專利名稱：：一種流感-大流行流感二價(jià)聯(lián)合疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，具體是涉及一種聯(lián)合疫苗及其制備方法，特別是指一種流感-大流行流感聯(lián)合疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
：流行性感冒簡(jiǎn)稱流感，是由甲、乙、丙三個(gè)型的流感病毒(influenzavirus)分別引起的急性呼吸道傳染病。甲型流感的流行通常會(huì)引起世界性的流感大流行，并能在家畜和家禽中引起流感流行；乙型常會(huì)引起流感局部爆發(fā)，但不引起世界性流感大流行；丙型以散發(fā)病例形式出現(xiàn)，主要侵襲嬰幼兒，一般不引起流感流行。流感在流行病學(xué)上的特點(diǎn)是突然爆發(fā)，迅速蔓延，波及面廣，發(fā)病率高，在年邁體衰和慢性病患者中死亡率較高。其流行具有一定的季節(jié)性，在溫、寒帶地區(qū)，通常在冬春季流行，但在熱帶和亞熱帶地區(qū)，則任何季節(jié)都可流行。流感患者是流感的主要傳染源，人感染后的潛伏期為13天，從潛伏期末到發(fā)病的急性期(約7天)都有傳染性。嬰幼兒和年老者常易從單純型轉(zhuǎn)為肺炎型，少數(shù)則損害全身血液系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)，出現(xiàn)腦炎癥狀而呈中毒型。近百年已經(jīng)出現(xiàn)了5次世界性流感大流行，給人類造成了大量人員死亡與財(cái)產(chǎn)損失。我國(guó)用于預(yù)防流感的三種疫苗均為滅活疫苗，均含有流行的甲l、甲3及乙型3種流感病毒抗原成分；三種滅活疫苗分別為全病毒滅活苗、裂解疫苗和亞單位疫苗。禽流感(AvianinfluenzaAI)是由甲型動(dòng)物流感病毒引起的一種嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)的高度傳染性、致死性疾病。自1997年起，一種新的H5N1亞型高致病性禽流感病毒在全世界范圍內(nèi)蔓延，并且突破種間屏障向人類傳播。截至2007年5月26日，全世界確診的H5N1亞型禽流感感染人數(shù)已達(dá)307人，死亡186人，死亡率高達(dá)60.6%。雖然目前尚無(wú)證據(jù)表明這種病毒獲得了"人傳人"的能力，但近年來(lái)禽4類H5N1亞型流感在全球范圍內(nèi)的不斷爆發(fā)，使用高致病性禽流感病毒與人流感病毒重組的空間空前加大，一旦這種病毒發(fā)生變異、重組而獲得人與人之間傳播的能力，將會(huì)引起人禽流感大流行，屆時(shí)將導(dǎo)致上千萬(wàn)人死亡。人禽流感已成為人類潛在威脅之一。目前禽流感病毒跨種傳播的機(jī)制還不十分清楚，但由于高致病性禽流感具有較高的死亡率，臨床上治愈可能性比較小，而人體對(duì)這種新的病毒又不具有免疫力，所以一旦這種病毒獲得了人與人之間傳播的能力，將引發(fā)一場(chǎng)流感的大流行，世界衛(wèi)生組織專家警告，這將比SARS更可怕，可能會(huì)導(dǎo)致上千萬(wàn)人死亡。高致病性禽流感己成為世界性公共衛(wèi)生問(wèn)題。我國(guó)現(xiàn)廣泛使用的是稱為大流行流感疫苗的含H5N1型禽流感病毒的裂解禽流感疫苗來(lái)對(duì)禽流感進(jìn)行預(yù)防。含有兩種或兩種以上抗原、可以預(yù)防兩種或兩種以上疾病的聯(lián)合疫苗的研究一直為眾學(xué)者所關(guān)注，并以其方便、高效、低成本為新一代疫苗研究的熱點(diǎn)，與單一疫苗相比，聯(lián)合疫苗可減少疫苗接種次數(shù)，避免因漏種而不能得到全程免疫；另外，疫苗大多不耐熱，其生產(chǎn)、運(yùn)輸、儲(chǔ)存、銷售乃至全部使用過(guò)程均需在較低溫度下進(jìn)行，采用單一疫苗形式生產(chǎn)，由于各個(gè)生產(chǎn)環(huán)節(jié)環(huán)環(huán)相扣的冷鏈運(yùn)作，費(fèi)用極高。此外，目前同為流感病毒感染的流感和禽流感聯(lián)合疫苗還未見任何報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的第一個(gè)目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點(diǎn)和不足，而提供一種方便、多效、低成本并能有效預(yù)防流感和大流行流感的流感-大流行流感二價(jià)聯(lián)合疫苗。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種能高效且低成本地大量制備流感-大流行流感二價(jià)聯(lián)合疫苗的制備方法。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的第一個(gè)目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是，該流感-大流行流感二價(jià)聯(lián)合疫苗包括有流感免疫抗原和禽流感免疫抗原以及疫苗佐劑。進(jìn)一步設(shè)置是所述的流感免疫抗原為含有H1N1、H3N2、B型的血凝素，其HA含量20-40"g/ml，大流行流感免疫原HA的含量為30-60ug/ml。進(jìn)一步設(shè)置是所述的流感免疫抗原為流感全病毒滅活液或流感病毒裂解液或提取的流感病毒亞單位抗原。進(jìn)一步設(shè)置是其流感免疫抗原生產(chǎn)所用流感病毒株為當(dāng)年WHO推薦流感病毒株或相似株。進(jìn)一步設(shè)置是所述的禽流感免疫原為用禽流感病毒株制備的禽流感病毒裂解液。所述的禽流感病毒株為NIBRG-14。進(jìn)一步設(shè)置是所述的疫苗佐劑為甘油或氫氧化鋁。該類佐劑為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，易于獲得和制備。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的第二個(gè)目的，本發(fā)明的技術(shù)方案包括有以下步驟，(1)、制備流感疫苗原液，選用當(dāng)年WHO推薦甲l、甲3及乙型病毒株制備流感疫苗原液；(2)、制備大流行流感病毒裂解疫苗原液，該大流行流感病毒裂解疫苗原液選用禽流感病毒株NIBRG-14為病毒種；(3)、將步驟(1)和(2)中制備的兩種疫苗抗原原液混合后，用0.01mol/L、PH6.8-7.2的PBS溶液稀釋，使H1N1、H3N2、B型的血凝素終濃度為20-40ixg/ml，禽流感免疫原的HA為30-60ug/ml。進(jìn)一步設(shè)置是所述的流感疫苗原液為流感全病毒滅活液或流感病毒裂解液或提取的流感病毒亞單位抗原。聯(lián)合疫苗的免疫效力比較試驗(yàn)文獻(xiàn)表明，交叉血凝抑制試驗(yàn)和交叉單向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)證明各型血清僅與同型抗原有較高的血抑滴度或有反應(yīng)，與其他型別抗原反應(yīng)弱或無(wú)反應(yīng)。所以在注射了流感和禽流感聯(lián)合疫苗的動(dòng)物體內(nèi)分別檢測(cè)禽流感和流感抗體基本無(wú)互相影響，結(jié)果是可信的。采用未檢出禽流感和流感病毒的血抑抗體和中和抗體的清潔級(jí)昆明小鼠，體重1012g，采用不同稀釋度的本發(fā)明所述聯(lián)合疫苗、單獨(dú)的大流行流感疫苗和流感疫苗經(jīng)肌肉注射免疫小鼠，聯(lián)合疫苗中注射劑A組含禽流感病毒血凝素3ug和流感病毒血凝素2ug，注射劑B組含禽流感病毒血凝素6ug和流感病毒血凝素4ug，單獨(dú)的大流行流感疫苗含禽流感病毒血凝素3ug和6ug，流感疫苗含流感病毒血凝素2ug和4ug，每組45只，14天后加強(qiáng)一針，并分別于初免當(dāng)天、加強(qiáng)免疫當(dāng)天及加強(qiáng)免疫后14天采血分離血清，檢測(cè)血清中禽流感中和抗體和流感血凝抑制抗體滴度。血凝抑制抗體滴度采用常規(guī)方法。中和抗體測(cè)定采用在雞胚中測(cè)定中和抗體，固定病毒，稀釋血清，等量混合，于37。C中和90min后，每只雞胚接種100EID50/0.5ml，計(jì)算各劑量接種小鼠的抗體幾何平均滴度。表l小鼠免疫后的禽流感血清抗體滴度(l:x)劑聯(lián)合疫苗大流行流感疫苗流感疫苗抗體量A組B組3ug6ug2ug4ug1中和抗體----2中和抗體20402040表2小鼠免疫后的流感病毒血清血凝抗體滴度(l:x)聯(lián)合疫苗大流行流感疫苗流感疫苗抗體A組B組3ug6ug2ug4ugAl11211869--12692156中和A3331522--378536抗體B6498--68128從表1中可看出，小鼠接種一針聯(lián)合疫苗和大流感疫苗14天后，禽流感的中和抗體滴度非常低；進(jìn)行了第二針接種14天后，中和抗體滴度都有明顯升高，且可看出只經(jīng)流感免疫的小鼠都不能檢測(cè)出明顯的禽流感中和抗體滴度。數(shù)據(jù)顯示本發(fā)明提供的流感-大流行流感二價(jià)聯(lián)合疫苗和單獨(dú)大流行流感疫苗均能誘發(fā)小鼠產(chǎn)生有效的禽流感抗體。表2中所示的數(shù)據(jù)表明，小鼠接種了本發(fā)明提供的流感-大流行流感二價(jià)聯(lián)合疫苗和單獨(dú)流感疫苗后，其流感中和抗體滴度均能達(dá)到有效數(shù)值，表明聯(lián)合疫苗和單獨(dú)大流行流感疫苗均能誘發(fā)小鼠產(chǎn)生有效的流感抗體。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)1、通過(guò)上述聯(lián)合疫苗的免疫效力比較試驗(yàn)表明，本發(fā)明提供的的流感-大流行流感二價(jià)聯(lián)合疫苗可以有效地預(yù)防流感和大流行流感。2、與單一疫苗相比，本發(fā)明提供的流感-大流行流感二價(jià)聯(lián)合疫苗可以減少疫苗接種次數(shù)，避免因漏種而不能得到全程免疫；此外疫苗大多不耐熱，其生產(chǎn)、運(yùn)輸、儲(chǔ)存、銷售乃至全部使用過(guò)程均需在較低溫度下進(jìn)行，而本發(fā)明提供的聯(lián)合疫苗形式生產(chǎn)，則可以大大降低疫苗成本和市場(chǎng)價(jià)格，具有顯著的經(jīng)濟(jì)效益，且有利于疫苗的推廣保護(hù)受眾的健康。具體實(shí)施例方式本發(fā)明所涉及的口服流感-大流行流感聯(lián)合疫苗其制備流程如下(1)流感和禽流感疫苗種子庫(kù)的制備和其它各種劑型的流感疫苗一樣，要建立原代、主代、工作代三級(jí)種子庫(kù)，三級(jí)種子庫(kù)須經(jīng)檢定:血凝滴度、病毒滴度、無(wú)菌試驗(yàn)，支原體、鑒別試驗(yàn)、外源因子(禽腺病毒、白血病毒檢測(cè))等項(xiàng)目。(2)流感和禽流感病毒液的制備工作種子接種雞胚，經(jīng)培養(yǎng)、收獲病毒液、澄清過(guò)濾、純化處理后滅活，制成全病毒液，須經(jīng)檢定血凝含量、無(wú)菌試驗(yàn)，滅活試驗(yàn)、鑒別試驗(yàn)等項(xiàng)目。之后分別按流感和禽流感裂解或亞單位疫苗原液制備方法進(jìn)行制備。(3)聯(lián)合疫苗制備將兩種疫苗原液按比例混合稀釋。本發(fā)明中采用的甲l、甲3及乙型三種流感病毒株均為WHO專家推薦毒種，禽流感病毒株為NIBRG-14，來(lái)自英國(guó)國(guó)家生物制品檢定所，系用A/Vietnam/1194/2004(H5N1)(簡(jiǎn)稱1194株)和PR8株(H1N1)病毒通過(guò)重配得到，按《生物制品生產(chǎn)檢定用菌毒種管理規(guī)程》建立疫苗種子庫(kù)并進(jìn)行檢定后備生產(chǎn)使用。本發(fā)明所涉及流感病毒疫苗原液的制備方法分為三種。第一種為流感全病毒滅活疫苗，其制備方法為將單價(jià)流感病毒接種于9-11日齡雞胚尿囊腔中，置33'C-35'C培育48-72h，篩選活胚置2°。-8°。冷卻一定時(shí)間收獲尿囊液，合并后加e-丙內(nèi)酯置2'C-8'C滅活，將己滅活單價(jià)病毒合并液進(jìn)行超濾濃縮，濃縮液再應(yīng)用柱層析法純化，最后經(jīng)濾膜除菌過(guò)濾，制成單價(jià)病毒原液。第二種為裂解疫苗，其病毒培養(yǎng)方法與全病毒滅活疫苗相同，將收獲的尿囊液病毒經(jīng)澄清和透析(去尿酸鹽)，再經(jīng)超濾濃縮和柱層析或超速區(qū)帶離心純化病毒后，使用裂解劑TritonX-lOO使病毒裂解，再經(jīng)純化、濃縮和透析，P-丙內(nèi)酯置2'C-8'C滅活后，除菌過(guò)濾制成疫苗原液，該疫苗原液去除了病毒脂質(zhì)體成分，保留病毒HA、NA和內(nèi)部抗原。第三種亞單位疫苗的病毒培養(yǎng)方法也與全病毒滅活疫苗相同，在裂解疫苗基礎(chǔ)上，提取病毒亞單位(HA、NA),主要工藝包括病毒滅活、病毒裂解和有效抗原(亞單位)純化三個(gè)過(guò)程，這種疫苗原液只含有高度純化的流感病毒表面抗原(HA、NA)，完全去除病毒脂質(zhì)體和內(nèi)部抗原。本發(fā)明中大流行流感疫苗只涉及裂解苗一種，其原液制備方法與流感裂解苗一致。大流行流感裂解疫苗原液生產(chǎn)用毒種為NIBRG-14(簡(jiǎn)稱R1194株)，來(lái)自英國(guó)國(guó)家生物制品檢定所。禽流感病毒接種于9-11日齡雞胚尿囊腔中，置33'C-35t:培育48-72h，篩選活胚置2x:-8r冷卻一定時(shí)間收獲尿囊液，將收獲的尿囊液病毒經(jīng)澄清和透析(去尿酸鹽)，再經(jīng)超濾濃縮和柱層析或超速區(qū)帶離心純化病毒后，使用裂解劑TritonX-100使病毒裂解，再經(jīng)純化、濃縮和透析，P-丙內(nèi)酯置2'C-8"C滅活后，除菌過(guò)濾制成大流行流感疫苗原液。將制備好的流感疫苗原液，包括流感全病毒滅活液，或流感病毒裂解液，或提取的流感病毒亞單位抗原按比例與大流行流感裂解疫苗原液混合，用O.Olmol/LPBS(PH6.8-7.2)溶液稀釋，使H1N1、H3N2、B型的血凝素終濃度為20-40ug/ml，禽流感免疫原的含量為30-60Ug/ml;即為制成的流感-大流行流感聯(lián)合疫苗注射針劑。優(yōu)選實(shí)施例本實(shí)施例流感疫苗原液選用流感全病毒滅活疫苗原液，該流感全病毒滅活疫苗原液生產(chǎn)用毒種為H1N1型IVR-148株、H3N2型為NYMCX-175C株、以及B型B/Florida/4/2006株。選擇健康雞群的911日齡無(wú)畸形、血管清晰、活動(dòng)的雞胚。3-41gEID5Q、0.2ml接種，33"C培養(yǎng)4872h。之后篩選活胚置2'C-8"C冷卻后收獲尿囊液和羊水，合并后加P-丙內(nèi)酯(終濃度l:4000)置2。C-8。C，24-48h滅活病毒，之后37'C水解2h，得疫苗原液。用截留50萬(wàn)分子量的超濾器濃縮成20倍濃縮疫苗液，之后用8倍體積的0.01mol/LPBS(PH7.2)進(jìn)行衡濾。濃縮疫苗液經(jīng)Sepharose4FF凝膠柱層析或超速區(qū)帶離心純化后，得到純化流感全病毒滅活疫苗原液。當(dāng)然本發(fā)明所用的流感疫苗原液也可以選用流感病毒裂解液或提取的流感病毒亞單位，適應(yīng)不同的年齡群體。流感裂解疫苗原液生產(chǎn)用毒種為H1N1型IVR-148株、H3N2型NYMCX-175C株、以及B型B/Florida/4/2006株。選擇健康雞群的911日齡無(wú)畸形、血管清晰、活動(dòng)的雞胚。3-41gEID50、0.2ml接種，33。C培養(yǎng)4872h。之后篩選活胚置2i:-8"C冷卻后收獲尿囊液和羊水，將收獲的尿囊液病毒經(jīng)澄清和透析(去尿酸鹽)，再經(jīng)截留50萬(wàn)分子量的超濾器濃縮成20倍濃縮疫苗液后，使用凝膠過(guò)濾柱Sepharose4FF或超速區(qū)帶離心純化病毒后，再使用0.5y。的TritonX-100為裂解劑室溫放置2小時(shí)使病毒裂解，再經(jīng)10萬(wàn)分子量的超濾器超濾，采用的超濾緩沖液為8倍體積的0.01mol/LPBS(PH7.2)來(lái)去除TritonX-100;加入P-丙內(nèi)酯(終濃度l:4000)置2。C-8。C，24-48h滅活病毒，之后37。C水解2h，最后0.22um孔徑濾器除菌過(guò)濾后得裂解疫苗液。大流行流感裂解疫苗原液生產(chǎn)用毒種為NIBRG-14(簡(jiǎn)稱10Rl194株),來(lái)自英國(guó)國(guó)家生物制品檢定所。選擇健康雞群的911日齡無(wú)畸形、血管清晰、活動(dòng)的雞胚。3-41gEID5()、0.2ml接種，33。C培養(yǎng)4872h。之后篩選活胚置2-C-8"C冷卻后收獲尿囊液和羊水，將收獲的尿囊液病毒經(jīng)澄清和透析(去尿酸鹽)，再經(jīng)截留50萬(wàn)分子量的超濾器濃縮成20倍濃縮疫苗液后，使用凝膠過(guò)濾柱Sepharose4FF或超速區(qū)帶離心純化病毒后，再使用0.5。/。的TritonX-100為裂解劑室溫放置2小時(shí)使病毒裂解，再經(jīng)10萬(wàn)分子量的超濾器超濾，采用的超濾緩沖液為8倍體積的0.01mol/LPBS(PH7.2)去除TritonX-100;加入P-丙內(nèi)酯(終濃度l:4000)置2"C-8""C，24-48h滅活病毒，之后37"C水解2h，最后0.22um孔徑濾器除菌過(guò)濾后得大流行流感裂解疫苗原液。擇一選擇上述一種流感疫苗原液與上述制備的大流行流感疫苗原液用0.01mol/LPBS(PH6.8-7.2)溶液稀釋。稀釋后最終使流感H1N1、H3N2、B型三型的血凝素分別達(dá)到20-40Ug/ml，禽流感HA抗原量為30-60iig/ml，即為流感-大流行流感二價(jià)聯(lián)合疫苗。本實(shí)施例制備的流感-大流行流感二價(jià)聯(lián)合疫苗免疫原性實(shí)驗(yàn)將如本實(shí)施例制備的聯(lián)合疫苗，按照0.5-1.0ml劑量通過(guò)腹腔注射接種小鼠，進(jìn)行疫苗的安全性、免疫原性和有效性試驗(yàn)。結(jié)果接種疫苗組與未接種疫苗組的動(dòng)物，經(jīng)觀察均無(wú)臨床癥狀，其排泄物未檢測(cè)道流感病毒和禽流感病毒，組織器官也無(wú)病理改變，動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果初步驗(yàn)證了滅活疫苗的安全性。疫苗接種后IO、15、30天采血，采用常規(guī)EIA法檢測(cè)禽流感病毒IgG抗體及常規(guī)細(xì)胞中和試驗(yàn)法、血凝抑制法檢測(cè)保護(hù)性中和抗體，其結(jié)果IgG總抗體10天均已陽(yáng)轉(zhuǎn)，表明該疫苗具有良好的免疫原性，結(jié)果見表3。表3聯(lián)合疫苗免疫接種后IO、15、30天兩種抗原IgG總抗體檢測(cè)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>1+++2+++3+++4+++5+++用10、15、30天免疫血清與禽流感毒株中和后進(jìn)行細(xì)胞中和試驗(yàn)，結(jié)果證實(shí)其免疫血清對(duì)禽流感毒株有良好的中和作用，其中和抗體效價(jià)平均可達(dá)l:16-1:32，即疫苗的有效性得以初步證實(shí)，結(jié)果見表4。表4聯(lián)合疫苗免疫接種IO、15、30天禽流感病毒中和抗體檢測(cè)結(jié)果鼠號(hào)免疫后不同時(shí)間中和抗體效價(jià)(細(xì)胞中和試驗(yàn))IO天15天30天11:161:16-321:3221:16h161:16-3231:16h161:3241:16h161:3251:161:16h32聯(lián)合疫苗免疫接種小鼠30天后小鼠較對(duì)照疫苗抗體增長(zhǎng)倍數(shù)大于4倍，見表5。表5聯(lián)合疫苗免疫接種30天后流感病毒中和抗體檢測(cè)結(jié)果鼠號(hào)免疫后不同時(shí)間中和抗體效價(jià)(血凝抑制)H1N1H3N2B11:21561:5361:12821:18691:5221:981231:1329h3781:6541:11211:3311:6451:1269h317h68動(dòng)物預(yù)試驗(yàn)結(jié)果基本證實(shí)，按本發(fā)明所述制備的聯(lián)合疫苗，不僅具有良好的安全性和免疫原性，中和試驗(yàn)結(jié)果又進(jìn)一步證實(shí)了按本發(fā)明所述制備的聯(lián)合疫苗的有效性。權(quán)利要求1.一種流感-大流行流感二價(jià)聯(lián)合疫苗，其特征在于包括有流感免疫抗原和大流行流感免疫抗原以及疫苗佐劑。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的流感-大流行流感二價(jià)聯(lián)合疫苗，其特征在于所述的流感免疫抗原為含有H1N1、H3N2、B型的血凝素，其含量為20-40ug/ml，大流行流感免疫原HA含量為30-60ug/ml。3.根據(jù)權(quán)利要求l或2所述的流感-大流行流感二價(jià)聯(lián)合疫苗，其特征在于所述的流感免疫抗原為流感全病毒滅活液或流感病毒裂解液或提取的流感病毒亞單位抗原。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的流感-大流行流感二價(jià)聯(lián)合疫苗，其特征在于其流感免疫抗原生產(chǎn)所用流感病毒株為當(dāng)年WHO推薦流感病毒株或相似株。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的流感-大流行流感二價(jià)聯(lián)合疫苗，其特征在于所述的禽流感免疫原為用大流行流感病毒株制備的大流行流感流感病毒裂解液。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的流感-大流行流感二價(jià)聯(lián)合疫苗，其特征在于所述的大流行流感病毒株為NIBRG-14。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的流感-大流行流感二價(jià)聯(lián)合疫苗，其特征在于所述的疫苗佐劑為甘油或氫氧化鋁。8.根據(jù)權(quán)利要求l或2所述的流感-大流行流感二價(jià)聯(lián)合疫苗，其特征在于所述的疫苗佐劑為甘油或氫氧化鋁。9.一種流感-大流行流感二價(jià)聯(lián)合疫苗的制備方法，其特征在于包括有以下步驟.-(1)、制備流感疫苗原液，選用當(dāng)年WHO推薦甲l、甲3及乙型病毒株制備流感疫苗原液；(2)、制備大流行流感病毒裂解疫苗原液，該大流行流感病毒裂解疫苗原液選用大流行流感病毒株NIBRG-14為病毒種；(3)、將步驟(1)和(2)中制備的兩種疫苗抗原原液混合后，用0.01mol/L、PH6.8-7.2的PBS溶液稀釋，使H1N1、H3N2、B型的血凝素終濃度為20-40ug/ml，禽流感免疫原的HA為30-60ug/ml。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的流感-大流行流感二價(jià)聯(lián)合疫苗的制備方法，其特征在于所述的流感疫苗原液為流感全病毒滅活液或流感病毒裂解液或提取的流感病毒亞單位抗原。全文摘要本發(fā)明提供了一種能大量生產(chǎn)制備高效且低成本的流感-大流行流感二價(jià)聯(lián)合疫苗及其制備方法，包括流感全病毒滅活疫苗、裂解疫苗、亞單位疫苗和大流行流感裂解疫苗的制備方法，并涉及一種新型流感-大流行流感注射用疫苗制劑及其制備工藝，包括毒種庫(kù)的制備，疫苗原液生產(chǎn)與制備。本發(fā)明提供的流感-大流行流感二價(jià)聯(lián)合疫苗制劑包含流感和禽流感兩種抗原，可同時(shí)方便的預(yù)防流感和禽流感兩種病毒性傳染病，防止兩種病的暴發(fā)流行。文檔編號(hào)A61K39/145GK101524538SQ20091010351公開日2009年9月9日申請(qǐng)日期2009年3月26日優(yōu)先權(quán)日2009年3月26日發(fā)明者朱文漓,李聲友申請(qǐng)人:成都康華生物制品有限公司