專利名稱：一種豬戊型肝炎病毒抗原表位及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種肝炎病毒抗原表位，尤其涉及一種豬戊型肝炎病毒抗原表位及其在體外檢測和疫苗中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
戊型肝炎病毒Ofepatitis E virus, HEV)是一種經(jīng)糞、口途徑傳播的非甲-非乙型肝炎病毒。該病毒會在人群引起暴發(fā)流行，主要侵害青壯年，對孕婦可造成20%的病死率。1986-1988年我國新疆南部地區(qū)因飲水污染導(dǎo)致戊型肝炎流行，共計(jì)發(fā)病119280例，死亡707例，是迄今世界上最大的一次戊型肝炎流行。近年來戊型肝炎發(fā)病率有逐年增加的趨勢，據(jù)我國衛(wèi)生部統(tǒng)計(jì)，戊肝發(fā)病率2003年比2002年上升40. 4%。因此，戊肝防控已列入各級公共衛(wèi)生機(jī)構(gòu)的工作日程。近年來研究發(fā)現(xiàn)，HEV可以感染豬、牛、羊、鼠和雞等動物。其中，病毒在豬和鼠的抗體陽性率高于50%，由此推測動物是HEV傳播的重要中間宿主。基因序列分析表明，從動物體內(nèi)分離的戊型肝炎病毒與人的HEV有極高的基因同源性，并且已有人食用野豬肉和鹿肉而感染戊肝的報(bào)道，證明戊肝是一種可以通過食物傳播的人畜共患疫病。葛勝祥等(中國人獸共患病雜志，2003，19 ), 108-109)對我國20個省、市和自治區(qū)的120個養(yǎng)豬場的 8626只成年豬進(jìn)行了 HEV血清學(xué)調(diào)查，結(jié)果表明平均感染陽性率為83. 4%，其中最高省份為內(nèi)蒙古(100%)，最低為湖北(68%)。鑒于我國HEV居高不下的感染率，對豬戊肝病毒的表位進(jìn)行研究，建立特異、有效的豬戊肝檢測方法，研制安全、有效的豬戊肝疫苗，了解的流行發(fā)病規(guī)律，阻斷該病由豬向人的傳播，對于保證人民的健康安全意義重大。國內(nèi)第二軍醫(yī)大學(xué)的學(xué)者 Qi (Journal of Virological Methods 1995，5，55-66) 分析了人HEV假定的開放閱讀框0RF1、0RF2、0RF3的蛋白順序，合成了 7個肽，發(fā)現(xiàn)其中3 個肽具有免疫原性，可用作HEV的診斷。美國學(xué)者M(jìn)eng(Virology 2001,288,203-211)從人HEV 0RF2中擴(kuò)增出不同大小的交互重疊的重組肽段，發(fā)現(xiàn)其中的片段之一——pB166 為中和表位，可用作HEV的疫苗開發(fā)及診斷。日本學(xué)者Niikura(Virology 2002,293, 273-280)報(bào)道了人HEV-VLP的C末端11個氨基酸肽段具有免疫原性，能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體。廈門大學(xué)的學(xué)者^iang(Vaccine 2005,23,2881-2892)發(fā)現(xiàn)人HEV外殼蛋白394-606 位肽段以二聚體的形式可與HEV人血清強(qiáng)烈反應(yīng)，用作疫苗可抗獼猴的實(shí)驗(yàn)感染。印度學(xué)者 Deshmukh (Vaccine 2007，25，4350-4360)報(bào)道表達(dá)的完整人 HEV 0RF2 蛋白和 0RF2 內(nèi)部 458-607位肽段具有免疫原性，起到中和作用。可用作疫苗的開發(fā)。但是，到目前為止，還沒有豬HEV開放閱讀框0RF1、0RF2和0RF3相關(guān)的蛋白表位的系統(tǒng)篩選報(bào)道。雖然豬戊肝研究越來越得到全世界的重視，但目前國內(nèi)外對豬戊肝的研究多限于局部區(qū)域的流行病學(xué)調(diào)查和一些簡單的動物感染試驗(yàn)。在豬戊肝防控研究方面尚有以下有待回答問題和技術(shù)瓶頸。目前還沒有豬戊肝病毒的表位研究報(bào)道，市場上用于豬戊肝檢測的試劑盒是用于人戊肝檢測的試劑盒。雖然豬戊肝病毒與人戊肝病毒序列同源性很高，但是他們之間畢竟還是有些差別，用人的戊肝病毒表位來檢測豬戊肝病毒導(dǎo)致檢測的特異性 (Speciality)不強(qiáng)，不能特異反映出豬戊肝流行規(guī)律。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的在于提供一種豬戊型肝炎病毒抗原表位。本發(fā)明的另一個目的在于提供一種用于豬戊型肝炎體外檢測的多肽。本發(fā)明的又一個目的在于提供一種用于制備豬戊型肝疫苗的多肽。本發(fā)明利用計(jì)算機(jī)軟件從豬戊型肝炎病毒全基因組開放閱讀框0RF1、0RF2和 0RF3的對應(yīng)蛋白中篩選識別表位。表位識別的主要依據(jù)是蛋白質(zhì)或多肽氨基酸序列的親水性、表面度、柔韌度、Chou-Fasman的螺旋、片狀和轉(zhuǎn)角、Robson-Garnier的二級結(jié)構(gòu)及C-和 N-末端來預(yù)測抗原綜合數(shù)據(jù)(Antigenic Index, Al) 0利用現(xiàn)有的軟件，如GCG (Madison， Wisconsin, USA)及 DNAStar (Madison, Wisconsin, USA)從豬 HEV 的 0RF1、0RF2 和 0RF3 的蛋白中計(jì)算AI和輔助識別抗原區(qū)。根據(jù)豬HEV的0RF1、0RF2和0RF3的已知蛋白質(zhì)取得的氨基酸序列，再用計(jì)算機(jī)程序來估計(jì)它們的抗原區(qū)(Al)( 一般10到15個氨基酸)。一種豬戊型肝炎病毒抗原表位，其氨基酸序列如下Val-Glu-His-Asn-Pro-Lys-Arg-Leu-Glu-Ala-Ala-Tyr-Arg-Glu-Thr-Cys-Ser-A rg-Arg-Gly-Thr-Ala-Ala-Tyr-Pro-Leu-Leu-Gly-Ala-Gly-IIe-Tyr-Lys-Val-Pro-Val-Gl y-Leu-Ser-Phe-Asp-Ala-Trp-Glu-Arg-Asn-His-Arg-Pro—Gly-Asp-GlUo另一種豬戊型肝炎病毒抗原表位，其氨基酸序列如下Ser-Asp-Ser-Val-Leu-Thr-Phe-Glu-Leu-Thr-Asp-Ile-Val-His-Cys-Arg-Met-A Ia-Ala-Pro-Ser-Gln-Arg-Lys-Ala-Val-Leu-Ser-Thr-Leu-Val-Gly-Arg-Tyr-Gly-Arg-Ar g-Thr-Lys-Leu-Tyr-Glu-Ala-Ala-His-Ala-Asp-Val-Arg-Gly-Ser。另一種豬戊型肝炎病毒抗原表位，其氨基酸序列如下Pro-Arg-Gln-Pro-Ala-Arg-Pro-Leu-Gly-Ser-Ala-Trp-Arg-Asp-Gln-Ser-Gln-A rg-Pro-Ala-Ala-Ser-Thr-Arg-Arg-Arg-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly-Ala-Ser-Pro-Leu-Thr-Al a-Val-Ala-Pro-Ala-Pro-Asp-Thr-Ala-Pro-Val-Pro-Asp-Val-Asp-Ser-Arg-Gly-Ala-Ile -Leu-Arg-Arg-Gln-Tyr-Asn-Leu-Ser0另一種豬戊型肝炎病毒抗原表位，其氨基酸序列如下Pro-Val-Ser-Ile-Ser-Ala-Val-Gly-Val-Leu-Ala-Pro-His-Ser-Ala-Leu-Ala-I Ie-Leu-Glu-Asp-Thr-Ala-Asp-Tyr-Pro-Ala-Arg-Ala-His-Thr-Phe-Asp-Asp-Phe-Cys-Pr O-Glu-Cys-Arg-Ser-Leu-Gly-Leu-Gln-Gly-Cys ο通過分析，多月太 Leu-Gly-Ala-Thr-Ser-Pro-Ser-Ala-Pro-Pro-Leu-Pro-Pro-Val-Val-Asp-Leu、、多月太 Pro-Pro-Val-Val-Asp-Leu-Pro-Gln-Leu-Gly、多月太 Leu-Ala-Leu-Gly -Ser-Gln-Pro-Val-His-Ser-Ala-Pro-Leu-Gly-Ala-Thr-Ser-Pro-Ser-Ala-Pro-Pro-Leuλ 多肽 Pro-Gln-Leu-Gly-Leu-Arg-Arg 禾口多肽 Leu-Ala-Leu-Gly-Ser-Gln-Pro-Val-His-Se r-Ala-Pro-Leu-Gly-Ala-Thr-Ser-Pro-Ser-Ala-Pro-Pro-Leu-Pro-Pro-Val-Val-Asp-Leu 是豬戊型肝炎病毒抗原表位的重要組成部分，是抗體結(jié)合抗原識別表位不可或缺的重要組成部分，這些多肽可以單獨(dú)、一種多肽的N端與另一種多肽C端的連接或連接于其它多肽的 N端或C端，所述的這些多肽單獨(dú)或共同對豬戊型肝炎的體外檢測及免疫抗體的制備起到
重要作用。另一種豬戊型肝炎病毒抗原表位，其氨基酸序列如下Ser-Pro-Ser-Pro-Ser-Pro-IIe-Phe-IIe-Gln-Pro-Thr-Pro-Ser-His-Leu-Thr-P he-Gln-Pro-Gln-Pro-Gly-Leu-Glu-Leu-Ala-Leu-Gly-Ser-Gln-Pro-Val-His-Ser-Ala-Pr o-Leu-Gly-Ala-Thr-Ser-Pro-Ser-Ala-Pro-Pro-Leu-Pro-Pro-Val-Val-Asp-Leu-Pro-Gln -Leu-Gly0另一種豬戊型肝炎病毒抗原表位，其氨基酸序列如下Leu-Ala-Leu-Gly-Ser-Gln-Pro-Val-His-Ser-Ala-Pro-Leu-Gly-Ala-Thr-Ser-P ro_Ser_Ala_Pro_Pro_Leu_Pro_Pro_Val_Val_Asp_Leu_Pro_Gln_Leu_Gly_Leu_Arg_Arg0另一種豬戊型肝炎病毒抗原表位，其氨基酸序列如下Leu-Gly-Ala-Thr-Ser-Pro-Ser-Ala-Pro-Pro-Leu-Pro-Pro-Val-Val-Asp-Leu-P ro-Gln-Leu-Gly-Leu-Arg-Arg。另一種豬戊型肝炎病毒抗原表位，其氨基酸序列如下Leu-Ala-Leu-Gly-Ser-Gln-Pro-Val-His-Ser-Ala-Pro-Leu-Gly-Ala-Thr-Ser-P ro-Ser-Ala-Pro-Pro-LeUc上述多肽可以通過化學(xué)合成的方式完成?；瘜W(xué)合成采用Fmoc方法，通過固相合成技術(shù)合成。該方法的具體步驟參見Eur. J. Immunol. 1994，24，3188-3193 J. Org. Chem. 1972，37，3404-3409 ；黃惟德，陳常慶多肽合成，北京科學(xué)出版社，1985。上述多肽還可以通過與其它多肽或蛋白形成融合蛋白抗原，融合蛋白抗原可以通過基因工程方式制得，即通過目標(biāo)融合蛋白的DNA轉(zhuǎn)導(dǎo)/轉(zhuǎn)化至基因工程菌株，如大腸桿菌(E. coli)、酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)中表達(dá)并純化，或在中國倉鼠卵巢 (CHO)細(xì)胞、COS細(xì)胞、小倉鼠腎(BHK)細(xì)胞、小鼠骨髓瘤SP2/0細(xì)胞、小鼠NSO胸腺瘤細(xì)胞等哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)并純化后，得到將其中一種抗原C末端，經(jīng)由酰胺鍵(amide bond)和另一種抗原N末端首尾相連的融合蛋白產(chǎn)物(Protein Expr. Purif.，2008，59，189-196)。基因工程方法制備蛋白質(zhì)抗原的克隆、表達(dá)以及純化可通過多種方法進(jìn)行。具體方法參見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)，科學(xué)出版社，2002，第1217-1270頁。適宜的原核表達(dá)載體如PEGX系列原核表達(dá)載體(Amersham Pharmacia)、pET系列原核表達(dá)載體 (Novagen)等。特別優(yōu)選pGEX_4T_2載體。對于不同肽段融合的抗原，本領(lǐng)域眾所周知其構(gòu)建原則和方法。具體而言，為了不影響待融合肽段的各自的功能需要在不同肽段之間添加一個接頭。關(guān)于接頭的選擇具體可參見 Protein Eng.，2001，14，529-532。由上述多肽單獨(dú)或組合或融合而形成的抗原用于檢測應(yīng)答豬戊型肝炎病毒而產(chǎn)生的抗體。具體而言，這些多肽在豬戊型肝炎體外檢測中的應(yīng)用。檢測方法可以有多種，例如間接酶聯(lián)免疫測定技術(shù)、雙抗原夾心酶免疫測定技術(shù)、 金標(biāo)快速檢測技術(shù)、免疫滲濾檢測技術(shù)和蛋白芯片檢測技術(shù)等。間接酶聯(lián)免疫測定，即間接 ELISA是最常用的檢測方法。間接ELISA方法基本原理是多肽(抗原)包被在酶標(biāo)板表面，將稀釋后的待檢血清/血漿和對照物加入反應(yīng)板孔中，如果被檢血清/血漿中存在抗體，經(jīng)溫育后，則血清 /血漿中特異性抗體與反應(yīng)板孔中的抗原多肽結(jié)合，形成固相抗原-抗體復(fù)合物，洗去未結(jié)合的血清/血漿中其它成分，加入酶標(biāo)記的抗人IgG抗體，溫育，固相抗原(多肽)結(jié)合的抗體再與酶標(biāo)記的抗人IgG抗體結(jié)合，洗去未結(jié)合的酶標(biāo)記抗體成分，加入酶底物，并被催化成為有色產(chǎn)物，最后加入終止液終止反應(yīng)。根據(jù)對照物，可對抗體進(jìn)行定量或定性測定。上述多肽單獨(dú)或組合或融合而形成的抗原用于制備抗豬戊型肝炎病毒抗體。本發(fā)明技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的有益效果本發(fā)明通過計(jì)算機(jī)軟件篩選和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證得到了豬戊肝病毒的抗原表位。一方面可以將其單獨(dú)或組合應(yīng)用于快速特異豬戊肝診斷試劑盒，用于豬戊肝的快速診斷，特別是研制疫苗免疫抗體和自然隱性感染抗體的鑒別診斷技術(shù)用于豬戊肝流行的監(jiān)控；另一方面也可以設(shè)計(jì)特異、安全和高效的豬戊肝疫苗用于豬戊肝的預(yù)防、控制豬戊肝的流行和阻斷戊肝由豬向人傳播。
具體實(shí)施例方式以下詳細(xì)描述本發(fā)明的技術(shù)方案，本發(fā)明實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解， 可以對發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍， 其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍中。本發(fā)明所用的試劑若未明確指明，則均購自西格瑪-奧德里奇(Sigma-Aldrich)。實(shí)施例1豬戊肝病毒表面抗原利用計(jì)算機(jī)軟件從豬戊型肝炎病毒全基因組開放閱讀框0RF1、0RF2和0RF3的對應(yīng)蛋白中篩選識別表位。表位識別的主要依據(jù)是蛋白質(zhì)或多肽氨基酸序列的親水性、 表面度、柔韌度、Chou-Fasman的螺旋、片狀和轉(zhuǎn)角、Robson-Garnier的二級結(jié)構(gòu)及C-和 N-末端來預(yù)測抗原綜合數(shù)據(jù)(Antigenic Index, Al) 0利用現(xiàn)有的軟件，如GCG (Madison， Wisconsin, USA)及 DNAStar (Madison, Wisconsin, USA)從豬 HEV 的 ORFl、0RF2 和 0RF3 的蛋白中計(jì)算AI和輔助識別抗原區(qū)。根據(jù)豬HEV的0RF1、0RF2和0RF3的已知蛋白質(zhì)取得的氨基酸序列，再用計(jì)算機(jī)程序來估計(jì)它們的抗原區(qū)(Al)( 一般10到15個氨基酸)。進(jìn)過分析，分別從ORFl、0RF2和0RF3選定如下多肽ORFl swHEV-1:83-140Ala-Gly-Arg-Cys-Leu-Glu-Val-Gly-Ala-His-Pro-Arg-Ser-Ile-Asn-Asp-Asn-P ro-Asn-Val-Leu-His-Arg-Cys-Phe-Leu-Lys-Pro-Val-Gly-Arg-Asp-Val-Gln-Arg-Trp-Ty r-Thr-Ala-Pro-Thr-Arg-Gly-Pro-Ala-Ala-Asn-Cys-Arg-Arg-Ser-Ala-Leu-Arg-Gly-Leu -Pro-Pro,其相應(yīng)的DNA序列為swHEVn-1 :281-454ccgggcgctg tcttgaggtg ggtgcccacc cacgttctat taatgacaac cctaacgtcctgcatcgctg ctttcttaaa cctgttggcc gcgacgttca gcggtggtat accgctccta cccgtggccctgcagcaaat tgccggcggt ccgctctccg cgggcttcca cctg。
swHEV-2 :874-925Val-Glu-His-Asn-Pro-Lys-Arg-Leu-Glu-Ala-Ala-Tyr-Arg-Glu-Thr-Cys-Ser-A rg-Arg-Gly-Thr-Ala-Ala-Tyr-Pro-Leu-Leu-Gly-Ala-Gly-IIe-Tyr-Lys-Val-Pro-Val-Gl y-Leu-Ser-Phe-Asp-Ala-Trp-Glu-Arg-Asn-His-Arg-Pro-Gly-Asp-Glu,其相應(yīng)的DNA序列為swHEVn-2 :2654-2809t c g aa c a taaccccaaa cggctcgagg ccgcctatcg ggagacctgc tcccgacgggggacggctgc ttaccccctg ctcggtgccg gcatatataa ggtccctgtt gggttgagct ttgatgcctgggagcgtaac caccgacccg gggatgaat0swHEV-3 :1295-1346Ser-Asp-Ser-Val-Leu-Thr-Phe-Glu-Leu-Thr-Asp-Ile-Val-His-Cys-Arg-Met-A Ia-Ala-Pro-Ser-Gln-Arg-Lys-Ala-Val-Leu-Ser-Thr-Leu-Val-Gly-Arg-Tyr-Gly-Arg-Ar g-Thr-Lys-Leu-Tyr-Glu-Ala-Ala-His-Ala-Asp-Val-Arg-Gly-Ser,其相應(yīng)的DNA序列為swhevn-3 3917-4072atag tgtgctcact tttgagetea cggacatagt gcactgccgt atggcagcgc ccagccagcgcaaggcggtc ctgtcaactc ttgtcggcag gtacggccga cgtactaaat tgtacgaggc cgcacacgcagatgtccgcg gatctctgaa tc0swHEV-4 :1521-1582Glu-Ser-Leu-Arg-Gly-Phe-Trp-Lys-Lys-His-Ser-Gly-Glu-Pro-Gly-Thr-Leu-L eu-Trp-Asn-Thr-Val-Trp-Asn-Met-Ala-Val-IIe-Ala-His-Cys-Tyr-Glu-Phe-Arg-Asp-Le u-Lys-Val-Ala-Ala-Phe-Lys-Gly-Asp-Asp-Ser-Val-Val-Leu-Cys-Ser-Asp-Tyr-Arg-Gln -Ser-Arg-Asp-Ala-Ala-Ala,其相應(yīng)的DNA序列為swhevn-4 :4561-4746gttcgctctg cttgggttct acaggcaccg aaggagt c tc t gcgaggc tt ctggaagaaacactctggtg agcctggcac cctattatgg aataccgttt ggaacatggc tgtcatagca cactgttatgaattccgcga ccttaaggtt gcagcattca agggggacga ttctgttgtg etttge。0rf2 swHEV-5 :90-153Pro-Arg-Gln-Pro-Ala-Arg-Pro-Leu-Gly-Ser-Ala-Trp-Arg-Asp-Gln-Ser-Gln-A rg-Pro-Ala-Ala-Ser-Thr-Arg-Arg-Arg-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly-Ala-Ser-Pro-Leu-Thr-Al a-Val-Ala-Pro-Ala-Pro-Asp-Thr-Ala-Pro-Val-Pro-Asp-Val-Asp-Ser-Arg-Gly-Ala-IIe -Leu—Arg-Arg-Gln-Tyr-Asn-Leu—Ser，其相應(yīng)的DNA序列為swhevn-5 :5422-5607ctcggcagc cagcccgt cc act cggctcc gctt ggcgcg accagtccca gcgccccgccgcttccaccc gtcgtcgacc tgccccagct ggggcttcgc cgttgacggc tgtggctccg gctcctgacactgcacccgt ccctgatgtt gattcccgtg gcgctatctt gcgccgccag tataatt
swHEV-6 :433-476Ala-Gln-Gln-Asp-Lys-Gly-Ile-Ala-Ile-Pro-His-Asp-Ile-Asp-Leu-Gly-Glu-Ser-Arg-Val-Val-Ile-Gln-Asp-Tyr-Asp-Asn-Gln-His-Glu-Gln-Asp-Arg-Pro-Thr-Pro-Ser-Pro-Ala-Pro-Ser-Arg-Pro-Phe,其相應(yīng)的DNA序列為swhevn-6 :6451-6582ct cagcagga caagggt ata gctatt ccac atgatat t ga t ct cggt gag tcccgtgtggtcattcagga ttatgataat caacatgagc aagaccgccc caccccctct cctgctccct ctcgcccttt ttοswHEV-7 :606-653Pro-Val-Ser-Ile-Ser-Ala-Val-Gly-Val-Leu-Ala-Pro-His-Ser-Ala-Leu-Ala-I Ie-Leu-Glu-Asp-Thr-Ala-Asp-Tyr-Pro-Ala-Arg-Ala-His-Thr-Phe-Asp-Asp-Phe-Cys-Pr O-Glu-Cys-Arg-Ser-Leu-Gly-Leu-Gln-Gly-Cys,其相應(yīng)的DNA序列為swHEVn-7 :6970-7113c cgtgt ctatt tctgctgttg gtgtccttgc ccctcattct gcgct ggcta ttctggaggacaccgctgat taccctgctc gcgcccatac ttttgatgat ttctgccctg agtgccgttc actcggccttcagggttgtg ctt00RF3 swHEV-8 :22-58Cys-Pro-Arg-His-Arg-Pro-Val-Ser-Pro-Leu-Ala-Val-Ala-Ala-Gly-Gly-Ala-Ala-Ala-Val-Pro-Ala-Val-Val-Ser-Gly-Val-Thr-Gly-Leu-IIe-Leu-Ser-Pro-Ser-Pro-Ser，其相應(yīng)的DNA序列為swHEVn-8 :5246-5356gcccg cgccaccggc cggtcagccc tctggccgtc gccgcgggcg gcgcagcggcggtgccggca gtggtttctg gggtgaccgg gttgattctc agcccttcgc cctccc。swHEV-9 :55-112Ser-Pro-Ser-Pro-Ser-Pro-Ile-Phe-Ile-Gln-Pro-Thr-Pro-Ser-His-Leu-Thr-P he-Gln-Pro-Gln-Pro-Gly-Leu-Glu-Leu-Ala-Leu-Gly-Ser-Gln-Pro-Val-His-Ser-Ala-Pr o-Leu-Gly-Ala-Thr-Ser-Pro-Ser-Ala-Pro-Pro-Leu-Pro-Pro-Val-Val-Asp-Leu-Pro-Gln -Leu-Gly，其相應(yīng)的DNA序列為swHEVn-9 :5345-5518cttcgc cctcccctat attcatccaa ccaacccctt cgcatctgac attccagccg cagccggggctggagctcgc cctcggcagc cagcccgtcc actcggctcc gcttggcgcg accagtcccagcgccccgcc gcttccaccc gtcgtcgacc tgccccagct ggggcttc。swHEV-10 :79-114Leu-Ala-Leu-Gly-Ser-Gln-Pro-Val-His-Ser-Ala-Pro-Leu-Gly-Ala-Thr-Ser-Pro-Ser-Ala-Pro-Pro-Leu-Pro-Pro-Val-Val-Asp-Leu-Pro-Gln-Leu-Gly-Leu-Arg-Arg,其相應(yīng)的DNA序列為SwHEVn-IO :5417-5524tcgc cctcggcagc cagcccgtcc actcggctcc gcttggcgcg accagtccca gcgccccgccgcttccaccc gtcgtcgacc tgccccagct ggggcttcgc cgtt。swHEV-11 :91-114Leu-Gly-Ala-Thr-Ser-Pro-Ser-Ala-Pro-Pro-Leu-Pro-Pro-Val-Val-Asp-Leu-P ro-Gln-Leu-Gly-Leu-Arg-Arg,其相應(yīng)的DNA序列為Swhevn-ii :5453-5524ttggcgcg accagtccca gcgccccgcc gcttccaccc gtcgtcgacc tgccccagctggggcttcgc cgtt。SwHEV-I2 :79-101Leu-Ala-Leu-Gly-Ser-Gln-Pro-Val-His-Ser-Ala-Pro-Leu-Gly-Ala-Thr-Ser-P ro-Ser-Ala-Pro-Pro-Leu,其相應(yīng)的DNA序列為Swhevn-12 :5417-5485tcgc cctcggcagc cagcccgtcc actcggctcc gcttggcgcg accagtccca gcgccccgccgcttc。上述序列由GL-Biochem (shanghai) Ltd通過多肽合成儀合成后，再由HPLC純化得到純度大于95%的多肽。實(shí)施例2豬戊型肝炎病毒表位的篩選先用北京萬泰實(shí)業(yè)生物醫(yī)藥有限公司生產(chǎn)的豬HEV總抗體ELISA試劑盒對采集到的豬血清進(jìn)行進(jìn)行鑒定，篩選出豬HEV陽性血清和陰性血清。再用豬HEV陽性血清和陰性血清對實(shí)施例1得到的豬HEV多肽進(jìn)行ELISA鑒定， 篩選出豬HEV表位抗原。其具體步驟如下1.抗原稀釋取10 μ 1濃度為10mg/ml的多肽(將5mg合成的多肽溶解在0. 5ml 二甲基亞砜 (DMSO)而得)與90ul PBS液混勻，得到的抗原稀釋液溶度為1 μ g/ μ 1。再取15 μ 1抗原稀釋液與5ml包被液混勻，得到的抗原稀釋溶度為3 μ g/ml。在酶標(biāo)板上加入抗原稀釋溶度 100 μ 1/孔，4°C包被 12h。2.封閉吸去包被夜，每孔加入200μ 1封閉液于37°C封閉2h。封閉液是3%牛血清白蛋白 (BSA) /TBS 液。3.加一抗用PBST液洗板3次，每孔加100 μ 1 1% BSA/TBST液和10 μ 1血清，震蕩混勻，置 37°C溫育 Ih。4.加二抗用PBST液洗板5次，每孔加100 μ 1辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗豬IgG或IgM(均購自于 Immunology Consultants Laboratory, Inc. ,USA)稀釋液，置 37°C溫育 lh。 二抗用BSA/TBST液稀釋。5.顯色用PBST液洗板5次，每孔加底物液100ul，37度顯色lOmin。底物液是由IOml檸檬酸緩沖液，0. 4mlTMB和33 μ 1 3% H2O2配置而成的。6.終止每孔加50 μ 1 lmol/1 HCl的終止液來終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測OD值。當(dāng)(樣品OD 值/陰性對照OD值)> 2. 1為陽性，當(dāng)(樣品OD值/陰性對照OD值)< 2. 1為陰性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表一、表二和表三。所述試劑如下PBS 液(500ml, ρΗ7· 4) :0. 575g Na2HPO4 和 0. 114g NaH2PO4 加蒸餾水溶解，定容至 Λ 500ml ο包被液(1000ml,ρΗ9· 6) () :1. 59g Na2CO3 和 2. 93g NaHCO3 加蒸餾水溶解，定容至 Λ 1000ml。TBS 液(2000ml, ρΗ8· 6) :16g NaCl、0· 4g KCl 和 2. 42g Trizma-Base 加蒸溜水溶解，定容至入2000ml。TBST 液(1000ml，Tween-20 的濃度為 0· 1 % ) :1000ml TBS 液力Π 入 1. Oml Tween_20o檸檬酸緩沖液(100ml，pH3. 5-4. 0) :0. 84g檸檬酸和0. 294g檸檬酸鈉加蒸餾水溶解，定容至入100ml。
終止液(500ml, IM HCl) :40. 88ml濃鹽酸溶解于459. 12ml蒸餾水。 表一合成豬HEV多肽與豬HEV陽性血清盤的免疫反應(yīng)(對于IgG)
陽性參照數(shù)量
權(quán)利要求
1.一種豬戊型肝炎病毒抗原表位，其序列如SEQ ID No 5所示。
2.權(quán)利要求1所述的豬戊型肝炎病毒抗原表位在豬戊型肝炎體外診斷中的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求1所述的豬戊型肝炎病毒抗原表位在豬戊型肝炎疫苗制備中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種豬戊型肝炎病毒抗原表位及其應(yīng)用，所述豬戊型肝炎病毒抗原表位序列如SEQ ID No5所示。通過計(jì)算機(jī)軟件篩選和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證得到的豬戊肝病毒的抗原表位，一方面可以將其應(yīng)用于快速特異豬戊肝診斷試劑盒，用于豬戊肝的快速診斷，特別是研制疫苗免疫抗體和自然隱性感染抗體的鑒別診斷技術(shù)用于豬戊肝流行的監(jiān)控；另一方面也可以設(shè)計(jì)特異、安全和高效的豬戊肝疫苗用于豬戊肝的預(yù)防、控制豬戊肝的流行和阻斷戊肝由豬向人傳播。
文檔編號A61P1/16GK102268078SQ20111020837
公開日2011年12月7日 申請日期2009年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月1日
發(fā)明者于瑞嵩, 劉啟文, 吳蕭, 唐雪明, 朱宏, 李震, 王金斌, 譚芙蓉, 趙凱 申請人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院