。
多糖共軛物可通過(guò)一些已知的偶聯(lián)技術(shù)來(lái)制備。例如，多糖可以通過(guò)一個(gè)硫醚鍵來(lái)偶聯(lián)。該共軛方法依賴于多糖與1-氰基-4-二甲基氨吡啶鎓四氟硼酸鹽(CDAP)相作用生成氰酸酯的活性。該活化的多糖因此而可以直接或通過(guò)一個(gè)間隔基與載體蛋白上的氨基進(jìn)行偶聯(lián)。優(yōu)選氰酸酯與己烷二胺偶聯(lián)并優(yōu)選用氨基衍生的多糖與載體蛋白共軛(運(yùn)用與硫醚鍵的形成有關(guān)的多重絡(luò)合化學(xué)方法)。這種共軛物在Uniformed ServicesUniversity的PCT申請(qǐng)公開文本W(wǎng)O93/15760中作了描述。
這種共軛物也可以通過(guò)直接還原性胺化法來(lái)制備。如US4365170(Jennings)和4673574(Anderson)所描述的那樣。其它方法在EP-O-161-188,EP-208375和EP-0-477508中有描述。
另一種方法是用已二酸酰肼(ADH)衍生的多糖經(jīng)溴化氰活化后與載體蛋白在碳化二亞胺縮合作用下進(jìn)行偶聯(lián)(Chuc.等，《感染.免疫》(Infect.Immunity),1983 245-256)。
載體蛋白一般優(yōu)選為破傷風(fēng)(Tetanus)或白喉(Diphtheria)衍生的抗原，其中優(yōu)選破傷風(fēng)類毒素或白喉類毒素。該載體蛋白也可以是由博代桿菌(Bordetella)衍生而來(lái)的。該抗原典型的是一些白喉或破傷風(fēng)毒素的無(wú)毒衍生物。
本發(fā)明中的疫苗組成最好含有一種合適的佐劑。
優(yōu)選的佐劑為MPLC(3-去乙酰化的單磷酰類酯A，也稱作3D-MPL)。從GB2 220 211(Ribi)知道3D-MPL是3-去氧乙?；瘑瘟柞ｎ愼和4、5或6乙?；湹囊环N混合物，它是Ribi免疫化學(xué)公司(Montana)制造的。MPL的優(yōu)選結(jié)構(gòu)公布在國(guó)際專利申請(qǐng)92/116556中。
本發(fā)明可以用的另一種佐劑是QS21。QS21是皂素經(jīng)HPLC提純的無(wú)毒部分。該皂素是從南美的一種樹(Quillaja saponaria molina)(皂樹屬肥皂草莫林拿)的樹皮中得到的。
QS21和3D-MPL復(fù)合可以生成功效增加的疫苗制劑，這在國(guó)際專專利申請(qǐng)WO 94/00153中有描述。
本發(fā)明的Hib疫苗一般不需要任何特異性載體，而且可以制成水溶液或其它藥用性緩沖液。在某些情況下，本發(fā)明的全疫苗可以呈現(xiàn)為油水乳劑或其它合適的形式，例如脂質(zhì)體、微球或囊狀抗原顆粒。
該疫苗制劑可以包含其它一些抗原。本發(fā)明中的疫苗使用了現(xiàn)有技術(shù)中已知的抗原或抗原組合物，他們來(lái)自HIV-1(如gp120或gp160)，人或動(dòng)物的皰疹病毒如gD或其衍生物或者早期速發(fā)蛋白如來(lái)自HSV1或HSV2的ICP27，巨細(xì)胞病毒(特指人)(如gB或其衍生物)，水痘帶狀皰疹病毒(如gpⅠ,Ⅱ或Ⅲ)；或者來(lái)自肝炎病毒例如肝炎B(Hepatitis B)病毒，如肝炎B表面抗原或其衍生物，肝炎A病毒，肝炎C和肝炎E病毒；或者來(lái)自其它病毒性病原體(如呼吸道合胞體病毒、人的乳頭瘤病毒或流感病毒，或脊髓灰質(zhì)炎病毒，如滅活的脊髓灰質(zhì)炎病毒(IPV))；或者來(lái)自細(xì)菌病原體如白喉(D)、破傷風(fēng)(T)、沙門菌、奈瑟菌(尤其是腦膜炎球菌A、B或C)、疏螺旋體(如OspA或Ospb或其衍生物)或衣原體，或博代桿菌(Bordetella)(如P69、PT和FHA來(lái)自B百日咳桿菌(P))；或者來(lái)自寄生蟲(如瘧原蟲或弓形蟲)。
本發(fā)明中特別優(yōu)選的疫苗包括DTPa Hib、DTPa Hib HepB和DTPaHib HepB IPV。
令人感興趣的是，本發(fā)明的復(fù)合疫苗中的Hib組份在給藥前可以和其它抗原一起制成試劑。因此，冷凍干燥的Hib組份可以在使用之前進(jìn)行重新組合，即與其它抗原的水溶液制劑相混合。
上述復(fù)合疫苗可以包含一種抗肝炎A的組份也可不包含。
在這些疫苗中所使用的合適組份已經(jīng)商品化，而詳細(xì)資料可以從世界衛(wèi)生組織得到。例如IPV組份可以是索爾克(Salk)滅活的脊髓灰質(zhì)炎疫苗。白喉、破傷風(fēng)和百日咳疫苗可以包括一個(gè)無(wú)細(xì)胞的產(chǎn)品，如InfanxixDTPa(Smithkline Beecham生物公司)?？垢窝譇的組份優(yōu)選是已知的“Havrix”產(chǎn)品(Smithkline Beecham生物公司)，這是已死的減毒疫苗，由HAV中的HM-175菌珠衍生而來(lái)(參閱“Inactivated Candidate Vaccinesfor Hepatitis A”F.E Andre,A Hepbum和E.D’Hondt，《醫(yī)學(xué)病毒進(jìn)展》，卷37，頁(yè)72-95(1990))，并參閱該產(chǎn)品的專題文章《Havrix》，由SmithklineBeecham生物公司發(fā)表(1991)。肝炎B的組份可以包括和“Engerix-B”一樣的“S”抗原。
本發(fā)明中的流感嗜血桿菌B疫苗或復(fù)合疫苗是較好的兒科用類疫苗。
疫苗的制備一般在《疫苗設(shè)計(jì)-底料和佐劑》(Michael F Powell和MarkNewman編，Plenum出版)中有描述。脂質(zhì)體的包囊方法由Fullerton在美國(guó)專利4,235,877中有描述。Likhite在美國(guó)專利4,372,945和Armor等在美國(guó)專利4,474,757中公布了蛋白質(zhì)共軛成大分子的作用。
每一份疫苗劑量中抗原的量選定為可以產(chǎn)生免疫保護(hù)反應(yīng)同時(shí)對(duì)一般的接種疫苗者無(wú)嚴(yán)重的不良反應(yīng)或副作用的劑量。該劑量將隨著所使用的特定免疫原的不同而改變。一般來(lái)說(shuō)，預(yù)期每一份劑量包含1-1000μg總的免疫原，優(yōu)選2-100μg，最優(yōu)選4-40μg。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)研究法即對(duì)接受者進(jìn)行抗體效價(jià)和其它反應(yīng)的觀測(cè)來(lái)確定某一特定疫苗的最佳劑量。在第一次接種疫苗之后，大約每4星期間隔再進(jìn)行1～2次的增補(bǔ)劑量的注射。
下述實(shí)施例將對(duì)本發(fā)明進(jìn)行闡述。實(shí)施例實(shí)施例1a)包含DTPa-Hib PRP-TT和HBsAg的疫苗Hib TT共軛物的制備物料和方法物料Hib PRP是從滅活的細(xì)胞培養(yǎng)液中提取和純化的。該提純物的殘余蛋白、核酸、類毒素、結(jié)構(gòu)糖和分子的大小分布這些項(xiàng)目均符合WHO和US說(shuō)明書提出的要求。
Behringwerke生產(chǎn)的破傷風(fēng)類毒素也符合WHO的要求。這種物料是通過(guò)酸性pH沉淀和凝膠過(guò)濾色譜法進(jìn)一步提純從而分離得到TT單體(150KDa)。
活化和偶聯(lián)化學(xué)20mg的Hib PRP溶于4ml,2M NaCl中。
150mcl的CDAP(1-氰基-4-二甲基氨-吡啶鎓四氟硼酸鹽)加到多糖溶液(來(lái)自100mg/ml培養(yǎng)液，在乙腈中)里。一分鐘后，加入300mcl,0.2M的三乙基胺。多糖活化過(guò)程在0℃,PH=9.5-10條件下進(jìn)行2分鐘。
加入20mg或40mg,濃度為15mg/ml的破傷風(fēng)類毒素(PRP/蛋白起始比例為1/1或1/2)，然后在25℃進(jìn)行1小時(shí)的偶聯(lián)反應(yīng)。加入3ml,1M甘氨酸溶液(PH=5.0)在25℃進(jìn)行1小時(shí)淬火反應(yīng)，然后在4℃過(guò)夜。
共軛物通過(guò)凝膠過(guò)濾色譜法(使用0.2M NaCl平衡的Sephacrgl HR500凝膠過(guò)濾柱)進(jìn)行提純。測(cè)定洗脫下來(lái)的糖類和蛋白含量。共軛物沉淀后進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾。測(cè)出該共軛物制劑中PRP/蛋白比例和游離PS的量。實(shí)施例1b)DTP Hib PEP TT HRsAg復(fù)合疫苗制劑含(或不含)肝炎B疫苗的DTPa制劑(包括白喉類毒素，破傷風(fēng)類毒素，百日咳類毒素，百日咳毒素和FHA)在現(xiàn)有技術(shù)中是已知的。如國(guó)際專利申請(qǐng)WO 93/24148中公布的那種疫苗。將實(shí)施例1中所說(shuō)的共軛物加到該疫苗中進(jìn)行免疫研究，并在注射之前先混合。
本研究進(jìn)行以下幾個(gè)步驟·調(diào)節(jié)苯氧基-乙醇(制菌劑)濃度為0.5mg/ml·調(diào)節(jié)PH值為6.1+0.1·調(diào)節(jié)PRP濃度至少到100mcg/ml。
·DTPaHBV(0.5ml)加到0.1mlPRP-CDAP-TT溶液中。
每一劑量的疫苗最終組成為·PRP’P10mcg·D 25Lf·T 10Lf·PT25mcg·FHA 25mcg·69K 8mcg
·Hep B 10mcg·Al(OH)3Behring0.35mg·Al(OH)3Superpos 0.15mg·AlPO4Superpos 0.20mg·NaCl150mM·2φEt-OH3mg(→5mg/ml)·pH 6.1±0.1·Vol 0.6ml實(shí)施例2免疫原性對(duì)年輕的OFA大鼠進(jìn)行第一次和第二次接種疫苗之后，比較流感嗜血桿菌型B(運(yùn)用兩種不同的偶聯(lián)化學(xué)技術(shù)，使得多糖與蛋白的比例(重量∶重量)為1∶3,1∶2和1∶1)的免疫原性。
如果共軛抗原不是單獨(dú)被使用，而是與DTPa肝炎B復(fù)合之后再被使用的話，那么在第一次疫苗接種后的第28天，所觀測(cè)的數(shù)據(jù)則明確顯示了抗PS抗體效價(jià)隨著共軛疫苗中的蛋白含量的降低而提高。當(dāng)共軛疫苗單獨(dú)使用時(shí)，所觀測(cè)到的情況與上述顯然不同，其中較低的PS-TT比例(即載體蛋白相對(duì)較多)導(dǎo)至對(duì)該多糖較好的抗體反應(yīng)，見(jiàn)42天組1到組3中的抗PS抗體效價(jià)隨著TT量的降低依次為25,18和5μg/ml，而當(dāng)共軛物與DTPa Hep B疫苗聯(lián)合使用時(shí)，對(duì)應(yīng)于TT的相同含量，組1到組3的抗PS效價(jià)則依次為3.4,8和19μg/ml。實(shí)施例3TT/PS比例對(duì)于Hib和DTPa相溶性的影響10只不同組的大鼠(OFA,5周令，雌性)被免疫注射2次，24天一間隔，皮下注射，各種TT-PRP疫苗分別用兩種不同的劑量0.5γPS/rat(表2)或0.05γPS/rat(表3)。Hibool疫苗加入鹽水或1份劑量的DTPa(批號(hào)119)后濃度為10γPS/ml。液體疫苗用鹽水或人用的一份劑量的DTPa稀釋到濃度為10γPS/ml。然后該疫苗用鹽水進(jìn)一步稀釋，使?jié)舛葹?.5γPS/ml或0.25γPS/ml。稀釋之后的一小時(shí)以內(nèi)，對(duì)每一大鼠注射200ul疫苗。
第24天和第28天，對(duì)動(dòng)物進(jìn)行取血，用每個(gè)血清的ELISA測(cè)得抗-PRP LgG Abs，單位為γ/ml。每一組的GMT便能計(jì)算而得。實(shí)施例4比較DTPa和DTPa肝炎B疫苗，混有低比例或“正?！北壤腜RPTT的免疫原性。
10只不同組的老鼠(OFA，1周令)進(jìn)行3次(SC)免疫注射，兩周一間隔，注射前1小時(shí)，0.5μg的PS與1人劑量的二十分之一的DTPa或DTPaHepB相復(fù)合。三次注射之后的兩個(gè)星期，對(duì)動(dòng)物進(jìn)行取血，通過(guò)ELISA測(cè)得抗百日咳類毒素(PT)、FHA、百日咳毒素(69k)、白喉類毒素(D)、破傷風(fēng)類毒素(T)以及肝炎B表面抗原(HBS)的抗體。表4顯示了中等稀釋度時(shí)的抗體效價(jià)。
本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果和實(shí)施例3的結(jié)果證明在復(fù)合疫苗中，如果共軛物中的蛋白量降低的話，則Hib的反應(yīng)將加強(qiáng)。此外，在該疫苗中的其它組分對(duì)免疫反應(yīng)不產(chǎn)生嚴(yán)重的干擾。
表1
表權(quán)利要求
1．一種復(fù)合疫苗，含有一種與載體蛋白共軛的多糖抗原，其中載體蛋白也可作為游離抗原存在，其特征是該共軛物中的多糖與載體蛋白的比例為1∶0.3到1∶2。
2．權(quán)利要求1中的復(fù)合疫苗，其中載體蛋白是白喉(Diphtheria)或破傷風(fēng)(Tetanus)抗原。
3．權(quán)利要求1或2中的復(fù)合疫苗，其中多糖與載體蛋白的比例為1∶0.5到1∶1.5。
4．權(quán)利要求1中的復(fù)合疫苗，其中多糖組分由流感嗜血桿菌b(Hib)(Haemophilus influenzae b)或肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumonia)，或腦膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitis)A、B或C衍生而來(lái)。
5．權(quán)利要求4中的復(fù)合疫苗，還含有抗白喉、破傷風(fēng)和百日咳(Pertussis)感染的抗原。
6．權(quán)利要求4或5中的復(fù)合疫苗，還含有一種抗肝炎B(hepatitis B)病毒的抗原。
7．權(quán)利要求4到6中任一項(xiàng)的復(fù)合疫苗，還含有一種抗肝炎A病毒的抗原。
8．權(quán)利要求4到7中任一項(xiàng)的復(fù)合疫苗，還含有一種對(duì)脊髓灰質(zhì)炎(polio)有免疫性的抗原。
9．權(quán)利要求4到8中任一項(xiàng)的復(fù)合疫苗，包括一種對(duì)肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌b有免疫性的抗原。
10．權(quán)利要求4到9中任一項(xiàng)的復(fù)合疫苗，還包括一種合適的佐劑。
11．上述權(quán)利要求所要求的在醫(yī)學(xué)上使用的疫苗。
12．一種對(duì)易感染傳染性疾病或已經(jīng)患上傳染性疾病的人進(jìn)行治療的方法，包括使用有效量的權(quán)利要求1-10所要求保護(hù)的一種疫苗。
13．一種與載體蛋白共軛的多糖抗原，其中多糖與載體蛋白的比例從1∶0.3到1∶2。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種復(fù)合疫苗,它們包括一種與載體蛋白相連接的共軛多糖抗原,其中載體蛋白在該疫苗組合物中也可作為一種游離抗原存在,其特征是多糖與蛋白的比例為1∶0.3到1∶2。特別是本發(fā)明的該疫苗組合物指的是一種多價(jià)疫苗,即一種改善或治療多種疾病的疫苗。本發(fā)明也涉這種疫苗在醫(yī)學(xué)上的生產(chǎn)與應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K39/00GK1215337SQ96194891
公開日1999年4月28日 申請(qǐng)日期1996年6月4日 優(yōu)先權(quán)日1995年6月23日
發(fā)明者蒙塞夫·M·斯萊奧伊, 皮埃爾·豪澤 申請(qǐng)人:史密斯克萊·比奇曼生物公司